PRINSIP DASAR DAN CARA KERJA PEMURNIAN P
PRINSIP DASAR DAN CARA KERJA PEMURNIAN PROTEIN
DENGAN MENGGUNAKAN METODE ULTRACENTRIFUGATION
MAKALAH
Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Biokimia Umum
(KI3061)
oleh:
Duma Doniagara Sambora
11215031
PROGRAM STUDI REKAYASA HAYATI
SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
JATINANGOR
2017
2
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI...............................................................................................................................ii
DAFTAR GAMBAR.................................................................................................................iii
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ...................................................................................................1
1.2 Tujuan Percobaan ...............................................................................................2
1.3 Manfaat ...............................................................................................................2
BAB II ISI
2.1 Prinsip Ultrasentrifugasi....................................................................................3
2.2 Konsep Dasar Ultrasentrifugasi.........................................................................3
2.3 Teknik Percobaan..............................................................................................6
BAB III PENUTUP........................................................................................................
3.1 Kesimpulan ........................................................................................................9
DAFTAR PUSTAKA................................................................................................................10
3
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Sentrifugasi Diferensial ................................................................................................ 4
Gambar 2. Medium dengan gradien densitas kontinyu dan diskontinyu.........................................5
Gambar 3. Fraksinasi dan pemisahan protein hasil sentrifugasi......................................................7
Gambar 4. Contoh hasil pengujian pemisahan campuran protein dengan
elektroforesis.......................................................................................................8
4
BAB I
PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
Dalam industri-industri biokimia, seringkali pekerjaan menggunakan
protein menjadi hal yang sangat umum. Protein-protein yang digunakan dapat
berbagai macam dan beragam fungsinya, seperti enzim sebagai biokatalisator,
hormon-hormon yang merupakan strukutur protein regulator, protein-protein
nutrient, protein struktur dan lain sebagainya.
Penggunaan protein seringkali tidak dapat langsung dilakukan hanya
dengan menggunakan ekstraksi dari sumber protein yang digunakan karena
protein-protein tersebut masih berupa campuran dari berbagai macam protein serta
pengotor lain yang terkandung dalam larutan ekstrak, sehingga pemurnian protein
diperlukan untuk memisahkan protein-protein tertentu dari protein jenis lain.
Dengan melakukan pemurnian suatu jenis protein, nilai jual dari suatu protein
murni akan menjadi tinggi dalam suatu industri sering juga protein murni
dibutuhkan dalam suatu penelitian tertentu yang membutuhkan protein murni
dalam prosesnya.
Dalam bidang rekayasa hayati (Bioengineering), pemurnian protein juga
dapat menjadi hal yang sangat penting, karena rekayasa hayati erat kaitannya
dengan bio-industri. Protein murni akan sangat dibutuhkan untuk suatu produkproduk yang akan dijual secara komersil dengan memiliki nilai jual yang lebih
tinggi dibandingkan dengan protein campuran karena memiliki spesifisitas. Selain
itu enzim juga merupakan hal yang sangat penting dalam bidang rekayasa hayati,
karena enzim yang murni akan sering digunakan dalam jalur metabolisme suatu
produk metabolit yang diinginkan. Dengan alasan-alasan tersebut, maka
dibutuhkan pengetahuan mengenai cara pemisahan dan pemurnian protein, dalam
hal ini dengan menggunakan metode ultrasentrifugasi.
1
1.2 Tujuan
Menentukan
prinsip
dasar
pemurnian
protein
dengan
metode
ultrasentrifugasi.
Menentukan teori dasar sentrifugasi.
Menentukan teknik percobaan pemurnian protein dengan metode
ultrasentrifugasi.
1.3 Manfaat
Manfaat yang dapat diperoleh dari makalah ini diantaranya :
Mengetahui metode lain dalam pemurnian dalam proses-proses biokimia
yang melibatkan protein.
Dalam bidang rekayasa hayati, dapat diaplikasikan untuk proses-proses
yang melibatkan penggunaan protein seperti enzim.
Dalam bioindustri, dapat diaplikasikan untuk produksi jenis protein-protein
tertentu yang bernilai tinggi.
2
BAB II
ISI
2.1
Prinsip Ultrasentrifugasi
Prinsip
dasar
pemurnian
protein
dengan
menggunakan
metode
ultrasentrifugasi adalah memisahkan partikel-partikel protein yang berbeda
dengan memanfaatkan perbedaan berat atau densitas molekul-molekul yang
terkandung dalam larutan. Dalam metode ultrasentrifugasi, proses pemisahan
molekul-molekul protein berdasarkan berat dan densitas yang berbeda
menggunakan insturmen yang bekerja untuk memutar secara rotasi larutan
campuran protein dalam suatu wadah dengan kecepatan tinggi agar gaya
sentrifugasi bekerja pada larutan sehingga komponen protein dengan
terfraksinasi, sehingga
protein-protein yang diinginkan terpisah dengan
komponen lainnya.
Gaya sentrifugasi yang bekerja pada partikel-partikel akan tergantung pada
densitas atau massa dari partikel-partikel tersebut. partikel yang memiliki massa
yang lebih besar akan mempunyai gaya sentrifugasi lebih besar dibandingkan
dengan gaya sentrifugasi yang bekerja pada partikel dengan massa yang lebih
kecil, sehingga partikel yang lebih besar akan mengimbangi gaya hambat dari
larutan (drag force) yang menyebabkan partikel-partikel dengan massa yang
lebih besar akan berada pada dasar wadah setelah proses sentrifugasi dilakukan.
Sedangkan partikel dengan massa yang relatif lebih kecil akan berada pada
bagian atasnya (Voelkl, 2016).
2.2
Konsep dasar metode ultrasentifugasi
Untuk mempersiapkan proses sentrifugasi terdapat dua tahap yang
dilakukan, yaitu sentrifugasi diferensial dan densitas gradien sentrifugasi.
3
2.2.1 Sentrifugasi diferensial
Sentrifugasi diferensial pada dasarnya memisahkan partikel-partikel
berdasarkan bentuk dan ukurannya. Partikel-partikel berbeda pada awalnya
bercampur dalam larutan buffer untuk menjaga protein pada pH optimalnya
agar tidak terjadi denaturasi. Campuran kemudian dipisahkan menjadi dua
fraksi yaitu; pellet, bagian yang mengandung sedimentasi partikel dan
supernatan yang terdiri dari partikel tidak tersedimentasi dalam larutan buffer.
Gambar 1 : Sentifugasi diferensial
Seperti yang diilustrasikan pada gambar, komponen-komponen partikel akan
terdistribusi secara berbeda menjadi pellet dan supernatan selama proses
sentrifugasi, berdasarkan pada ukuran. Partikel yang mempunyai ukuran yang
lebih besar akan cenderung untuk diendapkan pada bagian dasar (partikel
berwarna putih). Sedangkan untuk partikel dengan ukuran yang lebih kecil
cenderung akan berada pada supernatan (partikel titik hitam). Untuk pemisahan
yang lebih baik, supernatant yang terbentuk dapat dipisahkan dan dilakukan
sentrifugasi lagi dengan laju perputaran sentrifugasi yang lebih tinggi. Sementara
4
pellet dapat di endapkan ulang dan sentrifugasi ulang untuk memisahkannya dari
kontaminan (dicuci).
2.2.2
Sentrifugasi dengan gradien densitas
Pada tahapan sebelumnya, pemurnian protein tidak dapat secara murni
diselesaikan karena ada partikel lain yang mungkin saja menjadi pengotor dalam
endapan. Untuk mendapatkan protein yang benar-benar murni, dibutuhkan
langkah untuk menghilangkan partikel kontaminan tersebut, yaitu dengan teknik
yang dinamakan sentrifugasi gradient densitas. Alasan dilakukannya tahapan ini
adalah
untuk
memisahkan
partikel-partikel
yang
berbeda
densitasnya
menggunakan suatu medium dalam tabung yang mempunyai densitas berbeda,
tidak seperti pada tahapan sebelumnya yang menggunaka densitas medium yang
homogen.
Pada dasarnya densitas medium yang digunakan dapat ditingkatkan secara
kontinyu atau diskontinyu (diskrit). Tujuannya agar pada masing-masing densitas
medium yang berbeda dapat diendapkan partikel-partikel tertentu dengan densitas
yang telah disesuaikan dengan densitas medium dalam tabung tersebut. Pada
tahapan ini ada dua cara yang dapat digunakan yaitu rate zonal sentrifugasi dan
isopycnic sentrifugasi. Meskipun keduanya menggunakan medium yang memiliki
gradient densitas namun prinsipnya sangatlah berbeda. Pada pemurnian protein
biasanya digunakan rate zonal sentifugasi yang biasanya menggunakan medium
dengan gradien densitas yang kontinyu.
5
Gambar 2
gradien densitas
medium dengan
kontinyu dan
diskontinyu
6
Rate zonal sentrifugasi pada protein memisahkan partikel pada medium
yang mempunyai gradien densitas kontinyu dengan mengandalkan laju
pengendapan partikel-partikel yang hendak dipisahkan. Laju pendengapan
partikel-partikel tersebut dapat diketahui dari koefisien pengendapan partikelpartikel tersebut. sampel yang hendak dimurnikan atau diseparasi pada mulanya
dimasukkan pada medium dengan gradien densitas pada bagian paling atas,
setelah gaya sentrifugasi bekerja pada medium tersebut, partikel-partikel akan
terfraksinasi (terpisahkan) pada zona-zona yang sesuai dengan densitas pada
medium tersebut. partikel-partikel dengan laju pengendapan yang sama akan
berada pada zona yang sama pada medium tersebut.
2.3
Teknik Percobaan
Teknik percobaan untuk memurnikan protein dengan menggunakan
metode ultrasentrifugasi dapat dilakukan dengan melibatkan tahap sentrifugasi
diferensial atau tanpa tahap sentrifugasi diferensial terlebih dahulu. Jika proteinprotein yang akan dimurnikan berasal dari suatu atau kumpulan sel yang masih
banyak mengandung organel-organel yang dapat mengganggu maka protein dapat
dipisahkan dengan menggunakan tahap sentrifugasi diferensial. Protein akan
cenderung berada pada supernatan ketika proses selesai dilakukan, sehingga
supernatan yang didapatkan kemudian dilakukan tahap sentrifugasi gradien
densitas yaitu dengan rate zonal sentrifugasi.
2.3.1
Persiapan Material dan Sampel
OptiPrep (larutan steril 60% w/v Iodixanol dalam air) yang dibuat bergradien
konsentrasinya, untuk menciptakan gradien konsentrasi dapat dibuat dengan
mencampurkan OptiPrep dalam HED dengan 2mM MgSO4 dan 0,1% Lubrol
PX sehingga didapatkan larutan 30% (w/v). Gradien akan terbentuk dengan
mengenakan gaya sentrifugasi pada larutan yang telah dibuat di dalam rotor
dengan kecepatan 100.000 rpm.
Larutan sukrosa yang disiapkan dalam 20mM Hepes pH 8,0; 1 mM EDTA,
1mM DTT (HED), 2mM MgSO4 dan 0,1 % Lubrol PX. Medium sukrosa yang
bergradien dapat dibuat dengan cara memasukkan secara berurutan larutan
7
sukrosa yang sudah dibuat dengan konsentrasi 20%, 15%, 10%, dan 5%
kedalam tabung sentrifugasi. Gradien konsentrasi yang telah dibuat dapat
dicek dengan menggunakan refraktometer.
Campuran protein yang akan dilakukan pemurnian atau pemisahan.
2.3.2
Sentrifugasi dan Gradien fraksinasi
Selama kurang lebih dua jam campuran material dan sampel protein
disentrifugasi dengan menggunakan tabung untuk sentrifugasi dengan kecepatan
120.000 rpm. Selanjutnya akan dihasilkan larutan yang terfraksinasi bergradien.
Larutan dipisahkan pada tabung-tabung reaksi yang berbeda untuk selanjutnya
dilakukan tahapan pengujian protein.
Gambar 3
fraksinasi dan
pemisahan
protein hasil
sentrifugasi
2.3.3
Pengujian Protein
8
Masing-masing fraksi yang didapatkan selanjutnya dilakukan pengujian
untuk meihat keberhasilan pemisahan protein-protein tersebut dengan cara
membandingkannya dengan protein serum standar dengan metode elektroforesis.
Masing –masing fraksi protein dilarutkan dengan setengah dari volume total yang
mengandung larutan 60% gliserol, 15% b-mercaptoetanol, 6% sodium dodecyl
sulfate, dan 0,001% bromfenol biru.
Kemudian masing-masing fraksi
dimasukkan kedalam sumur pada gel sodium dodecylsulfate polyacrylamide.
Selanjutnya hasil pola migrasi dapat menentukan laju sedimentasi dan koefisien
sedimentasi dari masing-masing fraksi protein dengan membandingkannya
dengan hasil dari referensi.
Gambar 4 Contoh hasil pengujian pemisahan campuran protein dengan
elektroforesis.
Pada gambar diatas campuran protein (bovin serum albumin, BSA;
ovalbumin, OVAL; karbonik anhidrase, CA; tripsin inhibitor kacang kedelai, STI;
dan a-lactalbumin, LAC) dipisahkan dengan rate zonal sentrifugasi pada 200 µL
sukrosa bergradien. (sebelah kiri diambil dari bagian paling atas hasil sentrifugasi,
sebelah kanan bagian paling bawah).
9
BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Prinsip dasar pemisahan untuk pemurnian protein dengan menggunakan
metoda ultrasentrifugasi yaitu pemisahan yang dilakukan berdasarkan pada
berat partikel-partikel protein dan juga densitas dari protein-protein campuran
dengan menerapkan gaya sentrifugal pada larutan menggunakan rotor yang
berputar rotasi pada kecepatan tertentu.
Ultrasentrifugasi menerapkan dua prinsip dasar yaitu sentrifugasi diferensial
yang memisahkan partikel berdasarkan berat partikel protein dan sentrifugasi
gradien densitas yang menggunakan medium dengan densitas yang
bergradien untuk memisahkan partikel berdasarkan perbedaan densitasnya.
Teknik percobaan yang umum dilakukan untuk memurnikan protein dengan
metode ultrasenrifugasi yaitu rate zonal sentrifugasi dengan menggunakan
sukrosa
bergradien
dengan
diikuti
pengujian
hasil
menggunakan
elektroforesis.
10
DAFTAR PUSTAKA
Basi, N. S., Rebois, R. V. (1997). Rate Zonal Sedimentation of Proteins in One
Hour or Less. Analytical Biochemistry. 251: 103-109.
Voelkl, A. (2016) . Ultracentrifugation . Heidleberg : University of Heidleberg
Anderson, N. G. (2006) . Zonal Centrifuges and Other Separation Systems.
Journal of Science. 15(13) : 103-112.
11
DENGAN MENGGUNAKAN METODE ULTRACENTRIFUGATION
MAKALAH
Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Biokimia Umum
(KI3061)
oleh:
Duma Doniagara Sambora
11215031
PROGRAM STUDI REKAYASA HAYATI
SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
JATINANGOR
2017
2
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI...............................................................................................................................ii
DAFTAR GAMBAR.................................................................................................................iii
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ...................................................................................................1
1.2 Tujuan Percobaan ...............................................................................................2
1.3 Manfaat ...............................................................................................................2
BAB II ISI
2.1 Prinsip Ultrasentrifugasi....................................................................................3
2.2 Konsep Dasar Ultrasentrifugasi.........................................................................3
2.3 Teknik Percobaan..............................................................................................6
BAB III PENUTUP........................................................................................................
3.1 Kesimpulan ........................................................................................................9
DAFTAR PUSTAKA................................................................................................................10
3
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Sentrifugasi Diferensial ................................................................................................ 4
Gambar 2. Medium dengan gradien densitas kontinyu dan diskontinyu.........................................5
Gambar 3. Fraksinasi dan pemisahan protein hasil sentrifugasi......................................................7
Gambar 4. Contoh hasil pengujian pemisahan campuran protein dengan
elektroforesis.......................................................................................................8
4
BAB I
PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
Dalam industri-industri biokimia, seringkali pekerjaan menggunakan
protein menjadi hal yang sangat umum. Protein-protein yang digunakan dapat
berbagai macam dan beragam fungsinya, seperti enzim sebagai biokatalisator,
hormon-hormon yang merupakan strukutur protein regulator, protein-protein
nutrient, protein struktur dan lain sebagainya.
Penggunaan protein seringkali tidak dapat langsung dilakukan hanya
dengan menggunakan ekstraksi dari sumber protein yang digunakan karena
protein-protein tersebut masih berupa campuran dari berbagai macam protein serta
pengotor lain yang terkandung dalam larutan ekstrak, sehingga pemurnian protein
diperlukan untuk memisahkan protein-protein tertentu dari protein jenis lain.
Dengan melakukan pemurnian suatu jenis protein, nilai jual dari suatu protein
murni akan menjadi tinggi dalam suatu industri sering juga protein murni
dibutuhkan dalam suatu penelitian tertentu yang membutuhkan protein murni
dalam prosesnya.
Dalam bidang rekayasa hayati (Bioengineering), pemurnian protein juga
dapat menjadi hal yang sangat penting, karena rekayasa hayati erat kaitannya
dengan bio-industri. Protein murni akan sangat dibutuhkan untuk suatu produkproduk yang akan dijual secara komersil dengan memiliki nilai jual yang lebih
tinggi dibandingkan dengan protein campuran karena memiliki spesifisitas. Selain
itu enzim juga merupakan hal yang sangat penting dalam bidang rekayasa hayati,
karena enzim yang murni akan sering digunakan dalam jalur metabolisme suatu
produk metabolit yang diinginkan. Dengan alasan-alasan tersebut, maka
dibutuhkan pengetahuan mengenai cara pemisahan dan pemurnian protein, dalam
hal ini dengan menggunakan metode ultrasentrifugasi.
1
1.2 Tujuan
Menentukan
prinsip
dasar
pemurnian
protein
dengan
metode
ultrasentrifugasi.
Menentukan teori dasar sentrifugasi.
Menentukan teknik percobaan pemurnian protein dengan metode
ultrasentrifugasi.
1.3 Manfaat
Manfaat yang dapat diperoleh dari makalah ini diantaranya :
Mengetahui metode lain dalam pemurnian dalam proses-proses biokimia
yang melibatkan protein.
Dalam bidang rekayasa hayati, dapat diaplikasikan untuk proses-proses
yang melibatkan penggunaan protein seperti enzim.
Dalam bioindustri, dapat diaplikasikan untuk produksi jenis protein-protein
tertentu yang bernilai tinggi.
2
BAB II
ISI
2.1
Prinsip Ultrasentrifugasi
Prinsip
dasar
pemurnian
protein
dengan
menggunakan
metode
ultrasentrifugasi adalah memisahkan partikel-partikel protein yang berbeda
dengan memanfaatkan perbedaan berat atau densitas molekul-molekul yang
terkandung dalam larutan. Dalam metode ultrasentrifugasi, proses pemisahan
molekul-molekul protein berdasarkan berat dan densitas yang berbeda
menggunakan insturmen yang bekerja untuk memutar secara rotasi larutan
campuran protein dalam suatu wadah dengan kecepatan tinggi agar gaya
sentrifugasi bekerja pada larutan sehingga komponen protein dengan
terfraksinasi, sehingga
protein-protein yang diinginkan terpisah dengan
komponen lainnya.
Gaya sentrifugasi yang bekerja pada partikel-partikel akan tergantung pada
densitas atau massa dari partikel-partikel tersebut. partikel yang memiliki massa
yang lebih besar akan mempunyai gaya sentrifugasi lebih besar dibandingkan
dengan gaya sentrifugasi yang bekerja pada partikel dengan massa yang lebih
kecil, sehingga partikel yang lebih besar akan mengimbangi gaya hambat dari
larutan (drag force) yang menyebabkan partikel-partikel dengan massa yang
lebih besar akan berada pada dasar wadah setelah proses sentrifugasi dilakukan.
Sedangkan partikel dengan massa yang relatif lebih kecil akan berada pada
bagian atasnya (Voelkl, 2016).
2.2
Konsep dasar metode ultrasentifugasi
Untuk mempersiapkan proses sentrifugasi terdapat dua tahap yang
dilakukan, yaitu sentrifugasi diferensial dan densitas gradien sentrifugasi.
3
2.2.1 Sentrifugasi diferensial
Sentrifugasi diferensial pada dasarnya memisahkan partikel-partikel
berdasarkan bentuk dan ukurannya. Partikel-partikel berbeda pada awalnya
bercampur dalam larutan buffer untuk menjaga protein pada pH optimalnya
agar tidak terjadi denaturasi. Campuran kemudian dipisahkan menjadi dua
fraksi yaitu; pellet, bagian yang mengandung sedimentasi partikel dan
supernatan yang terdiri dari partikel tidak tersedimentasi dalam larutan buffer.
Gambar 1 : Sentifugasi diferensial
Seperti yang diilustrasikan pada gambar, komponen-komponen partikel akan
terdistribusi secara berbeda menjadi pellet dan supernatan selama proses
sentrifugasi, berdasarkan pada ukuran. Partikel yang mempunyai ukuran yang
lebih besar akan cenderung untuk diendapkan pada bagian dasar (partikel
berwarna putih). Sedangkan untuk partikel dengan ukuran yang lebih kecil
cenderung akan berada pada supernatan (partikel titik hitam). Untuk pemisahan
yang lebih baik, supernatant yang terbentuk dapat dipisahkan dan dilakukan
sentrifugasi lagi dengan laju perputaran sentrifugasi yang lebih tinggi. Sementara
4
pellet dapat di endapkan ulang dan sentrifugasi ulang untuk memisahkannya dari
kontaminan (dicuci).
2.2.2
Sentrifugasi dengan gradien densitas
Pada tahapan sebelumnya, pemurnian protein tidak dapat secara murni
diselesaikan karena ada partikel lain yang mungkin saja menjadi pengotor dalam
endapan. Untuk mendapatkan protein yang benar-benar murni, dibutuhkan
langkah untuk menghilangkan partikel kontaminan tersebut, yaitu dengan teknik
yang dinamakan sentrifugasi gradient densitas. Alasan dilakukannya tahapan ini
adalah
untuk
memisahkan
partikel-partikel
yang
berbeda
densitasnya
menggunakan suatu medium dalam tabung yang mempunyai densitas berbeda,
tidak seperti pada tahapan sebelumnya yang menggunaka densitas medium yang
homogen.
Pada dasarnya densitas medium yang digunakan dapat ditingkatkan secara
kontinyu atau diskontinyu (diskrit). Tujuannya agar pada masing-masing densitas
medium yang berbeda dapat diendapkan partikel-partikel tertentu dengan densitas
yang telah disesuaikan dengan densitas medium dalam tabung tersebut. Pada
tahapan ini ada dua cara yang dapat digunakan yaitu rate zonal sentrifugasi dan
isopycnic sentrifugasi. Meskipun keduanya menggunakan medium yang memiliki
gradient densitas namun prinsipnya sangatlah berbeda. Pada pemurnian protein
biasanya digunakan rate zonal sentifugasi yang biasanya menggunakan medium
dengan gradien densitas yang kontinyu.
5
Gambar 2
gradien densitas
medium dengan
kontinyu dan
diskontinyu
6
Rate zonal sentrifugasi pada protein memisahkan partikel pada medium
yang mempunyai gradien densitas kontinyu dengan mengandalkan laju
pengendapan partikel-partikel yang hendak dipisahkan. Laju pendengapan
partikel-partikel tersebut dapat diketahui dari koefisien pengendapan partikelpartikel tersebut. sampel yang hendak dimurnikan atau diseparasi pada mulanya
dimasukkan pada medium dengan gradien densitas pada bagian paling atas,
setelah gaya sentrifugasi bekerja pada medium tersebut, partikel-partikel akan
terfraksinasi (terpisahkan) pada zona-zona yang sesuai dengan densitas pada
medium tersebut. partikel-partikel dengan laju pengendapan yang sama akan
berada pada zona yang sama pada medium tersebut.
2.3
Teknik Percobaan
Teknik percobaan untuk memurnikan protein dengan menggunakan
metode ultrasentrifugasi dapat dilakukan dengan melibatkan tahap sentrifugasi
diferensial atau tanpa tahap sentrifugasi diferensial terlebih dahulu. Jika proteinprotein yang akan dimurnikan berasal dari suatu atau kumpulan sel yang masih
banyak mengandung organel-organel yang dapat mengganggu maka protein dapat
dipisahkan dengan menggunakan tahap sentrifugasi diferensial. Protein akan
cenderung berada pada supernatan ketika proses selesai dilakukan, sehingga
supernatan yang didapatkan kemudian dilakukan tahap sentrifugasi gradien
densitas yaitu dengan rate zonal sentrifugasi.
2.3.1
Persiapan Material dan Sampel
OptiPrep (larutan steril 60% w/v Iodixanol dalam air) yang dibuat bergradien
konsentrasinya, untuk menciptakan gradien konsentrasi dapat dibuat dengan
mencampurkan OptiPrep dalam HED dengan 2mM MgSO4 dan 0,1% Lubrol
PX sehingga didapatkan larutan 30% (w/v). Gradien akan terbentuk dengan
mengenakan gaya sentrifugasi pada larutan yang telah dibuat di dalam rotor
dengan kecepatan 100.000 rpm.
Larutan sukrosa yang disiapkan dalam 20mM Hepes pH 8,0; 1 mM EDTA,
1mM DTT (HED), 2mM MgSO4 dan 0,1 % Lubrol PX. Medium sukrosa yang
bergradien dapat dibuat dengan cara memasukkan secara berurutan larutan
7
sukrosa yang sudah dibuat dengan konsentrasi 20%, 15%, 10%, dan 5%
kedalam tabung sentrifugasi. Gradien konsentrasi yang telah dibuat dapat
dicek dengan menggunakan refraktometer.
Campuran protein yang akan dilakukan pemurnian atau pemisahan.
2.3.2
Sentrifugasi dan Gradien fraksinasi
Selama kurang lebih dua jam campuran material dan sampel protein
disentrifugasi dengan menggunakan tabung untuk sentrifugasi dengan kecepatan
120.000 rpm. Selanjutnya akan dihasilkan larutan yang terfraksinasi bergradien.
Larutan dipisahkan pada tabung-tabung reaksi yang berbeda untuk selanjutnya
dilakukan tahapan pengujian protein.
Gambar 3
fraksinasi dan
pemisahan
protein hasil
sentrifugasi
2.3.3
Pengujian Protein
8
Masing-masing fraksi yang didapatkan selanjutnya dilakukan pengujian
untuk meihat keberhasilan pemisahan protein-protein tersebut dengan cara
membandingkannya dengan protein serum standar dengan metode elektroforesis.
Masing –masing fraksi protein dilarutkan dengan setengah dari volume total yang
mengandung larutan 60% gliserol, 15% b-mercaptoetanol, 6% sodium dodecyl
sulfate, dan 0,001% bromfenol biru.
Kemudian masing-masing fraksi
dimasukkan kedalam sumur pada gel sodium dodecylsulfate polyacrylamide.
Selanjutnya hasil pola migrasi dapat menentukan laju sedimentasi dan koefisien
sedimentasi dari masing-masing fraksi protein dengan membandingkannya
dengan hasil dari referensi.
Gambar 4 Contoh hasil pengujian pemisahan campuran protein dengan
elektroforesis.
Pada gambar diatas campuran protein (bovin serum albumin, BSA;
ovalbumin, OVAL; karbonik anhidrase, CA; tripsin inhibitor kacang kedelai, STI;
dan a-lactalbumin, LAC) dipisahkan dengan rate zonal sentrifugasi pada 200 µL
sukrosa bergradien. (sebelah kiri diambil dari bagian paling atas hasil sentrifugasi,
sebelah kanan bagian paling bawah).
9
BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Prinsip dasar pemisahan untuk pemurnian protein dengan menggunakan
metoda ultrasentrifugasi yaitu pemisahan yang dilakukan berdasarkan pada
berat partikel-partikel protein dan juga densitas dari protein-protein campuran
dengan menerapkan gaya sentrifugal pada larutan menggunakan rotor yang
berputar rotasi pada kecepatan tertentu.
Ultrasentrifugasi menerapkan dua prinsip dasar yaitu sentrifugasi diferensial
yang memisahkan partikel berdasarkan berat partikel protein dan sentrifugasi
gradien densitas yang menggunakan medium dengan densitas yang
bergradien untuk memisahkan partikel berdasarkan perbedaan densitasnya.
Teknik percobaan yang umum dilakukan untuk memurnikan protein dengan
metode ultrasenrifugasi yaitu rate zonal sentrifugasi dengan menggunakan
sukrosa
bergradien
dengan
diikuti
pengujian
hasil
menggunakan
elektroforesis.
10
DAFTAR PUSTAKA
Basi, N. S., Rebois, R. V. (1997). Rate Zonal Sedimentation of Proteins in One
Hour or Less. Analytical Biochemistry. 251: 103-109.
Voelkl, A. (2016) . Ultracentrifugation . Heidleberg : University of Heidleberg
Anderson, N. G. (2006) . Zonal Centrifuges and Other Separation Systems.
Journal of Science. 15(13) : 103-112.
11