Uji Aktivitas Antioksidan dan Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat, n-Heksana Senduduk (Melastoma malabathricum Linn) Chapter III V
BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1
Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
a. Neraca analitik digital
Mettler PM 480
b. Spektofotometer UV-Vis Shimadzu
c. Rotary evaporator
Buchi
d. Inkubator
Memmert
e. Autoklaf
Himaraya
f. Laminar air flow
Esco
g. Penangas air
h. Peralatan gelas
Pyrex
i. Pipet volume
Pyrex
j. Pipet tetes
k. Tabung reaksi
Pyrex
l. Cawan petri
m. Corong
n. Labu Ekstraksi
Pyrex
o. Labu Takar
Pyrex
p. Batang Pengaduk
q. Botol vial
r. Bulb Pipet
s. Blender
t. Gelas Beker
Pyrex
u. Erlenmeyer
Pyrex
v. Spatula
w. Statif dan klem
x. Kertas saring
Universitas Sumatera Utara
26
3.1.2 Bahan
Daun senduduk
Aquadest
Metanol
Etanol p.a
Etil asetat
n-Heksana
Diphenil Pikril Hidrazil (DPPH)
DMSO
Media Nutrien Agar
Media Mueller Hilton Agar
Media BHIB
Media Nutrien Broth
Asam Askorbat
FeCl3
NaOH
HCl
NH4OH
3.2
Prosedur Penelitian
3.2.1 Penyediaan Sampel
Daun yang diteliti adalah daun tumbuhan senduduk yang
diperoleh dari daerah Tapus, Kabupaten Panti, Sumatera Barat. Daun
tumbuhan senduduk ini dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan
sampai diperoleh serbuk sebanyak 500 g.
3.2.2 Ekstrak Daun Senduduk
Sebanyak 500 gram serbuk daun senduduk dimaserasi dengan
metanol selama 2x24 jam. Ekstrak metanol yang diperoleh ditampung
dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator pada suhu
60oC. Ekstrak pekat metanol yang diperoleh diekstraksi dengan
menggunakan etil asetat sehingga menghasilkan endapan dan ekstrak
Universitas Sumatera Utara
27
etil asetat. Endapan yang diperoleh berupa ekstrak padat metanol.
Ekstrak etil asetat yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary
evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat etil asetat. Ekstrak pekat
etil asetat dilarutkan dengan metanol kemudian diekstraksi partisi
dengan n-heksana sehingga terbentuk lapisan n-heksana dan metanol
fraksi etil asetat. Masing-masing fraksi n-heksana dan ekstrak metanol
fraksi fraksi etil asetat dipekatkan dengan alat rotari evaporator,
sehingga diperoleh ekstrak pekat n-heksana dan ekstrak pekat metanol
fraksi etil asetat.
3.2.3 Uji Antioksidan dengan Metode DPPH
3.2.3.1. Pembuatan Larutan DPPH 0,3 mM (BM=394,32g/mol)
Larutan DPPH 0,3 mM dibuat dengan melarutkan 11,82 mg
serbuk DPPH dalam etanol p.a kemudian dimasukkan ke dalam labu
takar 100 mL dan dicukupkan volumenya sampai tanda garis
kemudian dihomogenkan.
3.2.3.2. Pembuatan Variasi Ekstrak Daun Senduduk
a.
Ekstrak n-Heksana
Ekstrak pekat n-heksana dibuat larutan induk 1000 mg/L,
dengan melarutkan 0,025 g dengan pelarut etanol p.a dalam labu takar
25 mL. Larutan induk 1000 mg/L dilakukan pengenceran menjadi
larutan 100 mg/L, dari larutan 100 mg/L dibuat variasi konsentrasi
10,20,40,80 mg/L untuk uji aktivitas antioksidan.
Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap ekstrak padat
metanol dan ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat.
3.2.3.3. Pengujian Aktivitas Antioksidan
a. Pengujian larutan blanko
Sebanyak 1 mL larutan DPPH 0,3 mM ditambahkan 2,5
etanol
p.a
dimasukkan
kedalam
tabung
reaksi
dan
dihomogenkan. Dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap,
kemudian diukur absorbansinya dengan panjang gelombang
515nm.
Universitas Sumatera Utara
28
b. Pengujian aktivitas antioksidan sampel
Sebanyak 1 mL larutan DPPH 0,3 mM ditambahkan ke
dalam masing-masing tabung reaksi yang berisi 2,5 mL larutan
ekstrak n-Heksana dengan konsentrasi 10, 20, 40 dan 80 mg/L
dan dihomogenkan. Dibiarkan selama 30 menit pada ruang
gelap,kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang
maksimum 515 nm.
Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap variasi
ekstrak padat metabol dan ekstrak pekat metanol fraksi etil
asetat.
3.2.4. Uji Antibakteri Dengan Metode Difusi Agar
3.2.4.1. Pembuatan Media
a. Pembuatan media Nutrien Agar (NA)
Ditimbang sebanyak 20 g media NA kemudian disuspensikan
ke dalam aquadest 1000 mL lalu dipanaskan sampai larut
sempurna, kemudian dimasukkan masing-masing 10 mL media NA
ke dalam 10 tabung reaksi untuk pembuatan media agar miring.
Sterilkan media tersebut di dalam autoklaf pada suhu 121oC selama
15 menit.
b. Pembuatan media Nutrient Broth (NB)
Ditimbang sebanyak 13 g media NB dilarutkan ke dalam 100
mL aquadest. Dipipet masing-masing 10 mL ke dalam tabung
reaksi. Sterilkan media tersebut di dalam autoklaf pada suhu 121oC
selama 15 menit.
c. Pembuatan media Mueller Hilton Agar (MHA)
Sebanyak 19 g serbuk MHA dilarutkan dalam 500 mL
aquadest dan dipanaskan hingga larut. Sterilkan media tersebut di
dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
Universitas Sumatera Utara
29
3.2.4.2. Pembuatan Inokulum Bakteri
Koloni bakteri E.coli dan S.aureus diambil dari bank
mikrob menggunakan jarum ose kemudian disuspensikan ke
dalam NB yang telah steril lalu di inkubasikan pada suhu
35±2oC selama 24 jam.
3.2.4.3. Pembuatan Kultur Bakteri
Inokulum bakteri diinokulasi pada permukaan media NA
miring dengan jarum ose steril kemudian diinkubasi pada suhu
35±2 oC selama 24 jam.
3.2.4.4. Pembuatan Variasi ekstrak daun senduduk
Ekstrak n-Heksana
Sebanyak 2 g n-Heksana ditimbang kemudian dilarutkan ke
dalam DMSO 4 mL kemudian diaduk hingga larut sehingga
diperoleh
konsentrasi
500mg/mL.
Kemudian
dibuat
pengenceran dengan konsentrasi 400, 300, 200 dan 100 mg/mL.
Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap ekstrak padat
metanol dan ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat.
3.2.4.5. Pengujian Aktifitas Antibakteri
Sebanyak 20 mL media MHA dituang ke dalam cawan
petri steril kemudian dibiarkan sampai padat. Sebanyak 0,1 mL
inokulum digoreskan dengan steril swab ke dalam cawan petri
yang berisi media tersebut. Pada media yang telah digores
inokulum diletakkan kertas cakram yang telah dicelupkan pada
larutan uji dengan berbagai konsentrasi. Inkubasi pada suhu
35±2oC selama 18 -24 jam. Setelah itu diukur diameter daerah
zona bening sekitar cakram dengan menggunakan jangka
sorong. Lakukan pengujian yang sama untuk setiap ekstrak dan
variasi konsentrasi.
Universitas Sumatera Utara
30
3.3 Bagan Penelitian
3.3.1 Bagan Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Daun Senduduk
Ekstrak Metanol Daun Senduduk
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi secukupnya
Ditambah pereaksi untuk masing-masing uji
Alkaloid
Flavonoid
Tabung 1+pereaksi
meyer
Terpenoid
Ditambahkan
FeCl3 10%
Tabung 2+pereaksi
Dragendorf
Tanin
Saponin
Ditotolkan
pada KLT
Ditambah
Aquadest
Disemprotkan
dengan CeSO4
Dikocok
kuat-kuat
Ditambahkan
FeCl3 5%
Tabung 3+pereaksi
Bouchardat
Senyawa
Alkaloid
Negatif
Senyawa
Flavonoid
Positif
Senyawa
Terpenoid
Positif
Senyawa
Saponin
Positif
Senyawa
Tanin
Positif
Universitas Sumatera Utara
31
3.3.2 Pembuatan Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan n-Heksana Daun
Senduduk
500g Daun Senduduk
Diskrining fitokimia
Dimaserasi dengan metanol 4 L
selama 24 jam
Disaring
Larutan Metanol
Ampas
Diskrining fitokimia
Dipekatkan dengan
rotary evaporator
Ekstrak Pekat Metanol
Ditambah Etil Asetat
Disaring
Larutan Etil Asetat
Ekstrak Padat Metanol
Dipekatkan
Uji Antioksidan
dan Antibakteri
Ekstrak Pekat Etil Asetat
Dilarutkan dengan metanol
Dipartisi dengan n-Heksana
larutan metanol dari fraksi etil asetat
Hasil Pengujian
Larutan n-heksana
Dipekatkan
Dipekatkan
Ekstrak pekat metanol
fraksi Etil asetat
Ekstrak pekat n-Heksana
Uji Antioksidan
dan antibakteri
Uji Antioksidan
dan Antibakteri
Hasil Pengujian
Hasil pengujian
Universitas Sumatera Utara
32
3.3.3 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Senduduk Dengan Metode
DPPH
3.3.3.1 Pembuatan larutan DPPH 0,3 mM
11,83 mg DPPH
Dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL
Ditambahkan etanol p.a hingga garis batas
Dihomogenkan
Simpan di tempat yang gelap
Larutan DPPH 0,3 mM
3.3.3.2 Pembuatan variasi konsentrasi masing-masing ekstrak
0,025 g ekstrak pekat n-Heksana
Dimasukkan ke dalam labu takar 25 mL
Ditambahkan etanol p.a hingga garis tanda
Dihomogenkan
Larutan induk 1000 mg/L
Dipipet 5 mL larutan induk 1000 mg/L
Dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL
Ditambahkan etanol p.a hingga garis tanda
Dihomogenkan
Larutan 100 mg/L
Dibuat variasi konsentrasi 10, 20, 40 dan 80 mg/L
Dibuat pengenceran
10 mg/L
dipipet 2,5 mL
dipipet 5.0 mL
dipipet 10 mL
dipipet 20 mL
dimasukkan ke
dalam labu takar
25 mL
dimasukkan ke
dalam labu takar
25 mL
dimasukkan ke
dalam labu takar
25 mL
dimasukkan ke
dalam labu takar
25 mL
ditambahkan
etanol p.a hingga
garis batas
ditambahkan
etanol p.a hingga
garis batas
ditambahkan
etanol p.a hingga
garis batas
ditambahkan
etanol p.a hingga
garis batas
dihomogenkan
dihomogenkan
dihomogenkan
dihomogenkan
20 mg/L
40 mg/L
80 mg/L
Catatan: Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap ekstrak padat metanol dan
ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat.
Universitas Sumatera Utara
33
3.3.3.4 Pengukuran nilai absorbansi blanko
1 mL larutan DPPH 0,3 mM
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Ditambah 2,5 mL etanol p.a
Dihomogenkan
Dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap
Diukur absorbansi pada panjang gelombang 515 nm
Hasil
3.3.3.5 Pengukuran nilai absorbansi sampel
1 mL larutan DPPH 0,3 mM
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Ditambah 2,5 mL ekstrak n-heksana konsentrasi 10 mg/L
Dihomogenkan
Dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap
Diukur absorbansi pada panjang gelombang 515 nm
Hasil
Catatan: Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap variasi konsentrasi 20; 40;
dan 80 mg/L dari ekstrak n-heksana, ekstrak padat metanol dan ekstrak pekat
metanol fraksi etil asetat.
3.3.4 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Senduduk Dengan Metode
Difusi Agar
3.3.4.1 Pembuatan Media
a. Pembuatan Media Nutrien Agar
20g media NA (Nutrien Agar)
Disuspensikan dengan 1000mL aquadest
Dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih
Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit
Media NA steril
Universitas Sumatera Utara
34
b. Pembuatan Media Nutrien Broth
1,3 g media NB (Nutrien Broth)
Disuspensikan dengan 100 mL aquadest
Dipipet sebanyak 10 mL dan dimasukkan kedalam tabung
Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit
Media NB steril
c. Pembuatan Media MHA
19 g media MHA ( Mueller Hilton Agar)
Disuspensikan dengan 500 mL aquadest
Dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih
Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit
Media MHA steril
3.3.4.2 Pembuatan Inokulum Bakteri
10 mL Media NB steril
Dimasukkan bakteri secara aseptik dengan jarum ose
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 C
Dibandingkan kekeruhan dengan standar Mcfarlan 510 nm
Inokulum Bakteri
3.3.4.3 Pembuatan Kultur Bakteri
Inokulum Bakteri E.coli
Diambil dengan jarum ose steril inokulum bakteri
Diinokulasi pada permukaan media NA miring
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 C
Kultur Bakteri E. coli
Catatan: Perlakuan yang sama untuk pembuatan inokulum dan kultur bakteri
terhadap bakteri S. aureus
Universitas Sumatera Utara
35
3.3.4.4 Pembuatan Variasi Konsentrasi dari Masing-Masing Ekstrak
2000 mg ekstrak pekat n-Heksana
Dilarutkan dengan 4 mL DMSO
Dihomogenkan
Larutan 500 mg/mL
Dibuat variasi konsentrasi
400; 300; 200; dan 100 mg/mL
Dipipet 0,8 mL
Diencerkan dengan
0,2 mL DMSO
Dihomogenkan
Larutan
400 mg/mL
Dipipet 0,6 mL
Diencerkan dengan
0,4 mL DMSO
Dihomogenkan
Larutan
200 mg/mL
Dipipet 0,4 mL
Diencerkan dengan
0,6 mL DMSO
Dihomogenkan
Larutan
300 mg/mL
Dipipet 0,2 mL
Diencerkan dengan
0,8 mL DMSO
Dihomogenkan
Larutan
100 mg/mL
3.3.4.5 Pengujian Aktivitas Antibakteri
Media MHA pada cawan petri
Digoreskan kultur bakteri ke permukaan media MHA dengan menggunakan
cutton steril
Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan variasi konsentrasi
ekstrak n-Heksana
Diinkubasi selama 24 jam suhu 35 C
Diukur zona bening disekitar cakram dengan jangka sorong
Hasil
Catatan: Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap ekstrak padat metanol dan
ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
4.1.1 Skrining fitokimia
Ekstrak metanol dari daun senduduk yang diperoleh diuji skrining
fitokimia untuk mengetahui adanya golongan senyawa alkaloid,
flavonoid, tanin, saponin, terpenoid yang ditujukan pada tabel 4.1.
Tabel 4.1 Hasil Uji Skrining Fitokimia Daun Senduduk
No
A
1
Metaboli Sekunder
Ekstrak Metanol
Alkaloid
2
3
Fenolik
Terpenoid
4
Saponin
Keterangan:
= Reaksi negatif
+
= Reaksi positif
++ = Reaksi positif kuat
Pereaksi
Hasil
Dragendorf
Bourchardat
Meyer
FeCl3
Ditotolkan pada KLT
disemprotkan CeSO4
aquadest
+
++
+
4.1.2 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan
Pengujian aktivitas antioksidan pada ekstrak padat metanol, ekstrak
metanol fraksi etil asetat dan ekstrak n-heksana dilakukan dengan metode
DPPH dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 515 nm. Kemampuan antioksidan diukur dengan penurunan
serapan larutan DPPH dengan membaca nilai absorbansi dari masingmasing konsentrasi. Nilai % peredaman digunakan untuk menyatakan
nilai IC50 (Inhibitor Concentration) yaitu besarnya konsentrasi yang
menyebabkan hilangnya 50% aktivitas DPPH. Semakin kecil nilai IC50
maka semakin besar aktivitas antioksidannya. Berikut adalah hasil uji
antioksidan dari masing-masing ekstrak:
Universitas Sumatera Utara
37
Tabel 4.2 Nilai % Peredaman dan Nilai IC50 dari masing-masing ekstrak
Konsentrasi
Nilai % Peredaman
(mg/L)
Ekstrak Metanol
Ekstrak Etil Asetat
Ekstrak n-Heksana
0
0,0000
0,0000
0,0000
10
25,5576
23,3055
1,477
20
40,7063
49,1179
4,5178
40
54,5539
87,7437
6,0817
80
98,7918
93,4076
11,6420
Nilai IC50
35,3462 mg/L
29,3984 mg/L
348,7183 mg/L
4.1.3 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri pada ekstrak metanol, ekstrak
metanol fraksi etil asetat dan ekstrak n-heksana daun senduduk dilakukan
terhadap bakteri E. coli dan S. aureus dengan metoda difusi agar.
Berikut hasil uji aktivitas antibakteri masing-masing ekstrak dengan
konsentrasi tertentu.
4.1.3.1 Ekstrak Metanol
500 mg/mL
40
0
m
g/
m
200 mg/mL
100 mg/mL
100 mg/mL
20
0
m
g/
m
30
0
m
g/
m
50
0
m
g/
m
300 mg/mL
400 mg/mL
Gambar 4.1 Zona Hambat Ekstrak Metanol Terhadap Bakteri E.Coli
Universitas Sumatera Utara
38
100 mg/mL
100 mg/mL
200 mg/mL
200
mg
/mL
500
mg
/mL
500
mg
/mL
300
mg
/mL
300
mg
/mL
400 mg/mL
400 mg/mL
Gambar 4.2 Zona Hambat Ekstrak Metanol Terhadap Bakteri S. aureus
4.1.3.2 Ekstrak Pekat Metanol Fraksi Etil Asetat
300 mg/mL
500 mg/mL
100 mg/mL
400 mg/mL
200
mg
/mL
200
mg
/mL
500
mg
/mL
400
mg
/mL
300 mg/mL
100 mg/mL
Gambar 4.3 Zona Hambat Ekstrak Metanol Fraksi Etil Asetat Terhadap
Bakteri E.coli
500 mg/mL
200 mg/mL
100
mg
/mL
300
mg
/mL
400
mg
/mL
100
mg
/mL
400
mg
/mL
500 mg/mL
300 mg/mL
200 mg/mL
Gambar 4.4 Zona Hambat Ekstrak Metanol Fraksi Etil Asetat Terhadap
Bakteri S. aureus
4.1.3.3 Ekstrak Pekat n-Heksana
Universitas Sumatera Utara
39
100 mg/mL
200 mg/mL
100 mg/mL
500
mg
/mL
500
mg
/mL
200
mg
/mL
300
mg
/mL
400
mg
/mL
300 mg/mL
400 mg/mL
Gambar 4.5 Zona hambat Ekstrak n-Heksana terhadap bakteri E.coli
200 mg/mL
200 mg/mL
100 mg/mL
300
mg
/mL
100
mg
/mL
300
mg
/mL
500
mg
/mL
400 mg/mL
400
mg
/mL
500 mg/mL
Gambar 4.6 Zona Hambat Ekstrak n-heksana Terhadap Bakteri S. aureus
Hasil penelitian uji antibakteri dengan mengukur zona hambat dari
masing-masing konsentrasi. Hasil pengukuran diameter zona hambat dari uji
aktivitas antibakteri dapat dilihat Table 4.3 sebagai berikut:
Tabel 4.3. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan
n-Heksana Daun Senduduk
Diameter zona hambat (mm)
No Konsentrasi
Ekstrak
Ekstrak
Ekstrak
(mg/mL)
Etil Asetat
Metanol
n-Heksana
E.coli S.aureus E.coli S.aureus E.coli S.aureus
1
100
8,80
9,75
12,95
2
200
9,20
10,60
13,95
3
300
9,95
11,90
15,10
4
400
10,65
14,05
16,00
5
500
14,20
14,65
17,50
4.2 Pembahasan
4.2.1 Skrining Fitokimia
Universitas Sumatera Utara
40
Uji fitokimia bertujuan untuk mengidentifikasi kandungan senyawa
metabolit sekunder yang terdapat dalam sampel daun senduduk. Pada
tabel 4.1 hasil skrining fitokimia metabolit sekunder yang terkandung
dalam daun senduduk adalah flavonoid, fenolik, saponin, terpenoid dan
steroid, sedangkan untuk alkaloid diperoleh hasil yang negatif karena
sampel tidak mengalami perubahan warna yang sesuai dengan indikator.
Pengujian senyawa fenolik dilakukan dengan penambahan FeCl3
pada ekstrak metanol daun senduduk. Terjadi perubahan warna biru
kehitaman yang terjadi pada saat penambahan FeCl3 yang menyatakan
bahwa, daun senduduk mengandung senyawa fenolik. Perubahan warna
biru kehitaman disebabkan karena terjadinya reaksi FeCl3 dengan gugus
hidroksil yang ada pada senyawa fenolik.
Pada uji skrining fitokimia ekstrak daun senduduk, senyawa alkaloid
untuk uji Dragendorff, Mayer dan Bouchardat diperoleh hasil negatif, karena
tidak terbentuknya endapan pada tiap-tiap pereaksi yang ditambahkan.
Menurut Marliana (2005) terbentuknya endapan pada uji Meyer, Wagner ,
Dragendorff dan Bouchardat menandakan reaksi positif.
Pada pengujian terpenoid, hasil pada skrining fitokimia daun
senduduk menunjukkan hasil positif kuat dengan terjadinya perubahan
warna menjadi kecoklatan yang menunjukkan kandungan golongan
terpenoid. Analisis ini didasarkan pada kemampuan senyawa tersebut
membentuk warna dengan penambahan pereaksi CeSO4 1% dalam H2SO4
10%.
Hasil pengujian saponin pada ekstrak daun senduduk dengan
penambahan aquadest menunjukkan terbentuknya busa yang menyatakan
hasil positif. Menurut Robinson (1995) Saponin mengandung gugus
glikosida, timbulnya busa pada uji Forth menunjukkan adanya glikosida
yang mempunyai kemampuan membentuk buih dalam air yang terhidrolisis
menjadi glukosa dan senyawa lainnya.
Universitas Sumatera Utara
41
4.2.2 Aktivitas Antioksidan
Berdasarkan Tabel 4.2, hubungan nilai konsentrasi dengan %
peredaman dari ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana dapat dilihat
pada Gambar 4.7 di bawah ini.
Gambar 4.7 Kurva Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan
n-Heksana
Pada Gambar 4.7, dibuat persamaan regresi linear antara
konsentrasi mg/L sebagai sumbu x dengan nilai % peredaman sebagai
sumbu y, sehingga dari persamaan regresi tersebut dapat ditentukan
nilai IC50 dari masing-masing ekstrak. Pada persamaan regresi linear
tersebut, dapat diketahui nilai slope ekstrak etil asetat dan ekstrak
metanol adalah 1,1417 dan 1,1476 sehingga dapat dikatakan bahwa
aktivitas antioksidan kedua ekstrak tersebut hampir sama dan lebih
tinggi dari ekstrak n-heksana yang memiliki nilai slope 0,142.
Berdasarkan pada hasil pengujian aktivitas antioksidan dari
ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana dengan metode DPPH,
maka diperoleh nilai IC50 yang menunjukkan kekuatan aktivitas
antioksidan dari masing-masing ekstrak. Hal tersebut dapat dilihat
pada
Gambar
4.8
berikut::
Universitas Sumatera Utara
42
Gambar 4.8 Grafik Perbandingan Nilai IC50 Masing-Masing Ekstrak
Pada Gambar 4.8 diatas, aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat
lebih kuat dibanding ekstrak metanol dan ekstrak n-heksana. Kekuatan
aktivitas antioksidan berbanding terbalik dengan nilai IC50 yaitu,
semakin tinggi nilai IC50, maka semakin lemah aktivitas antioksidan
pada ekstrak tersebut dan sebaliknya semakin rendah nilai IC50 maka
semakin kuat aktivitas antioksidannya. Nilai IC50 merupakan
kemampuan senyawa antioksidan menangkap 50% radikal bebas
DPPH.
Hasil pengujian aktivitas antioksidan daun senduduk ekstrak
metanol, etil asetat dan n-heksana dapat diklasifikasikan berdasarkan
nilai IC50. Menurut Mulyani (2016), suatu senyawa dikatakan sebagai
antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 kurang dari 50 mg/L, 50-100
mg/L dinyatakan kuat dan 100-150 mg/L dinyatakan sedang dan 150200 mg/L dinyatakan lemah. Klasifikasi hasil uji aktivitas antioksidan
dari masing-masing ekstrak dapat dilihat pada Tabel 4.4.
Tabel 4.4 Klasifikasi Nilai IC50 Ekstrak Daun Senduduk
Sampel Uji
IC50 (mg/L)
Ekstrak Metanol
Ekstrak Etil Asetat
Ekstrak n-Heksana
Klasifikasi
Sangat Kuat
29,3984
Sangat Kuat
Sangat Lemah
Universitas Sumatera Utara
43
Berdasarkan pada Tabel 4.4. tersebut, ekstrak metanol dan etil
asetat dari daun senduduk dapat dikatakan sebagai antioksidan yang
sangat kuat karena memiliki IC50 < 50 mg/L, sedangkan untuk
ekstrak n-heksana dikatakan sebagai antioksidan sangat lemah karena
memiliki nilai IC50 > 50 mg/L. Perbedaan aktivitas antioksidan ini
dipengaruhi dari sifat pelarut yang digunakan.
Pada penelitian ini pelarut yang digunakan adalah metanol, etil
asetat, dan n-heksana. Tujuan penggunaan tiga pelarut dengan
polaritas yang berbeda adalah untuk mendapatkan senyawa aktif dari
daun
senduduk
menggunakan
berdasarkan
pelarut
dengan
tingkat
kepolarannya.
kepolaran
yang
Ekstraksi
berbeda
akan
menghasilkan komponen senyawa yang berbeda sehingga sifat
antioksidan dan antibakteri yang dimiliki oleh setiap senyawa yang
diperoleh dari ekstraksi tersebut juga berbeda (Pambayun et al., 2007).
Ekstrak Etil asetat memiliki nilai IC50 lebih kecil karena etil
asetat mampu mengekstraksi senyawa fenolik pada daun senduduk.
Menurut Rahmat (2009) melaporkan bahwa pelarut etil asetat sangat
cocok untuk mengekstraksi senyawa fenolik. Kebanyakan senyawa
fenolik biasanya bersifat antioksidan, oleh karena itu pengukuran total
fenolik dapat digunakan untuk memperkirakan aktifitas antioksidan
suatu bahan.
Menurut Huang et al., (2005) aktivitas antioksidan berbanding
lurus dengan total fenol, semakin tinggi kandungan fenol dalam suatu
bahan semakin tinggi pula aktivitasnya sebagai antioksidan, Hal ini
sesuai dengan hasil yang diperoleh dimana ekstrak etil asetat dan
ekstrak metanol memiliki kandungan total fenolik yang lebih tinggi
dibandingkan dengan ekstrak n-heksana.
4.2.3
Aktivitas Antibakteri
Pada tabel 4.3 hasil penelitian antibakteri ekstrak metanol, etil
asetat dan n-heksana daun senduduk dengan metode difusi agar
terhadap bakteri E. coli dan S. aureus menyatakan bahwa masing-
Universitas Sumatera Utara
44
masing ekstrak tersebut hanya efektif untuk bakteri S. aureus yang
merupakan bakteri gram positif. Hal ini disebabkan tidak adanya
komponen aktif yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri E.coli
dari masing-masing ekstrak tersebut, sehingga dapat dinyatakan
bahwa ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun senduduk tidak
efektif terhadap bakteri E. coli.
Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol, etil
asetat dan n-heksana dapat dibuat kurva hubungan konsentrasi
(mg/mL) dengan diameter zona hambat (mm) terhadap bakteri S.
aureus.
Gambar 4.9 Kurva Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil
Asetat dan n-Heksana Daun Senduduk Terhadap
Bakteri S. aureus.
Dari Gambar 4.9, dapat dilihat kurva antara konsentrasi
(mg/mL) sebagai sumbu x dan zona hambat (mm) sebagai sumbu y.
Pada kurva tersebut dapat diketahui nilai zona hambat dari tiap-tiap
konsentrasi ekstrak n-heksana lebih tinggi dibanding ekstrak etil asetat
dan ekstrak metanol. Pada kurva tersebut dapat ditentukan ekstrak nheksana memiliki aktivitas antibakteri yang tinggi.
Universitas Sumatera Utara
45
Gambar 4.10 Grafik Perbandingan Zona Hambat dari Masing-Masing
Ekstrak Terhadap Bakteri S.Aureus
Berdasarkan Gambar 4.10 hasil pengujian dengan konsentrasi
500mg/mL diameter zona hambat terhadap bakteri S.aureus, ekstrak nheksana memiliki rata-rata diameter zona hambat yang paling besar bila
dibandingkan dengan ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol. Ekstrak nheksana, etil asetat dan metanol memiliki nilai 17,50 mm ;14,65 mm dan
14,20 mm. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana mengandung
komponen yang paling aktif bila dibandingkan dengan kedua ekstrak
lainnya terhadap bakteri S.aureus. Namun, berdasarkan hasil diameter
zona hambat ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol dapat
dikategorikan efektif dengan nilai antara 13 sampai dengan 17 mm.
Menurut Clinical and laboratory Standars Institute (2012)
menyatakan bahwa standar batas zona hambat antibiotik Cloramphenicol
yaitu diameter zona hambat ≥ 18 memiliki zona hambat sensitif atau
sangat efektif, antara 13 sampai dengan 17 mm memiliki zona hambat
intermediet atau efektif dan ≤ 12 mm memiliki zona hambat resisten atau
kurang efektif.
Besaran diameter zona hambat yang terbentuk dipengaruhi oleh
tinggi rendahnya senyawa atau zat aktif yang terkandung di dalam
ekstrak tersebut. Tinggi rendahnya suatu konsentrasi yang digunakan
tergantung pada jumlah kandungan bahan aktif yang terdapat di dalam
Universitas Sumatera Utara
46
bahan tersebut. Metabolit sekunder yang terkandung di dalam masingmasing ekstrak memiliki efektifitas yang berbeda dalam menghambat
pertumbuhan bakteri. Hal ini menyebabkan terjadinya perbedaan
aktivitas antibakteri dari masing-masing ekstrak.
Hasil penelitian menyatakan bahwa komponen yang terkandung di
dalam ekstrak n-heksana yang merupakan pelarut non polar memiliki
aktivitas antibakteri yang lebih efektif terhadap S.aureus. Menurut
Marjorie (1999) pelarut yang digunakan untuk ekstrak komponen aktif
dalam sampel akan melarutkan komponen aktif sesuai sifat dan
karakteristik pelarut. Untuk pelarut non polar seperti Chloroform
umumnya akan menarik komponen terpenoid dan flavonoid.
Ekstrak pelarut organik daun senduduk mengandung campuran
metabolit sekunder termasuk fenolik, saponin dan terpenoid/steroid.
Menurut Paiva (2010) molekul-molekul tersebut berhubungan dengan
sifat pertahanan dari tanaman tersebut, seperti perlindungan terhadap
cekaman biotik dan abiotik dan pemeliharaan struktur dari tanaman.
Pelarut polar seperti asam organik, semipolar, dan non polar digunakan
untuk mengekstrak kandungan metabolit sekunder pada tanaman yang
memiliki perbedaan dalam struktur polaritas. Ekstrak dari bahan tanaman
yang sama dengan pelarut yang memiliki karakteristik berbeda memiliki
sifat biologis yang berbeda.
Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi dan
metode pengenceran. Disc diffusion test atau uji difusi disk dilakukan
dengan mengukur diameter zona bening (clear zone) yang merupakan
petunjuk adanya respon penghambatan pertumbuhan bakteri oleh suatu
senyawa antibakteri dalam ekstrak. Syarat jumlah bakteri untuk uji
kepekaan/sensitivitas yaitu 105-108 CFU/mL (Hermawan dkk, 2007).
Mekanisme penghambatan antibakteri dapat dikelompokkan
menjadi lima, yaitu menghambat sintesis dinding sel mikrobia, merusak
keutuhan dinding sel mikroba, menghambat sintesis protein sel mikroba,
menghambat sintesis asam nukleat, dan merusak asam nukleat sel
mikrobia (Sulistyo, 1971).
Universitas Sumatera Utara
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Berdasarkan uji skrining fitokimia, daun senduduk mengandung senyawa
flavonoid, terpenoid, tanin dan saponin.
2. Aktivitas antioksidan daun senduduk ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat
(IC50= 29,3984mg/L ) lebih tinggi dibandingkan dengan ektrak padat
metanol
(IC50=35,3462mg/L),
dan
ekstrak
pekat
n-heksana
(IC50=348,7183mg/L).
3.
Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana,
ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat dan ekstrak padat metanol
memberikan diameter zona hambat yang efektif terhadap bakteri S.aureus
dengan diameter masing-masing 17,50 mm; 14,65 mm dan 14,20 mm pada
konsentrasi 500mg/L , dan tidak efektif terhadap bakteri E.coli. Ekstrak nheksana memiliki aktivitas antibakteri paling tinggi dibanding ekstrak padat
metanol dan ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat.
5.2 Saran
Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut untuk isolasi dan elusidasi struktur
komponen kimia yang memiliki sifat antioksidan dan antibakteri dari daun
senduduk.
Universitas Sumatera Utara
METODE PENELITIAN
3.1
Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
a. Neraca analitik digital
Mettler PM 480
b. Spektofotometer UV-Vis Shimadzu
c. Rotary evaporator
Buchi
d. Inkubator
Memmert
e. Autoklaf
Himaraya
f. Laminar air flow
Esco
g. Penangas air
h. Peralatan gelas
Pyrex
i. Pipet volume
Pyrex
j. Pipet tetes
k. Tabung reaksi
Pyrex
l. Cawan petri
m. Corong
n. Labu Ekstraksi
Pyrex
o. Labu Takar
Pyrex
p. Batang Pengaduk
q. Botol vial
r. Bulb Pipet
s. Blender
t. Gelas Beker
Pyrex
u. Erlenmeyer
Pyrex
v. Spatula
w. Statif dan klem
x. Kertas saring
Universitas Sumatera Utara
26
3.1.2 Bahan
Daun senduduk
Aquadest
Metanol
Etanol p.a
Etil asetat
n-Heksana
Diphenil Pikril Hidrazil (DPPH)
DMSO
Media Nutrien Agar
Media Mueller Hilton Agar
Media BHIB
Media Nutrien Broth
Asam Askorbat
FeCl3
NaOH
HCl
NH4OH
3.2
Prosedur Penelitian
3.2.1 Penyediaan Sampel
Daun yang diteliti adalah daun tumbuhan senduduk yang
diperoleh dari daerah Tapus, Kabupaten Panti, Sumatera Barat. Daun
tumbuhan senduduk ini dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan
sampai diperoleh serbuk sebanyak 500 g.
3.2.2 Ekstrak Daun Senduduk
Sebanyak 500 gram serbuk daun senduduk dimaserasi dengan
metanol selama 2x24 jam. Ekstrak metanol yang diperoleh ditampung
dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator pada suhu
60oC. Ekstrak pekat metanol yang diperoleh diekstraksi dengan
menggunakan etil asetat sehingga menghasilkan endapan dan ekstrak
Universitas Sumatera Utara
27
etil asetat. Endapan yang diperoleh berupa ekstrak padat metanol.
Ekstrak etil asetat yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary
evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat etil asetat. Ekstrak pekat
etil asetat dilarutkan dengan metanol kemudian diekstraksi partisi
dengan n-heksana sehingga terbentuk lapisan n-heksana dan metanol
fraksi etil asetat. Masing-masing fraksi n-heksana dan ekstrak metanol
fraksi fraksi etil asetat dipekatkan dengan alat rotari evaporator,
sehingga diperoleh ekstrak pekat n-heksana dan ekstrak pekat metanol
fraksi etil asetat.
3.2.3 Uji Antioksidan dengan Metode DPPH
3.2.3.1. Pembuatan Larutan DPPH 0,3 mM (BM=394,32g/mol)
Larutan DPPH 0,3 mM dibuat dengan melarutkan 11,82 mg
serbuk DPPH dalam etanol p.a kemudian dimasukkan ke dalam labu
takar 100 mL dan dicukupkan volumenya sampai tanda garis
kemudian dihomogenkan.
3.2.3.2. Pembuatan Variasi Ekstrak Daun Senduduk
a.
Ekstrak n-Heksana
Ekstrak pekat n-heksana dibuat larutan induk 1000 mg/L,
dengan melarutkan 0,025 g dengan pelarut etanol p.a dalam labu takar
25 mL. Larutan induk 1000 mg/L dilakukan pengenceran menjadi
larutan 100 mg/L, dari larutan 100 mg/L dibuat variasi konsentrasi
10,20,40,80 mg/L untuk uji aktivitas antioksidan.
Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap ekstrak padat
metanol dan ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat.
3.2.3.3. Pengujian Aktivitas Antioksidan
a. Pengujian larutan blanko
Sebanyak 1 mL larutan DPPH 0,3 mM ditambahkan 2,5
etanol
p.a
dimasukkan
kedalam
tabung
reaksi
dan
dihomogenkan. Dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap,
kemudian diukur absorbansinya dengan panjang gelombang
515nm.
Universitas Sumatera Utara
28
b. Pengujian aktivitas antioksidan sampel
Sebanyak 1 mL larutan DPPH 0,3 mM ditambahkan ke
dalam masing-masing tabung reaksi yang berisi 2,5 mL larutan
ekstrak n-Heksana dengan konsentrasi 10, 20, 40 dan 80 mg/L
dan dihomogenkan. Dibiarkan selama 30 menit pada ruang
gelap,kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang
maksimum 515 nm.
Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap variasi
ekstrak padat metabol dan ekstrak pekat metanol fraksi etil
asetat.
3.2.4. Uji Antibakteri Dengan Metode Difusi Agar
3.2.4.1. Pembuatan Media
a. Pembuatan media Nutrien Agar (NA)
Ditimbang sebanyak 20 g media NA kemudian disuspensikan
ke dalam aquadest 1000 mL lalu dipanaskan sampai larut
sempurna, kemudian dimasukkan masing-masing 10 mL media NA
ke dalam 10 tabung reaksi untuk pembuatan media agar miring.
Sterilkan media tersebut di dalam autoklaf pada suhu 121oC selama
15 menit.
b. Pembuatan media Nutrient Broth (NB)
Ditimbang sebanyak 13 g media NB dilarutkan ke dalam 100
mL aquadest. Dipipet masing-masing 10 mL ke dalam tabung
reaksi. Sterilkan media tersebut di dalam autoklaf pada suhu 121oC
selama 15 menit.
c. Pembuatan media Mueller Hilton Agar (MHA)
Sebanyak 19 g serbuk MHA dilarutkan dalam 500 mL
aquadest dan dipanaskan hingga larut. Sterilkan media tersebut di
dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
Universitas Sumatera Utara
29
3.2.4.2. Pembuatan Inokulum Bakteri
Koloni bakteri E.coli dan S.aureus diambil dari bank
mikrob menggunakan jarum ose kemudian disuspensikan ke
dalam NB yang telah steril lalu di inkubasikan pada suhu
35±2oC selama 24 jam.
3.2.4.3. Pembuatan Kultur Bakteri
Inokulum bakteri diinokulasi pada permukaan media NA
miring dengan jarum ose steril kemudian diinkubasi pada suhu
35±2 oC selama 24 jam.
3.2.4.4. Pembuatan Variasi ekstrak daun senduduk
Ekstrak n-Heksana
Sebanyak 2 g n-Heksana ditimbang kemudian dilarutkan ke
dalam DMSO 4 mL kemudian diaduk hingga larut sehingga
diperoleh
konsentrasi
500mg/mL.
Kemudian
dibuat
pengenceran dengan konsentrasi 400, 300, 200 dan 100 mg/mL.
Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap ekstrak padat
metanol dan ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat.
3.2.4.5. Pengujian Aktifitas Antibakteri
Sebanyak 20 mL media MHA dituang ke dalam cawan
petri steril kemudian dibiarkan sampai padat. Sebanyak 0,1 mL
inokulum digoreskan dengan steril swab ke dalam cawan petri
yang berisi media tersebut. Pada media yang telah digores
inokulum diletakkan kertas cakram yang telah dicelupkan pada
larutan uji dengan berbagai konsentrasi. Inkubasi pada suhu
35±2oC selama 18 -24 jam. Setelah itu diukur diameter daerah
zona bening sekitar cakram dengan menggunakan jangka
sorong. Lakukan pengujian yang sama untuk setiap ekstrak dan
variasi konsentrasi.
Universitas Sumatera Utara
30
3.3 Bagan Penelitian
3.3.1 Bagan Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Daun Senduduk
Ekstrak Metanol Daun Senduduk
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi secukupnya
Ditambah pereaksi untuk masing-masing uji
Alkaloid
Flavonoid
Tabung 1+pereaksi
meyer
Terpenoid
Ditambahkan
FeCl3 10%
Tabung 2+pereaksi
Dragendorf
Tanin
Saponin
Ditotolkan
pada KLT
Ditambah
Aquadest
Disemprotkan
dengan CeSO4
Dikocok
kuat-kuat
Ditambahkan
FeCl3 5%
Tabung 3+pereaksi
Bouchardat
Senyawa
Alkaloid
Negatif
Senyawa
Flavonoid
Positif
Senyawa
Terpenoid
Positif
Senyawa
Saponin
Positif
Senyawa
Tanin
Positif
Universitas Sumatera Utara
31
3.3.2 Pembuatan Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan n-Heksana Daun
Senduduk
500g Daun Senduduk
Diskrining fitokimia
Dimaserasi dengan metanol 4 L
selama 24 jam
Disaring
Larutan Metanol
Ampas
Diskrining fitokimia
Dipekatkan dengan
rotary evaporator
Ekstrak Pekat Metanol
Ditambah Etil Asetat
Disaring
Larutan Etil Asetat
Ekstrak Padat Metanol
Dipekatkan
Uji Antioksidan
dan Antibakteri
Ekstrak Pekat Etil Asetat
Dilarutkan dengan metanol
Dipartisi dengan n-Heksana
larutan metanol dari fraksi etil asetat
Hasil Pengujian
Larutan n-heksana
Dipekatkan
Dipekatkan
Ekstrak pekat metanol
fraksi Etil asetat
Ekstrak pekat n-Heksana
Uji Antioksidan
dan antibakteri
Uji Antioksidan
dan Antibakteri
Hasil Pengujian
Hasil pengujian
Universitas Sumatera Utara
32
3.3.3 Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Senduduk Dengan Metode
DPPH
3.3.3.1 Pembuatan larutan DPPH 0,3 mM
11,83 mg DPPH
Dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL
Ditambahkan etanol p.a hingga garis batas
Dihomogenkan
Simpan di tempat yang gelap
Larutan DPPH 0,3 mM
3.3.3.2 Pembuatan variasi konsentrasi masing-masing ekstrak
0,025 g ekstrak pekat n-Heksana
Dimasukkan ke dalam labu takar 25 mL
Ditambahkan etanol p.a hingga garis tanda
Dihomogenkan
Larutan induk 1000 mg/L
Dipipet 5 mL larutan induk 1000 mg/L
Dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL
Ditambahkan etanol p.a hingga garis tanda
Dihomogenkan
Larutan 100 mg/L
Dibuat variasi konsentrasi 10, 20, 40 dan 80 mg/L
Dibuat pengenceran
10 mg/L
dipipet 2,5 mL
dipipet 5.0 mL
dipipet 10 mL
dipipet 20 mL
dimasukkan ke
dalam labu takar
25 mL
dimasukkan ke
dalam labu takar
25 mL
dimasukkan ke
dalam labu takar
25 mL
dimasukkan ke
dalam labu takar
25 mL
ditambahkan
etanol p.a hingga
garis batas
ditambahkan
etanol p.a hingga
garis batas
ditambahkan
etanol p.a hingga
garis batas
ditambahkan
etanol p.a hingga
garis batas
dihomogenkan
dihomogenkan
dihomogenkan
dihomogenkan
20 mg/L
40 mg/L
80 mg/L
Catatan: Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap ekstrak padat metanol dan
ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat.
Universitas Sumatera Utara
33
3.3.3.4 Pengukuran nilai absorbansi blanko
1 mL larutan DPPH 0,3 mM
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Ditambah 2,5 mL etanol p.a
Dihomogenkan
Dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap
Diukur absorbansi pada panjang gelombang 515 nm
Hasil
3.3.3.5 Pengukuran nilai absorbansi sampel
1 mL larutan DPPH 0,3 mM
Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Ditambah 2,5 mL ekstrak n-heksana konsentrasi 10 mg/L
Dihomogenkan
Dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap
Diukur absorbansi pada panjang gelombang 515 nm
Hasil
Catatan: Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap variasi konsentrasi 20; 40;
dan 80 mg/L dari ekstrak n-heksana, ekstrak padat metanol dan ekstrak pekat
metanol fraksi etil asetat.
3.3.4 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Senduduk Dengan Metode
Difusi Agar
3.3.4.1 Pembuatan Media
a. Pembuatan Media Nutrien Agar
20g media NA (Nutrien Agar)
Disuspensikan dengan 1000mL aquadest
Dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih
Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit
Media NA steril
Universitas Sumatera Utara
34
b. Pembuatan Media Nutrien Broth
1,3 g media NB (Nutrien Broth)
Disuspensikan dengan 100 mL aquadest
Dipipet sebanyak 10 mL dan dimasukkan kedalam tabung
Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit
Media NB steril
c. Pembuatan Media MHA
19 g media MHA ( Mueller Hilton Agar)
Disuspensikan dengan 500 mL aquadest
Dipanaskan sambil diaduk hingga mendidih
Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit
Media MHA steril
3.3.4.2 Pembuatan Inokulum Bakteri
10 mL Media NB steril
Dimasukkan bakteri secara aseptik dengan jarum ose
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 C
Dibandingkan kekeruhan dengan standar Mcfarlan 510 nm
Inokulum Bakteri
3.3.4.3 Pembuatan Kultur Bakteri
Inokulum Bakteri E.coli
Diambil dengan jarum ose steril inokulum bakteri
Diinokulasi pada permukaan media NA miring
Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 C
Kultur Bakteri E. coli
Catatan: Perlakuan yang sama untuk pembuatan inokulum dan kultur bakteri
terhadap bakteri S. aureus
Universitas Sumatera Utara
35
3.3.4.4 Pembuatan Variasi Konsentrasi dari Masing-Masing Ekstrak
2000 mg ekstrak pekat n-Heksana
Dilarutkan dengan 4 mL DMSO
Dihomogenkan
Larutan 500 mg/mL
Dibuat variasi konsentrasi
400; 300; 200; dan 100 mg/mL
Dipipet 0,8 mL
Diencerkan dengan
0,2 mL DMSO
Dihomogenkan
Larutan
400 mg/mL
Dipipet 0,6 mL
Diencerkan dengan
0,4 mL DMSO
Dihomogenkan
Larutan
200 mg/mL
Dipipet 0,4 mL
Diencerkan dengan
0,6 mL DMSO
Dihomogenkan
Larutan
300 mg/mL
Dipipet 0,2 mL
Diencerkan dengan
0,8 mL DMSO
Dihomogenkan
Larutan
100 mg/mL
3.3.4.5 Pengujian Aktivitas Antibakteri
Media MHA pada cawan petri
Digoreskan kultur bakteri ke permukaan media MHA dengan menggunakan
cutton steril
Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan variasi konsentrasi
ekstrak n-Heksana
Diinkubasi selama 24 jam suhu 35 C
Diukur zona bening disekitar cakram dengan jangka sorong
Hasil
Catatan: Perlakuan yang sama juga dilakukan terhadap ekstrak padat metanol dan
ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Penelitian
4.1.1 Skrining fitokimia
Ekstrak metanol dari daun senduduk yang diperoleh diuji skrining
fitokimia untuk mengetahui adanya golongan senyawa alkaloid,
flavonoid, tanin, saponin, terpenoid yang ditujukan pada tabel 4.1.
Tabel 4.1 Hasil Uji Skrining Fitokimia Daun Senduduk
No
A
1
Metaboli Sekunder
Ekstrak Metanol
Alkaloid
2
3
Fenolik
Terpenoid
4
Saponin
Keterangan:
= Reaksi negatif
+
= Reaksi positif
++ = Reaksi positif kuat
Pereaksi
Hasil
Dragendorf
Bourchardat
Meyer
FeCl3
Ditotolkan pada KLT
disemprotkan CeSO4
aquadest
+
++
+
4.1.2 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan
Pengujian aktivitas antioksidan pada ekstrak padat metanol, ekstrak
metanol fraksi etil asetat dan ekstrak n-heksana dilakukan dengan metode
DPPH dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang 515 nm. Kemampuan antioksidan diukur dengan penurunan
serapan larutan DPPH dengan membaca nilai absorbansi dari masingmasing konsentrasi. Nilai % peredaman digunakan untuk menyatakan
nilai IC50 (Inhibitor Concentration) yaitu besarnya konsentrasi yang
menyebabkan hilangnya 50% aktivitas DPPH. Semakin kecil nilai IC50
maka semakin besar aktivitas antioksidannya. Berikut adalah hasil uji
antioksidan dari masing-masing ekstrak:
Universitas Sumatera Utara
37
Tabel 4.2 Nilai % Peredaman dan Nilai IC50 dari masing-masing ekstrak
Konsentrasi
Nilai % Peredaman
(mg/L)
Ekstrak Metanol
Ekstrak Etil Asetat
Ekstrak n-Heksana
0
0,0000
0,0000
0,0000
10
25,5576
23,3055
1,477
20
40,7063
49,1179
4,5178
40
54,5539
87,7437
6,0817
80
98,7918
93,4076
11,6420
Nilai IC50
35,3462 mg/L
29,3984 mg/L
348,7183 mg/L
4.1.3 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri pada ekstrak metanol, ekstrak
metanol fraksi etil asetat dan ekstrak n-heksana daun senduduk dilakukan
terhadap bakteri E. coli dan S. aureus dengan metoda difusi agar.
Berikut hasil uji aktivitas antibakteri masing-masing ekstrak dengan
konsentrasi tertentu.
4.1.3.1 Ekstrak Metanol
500 mg/mL
40
0
m
g/
m
200 mg/mL
100 mg/mL
100 mg/mL
20
0
m
g/
m
30
0
m
g/
m
50
0
m
g/
m
300 mg/mL
400 mg/mL
Gambar 4.1 Zona Hambat Ekstrak Metanol Terhadap Bakteri E.Coli
Universitas Sumatera Utara
38
100 mg/mL
100 mg/mL
200 mg/mL
200
mg
/mL
500
mg
/mL
500
mg
/mL
300
mg
/mL
300
mg
/mL
400 mg/mL
400 mg/mL
Gambar 4.2 Zona Hambat Ekstrak Metanol Terhadap Bakteri S. aureus
4.1.3.2 Ekstrak Pekat Metanol Fraksi Etil Asetat
300 mg/mL
500 mg/mL
100 mg/mL
400 mg/mL
200
mg
/mL
200
mg
/mL
500
mg
/mL
400
mg
/mL
300 mg/mL
100 mg/mL
Gambar 4.3 Zona Hambat Ekstrak Metanol Fraksi Etil Asetat Terhadap
Bakteri E.coli
500 mg/mL
200 mg/mL
100
mg
/mL
300
mg
/mL
400
mg
/mL
100
mg
/mL
400
mg
/mL
500 mg/mL
300 mg/mL
200 mg/mL
Gambar 4.4 Zona Hambat Ekstrak Metanol Fraksi Etil Asetat Terhadap
Bakteri S. aureus
4.1.3.3 Ekstrak Pekat n-Heksana
Universitas Sumatera Utara
39
100 mg/mL
200 mg/mL
100 mg/mL
500
mg
/mL
500
mg
/mL
200
mg
/mL
300
mg
/mL
400
mg
/mL
300 mg/mL
400 mg/mL
Gambar 4.5 Zona hambat Ekstrak n-Heksana terhadap bakteri E.coli
200 mg/mL
200 mg/mL
100 mg/mL
300
mg
/mL
100
mg
/mL
300
mg
/mL
500
mg
/mL
400 mg/mL
400
mg
/mL
500 mg/mL
Gambar 4.6 Zona Hambat Ekstrak n-heksana Terhadap Bakteri S. aureus
Hasil penelitian uji antibakteri dengan mengukur zona hambat dari
masing-masing konsentrasi. Hasil pengukuran diameter zona hambat dari uji
aktivitas antibakteri dapat dilihat Table 4.3 sebagai berikut:
Tabel 4.3. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan
n-Heksana Daun Senduduk
Diameter zona hambat (mm)
No Konsentrasi
Ekstrak
Ekstrak
Ekstrak
(mg/mL)
Etil Asetat
Metanol
n-Heksana
E.coli S.aureus E.coli S.aureus E.coli S.aureus
1
100
8,80
9,75
12,95
2
200
9,20
10,60
13,95
3
300
9,95
11,90
15,10
4
400
10,65
14,05
16,00
5
500
14,20
14,65
17,50
4.2 Pembahasan
4.2.1 Skrining Fitokimia
Universitas Sumatera Utara
40
Uji fitokimia bertujuan untuk mengidentifikasi kandungan senyawa
metabolit sekunder yang terdapat dalam sampel daun senduduk. Pada
tabel 4.1 hasil skrining fitokimia metabolit sekunder yang terkandung
dalam daun senduduk adalah flavonoid, fenolik, saponin, terpenoid dan
steroid, sedangkan untuk alkaloid diperoleh hasil yang negatif karena
sampel tidak mengalami perubahan warna yang sesuai dengan indikator.
Pengujian senyawa fenolik dilakukan dengan penambahan FeCl3
pada ekstrak metanol daun senduduk. Terjadi perubahan warna biru
kehitaman yang terjadi pada saat penambahan FeCl3 yang menyatakan
bahwa, daun senduduk mengandung senyawa fenolik. Perubahan warna
biru kehitaman disebabkan karena terjadinya reaksi FeCl3 dengan gugus
hidroksil yang ada pada senyawa fenolik.
Pada uji skrining fitokimia ekstrak daun senduduk, senyawa alkaloid
untuk uji Dragendorff, Mayer dan Bouchardat diperoleh hasil negatif, karena
tidak terbentuknya endapan pada tiap-tiap pereaksi yang ditambahkan.
Menurut Marliana (2005) terbentuknya endapan pada uji Meyer, Wagner ,
Dragendorff dan Bouchardat menandakan reaksi positif.
Pada pengujian terpenoid, hasil pada skrining fitokimia daun
senduduk menunjukkan hasil positif kuat dengan terjadinya perubahan
warna menjadi kecoklatan yang menunjukkan kandungan golongan
terpenoid. Analisis ini didasarkan pada kemampuan senyawa tersebut
membentuk warna dengan penambahan pereaksi CeSO4 1% dalam H2SO4
10%.
Hasil pengujian saponin pada ekstrak daun senduduk dengan
penambahan aquadest menunjukkan terbentuknya busa yang menyatakan
hasil positif. Menurut Robinson (1995) Saponin mengandung gugus
glikosida, timbulnya busa pada uji Forth menunjukkan adanya glikosida
yang mempunyai kemampuan membentuk buih dalam air yang terhidrolisis
menjadi glukosa dan senyawa lainnya.
Universitas Sumatera Utara
41
4.2.2 Aktivitas Antioksidan
Berdasarkan Tabel 4.2, hubungan nilai konsentrasi dengan %
peredaman dari ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana dapat dilihat
pada Gambar 4.7 di bawah ini.
Gambar 4.7 Kurva Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan
n-Heksana
Pada Gambar 4.7, dibuat persamaan regresi linear antara
konsentrasi mg/L sebagai sumbu x dengan nilai % peredaman sebagai
sumbu y, sehingga dari persamaan regresi tersebut dapat ditentukan
nilai IC50 dari masing-masing ekstrak. Pada persamaan regresi linear
tersebut, dapat diketahui nilai slope ekstrak etil asetat dan ekstrak
metanol adalah 1,1417 dan 1,1476 sehingga dapat dikatakan bahwa
aktivitas antioksidan kedua ekstrak tersebut hampir sama dan lebih
tinggi dari ekstrak n-heksana yang memiliki nilai slope 0,142.
Berdasarkan pada hasil pengujian aktivitas antioksidan dari
ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana dengan metode DPPH,
maka diperoleh nilai IC50 yang menunjukkan kekuatan aktivitas
antioksidan dari masing-masing ekstrak. Hal tersebut dapat dilihat
pada
Gambar
4.8
berikut::
Universitas Sumatera Utara
42
Gambar 4.8 Grafik Perbandingan Nilai IC50 Masing-Masing Ekstrak
Pada Gambar 4.8 diatas, aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat
lebih kuat dibanding ekstrak metanol dan ekstrak n-heksana. Kekuatan
aktivitas antioksidan berbanding terbalik dengan nilai IC50 yaitu,
semakin tinggi nilai IC50, maka semakin lemah aktivitas antioksidan
pada ekstrak tersebut dan sebaliknya semakin rendah nilai IC50 maka
semakin kuat aktivitas antioksidannya. Nilai IC50 merupakan
kemampuan senyawa antioksidan menangkap 50% radikal bebas
DPPH.
Hasil pengujian aktivitas antioksidan daun senduduk ekstrak
metanol, etil asetat dan n-heksana dapat diklasifikasikan berdasarkan
nilai IC50. Menurut Mulyani (2016), suatu senyawa dikatakan sebagai
antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 kurang dari 50 mg/L, 50-100
mg/L dinyatakan kuat dan 100-150 mg/L dinyatakan sedang dan 150200 mg/L dinyatakan lemah. Klasifikasi hasil uji aktivitas antioksidan
dari masing-masing ekstrak dapat dilihat pada Tabel 4.4.
Tabel 4.4 Klasifikasi Nilai IC50 Ekstrak Daun Senduduk
Sampel Uji
IC50 (mg/L)
Ekstrak Metanol
Ekstrak Etil Asetat
Ekstrak n-Heksana
Klasifikasi
Sangat Kuat
29,3984
Sangat Kuat
Sangat Lemah
Universitas Sumatera Utara
43
Berdasarkan pada Tabel 4.4. tersebut, ekstrak metanol dan etil
asetat dari daun senduduk dapat dikatakan sebagai antioksidan yang
sangat kuat karena memiliki IC50 < 50 mg/L, sedangkan untuk
ekstrak n-heksana dikatakan sebagai antioksidan sangat lemah karena
memiliki nilai IC50 > 50 mg/L. Perbedaan aktivitas antioksidan ini
dipengaruhi dari sifat pelarut yang digunakan.
Pada penelitian ini pelarut yang digunakan adalah metanol, etil
asetat, dan n-heksana. Tujuan penggunaan tiga pelarut dengan
polaritas yang berbeda adalah untuk mendapatkan senyawa aktif dari
daun
senduduk
menggunakan
berdasarkan
pelarut
dengan
tingkat
kepolarannya.
kepolaran
yang
Ekstraksi
berbeda
akan
menghasilkan komponen senyawa yang berbeda sehingga sifat
antioksidan dan antibakteri yang dimiliki oleh setiap senyawa yang
diperoleh dari ekstraksi tersebut juga berbeda (Pambayun et al., 2007).
Ekstrak Etil asetat memiliki nilai IC50 lebih kecil karena etil
asetat mampu mengekstraksi senyawa fenolik pada daun senduduk.
Menurut Rahmat (2009) melaporkan bahwa pelarut etil asetat sangat
cocok untuk mengekstraksi senyawa fenolik. Kebanyakan senyawa
fenolik biasanya bersifat antioksidan, oleh karena itu pengukuran total
fenolik dapat digunakan untuk memperkirakan aktifitas antioksidan
suatu bahan.
Menurut Huang et al., (2005) aktivitas antioksidan berbanding
lurus dengan total fenol, semakin tinggi kandungan fenol dalam suatu
bahan semakin tinggi pula aktivitasnya sebagai antioksidan, Hal ini
sesuai dengan hasil yang diperoleh dimana ekstrak etil asetat dan
ekstrak metanol memiliki kandungan total fenolik yang lebih tinggi
dibandingkan dengan ekstrak n-heksana.
4.2.3
Aktivitas Antibakteri
Pada tabel 4.3 hasil penelitian antibakteri ekstrak metanol, etil
asetat dan n-heksana daun senduduk dengan metode difusi agar
terhadap bakteri E. coli dan S. aureus menyatakan bahwa masing-
Universitas Sumatera Utara
44
masing ekstrak tersebut hanya efektif untuk bakteri S. aureus yang
merupakan bakteri gram positif. Hal ini disebabkan tidak adanya
komponen aktif yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri E.coli
dari masing-masing ekstrak tersebut, sehingga dapat dinyatakan
bahwa ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun senduduk tidak
efektif terhadap bakteri E. coli.
Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol, etil
asetat dan n-heksana dapat dibuat kurva hubungan konsentrasi
(mg/mL) dengan diameter zona hambat (mm) terhadap bakteri S.
aureus.
Gambar 4.9 Kurva Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil
Asetat dan n-Heksana Daun Senduduk Terhadap
Bakteri S. aureus.
Dari Gambar 4.9, dapat dilihat kurva antara konsentrasi
(mg/mL) sebagai sumbu x dan zona hambat (mm) sebagai sumbu y.
Pada kurva tersebut dapat diketahui nilai zona hambat dari tiap-tiap
konsentrasi ekstrak n-heksana lebih tinggi dibanding ekstrak etil asetat
dan ekstrak metanol. Pada kurva tersebut dapat ditentukan ekstrak nheksana memiliki aktivitas antibakteri yang tinggi.
Universitas Sumatera Utara
45
Gambar 4.10 Grafik Perbandingan Zona Hambat dari Masing-Masing
Ekstrak Terhadap Bakteri S.Aureus
Berdasarkan Gambar 4.10 hasil pengujian dengan konsentrasi
500mg/mL diameter zona hambat terhadap bakteri S.aureus, ekstrak nheksana memiliki rata-rata diameter zona hambat yang paling besar bila
dibandingkan dengan ekstrak etil asetat dan ekstrak metanol. Ekstrak nheksana, etil asetat dan metanol memiliki nilai 17,50 mm ;14,65 mm dan
14,20 mm. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana mengandung
komponen yang paling aktif bila dibandingkan dengan kedua ekstrak
lainnya terhadap bakteri S.aureus. Namun, berdasarkan hasil diameter
zona hambat ekstrak n-heksana, etil asetat dan metanol dapat
dikategorikan efektif dengan nilai antara 13 sampai dengan 17 mm.
Menurut Clinical and laboratory Standars Institute (2012)
menyatakan bahwa standar batas zona hambat antibiotik Cloramphenicol
yaitu diameter zona hambat ≥ 18 memiliki zona hambat sensitif atau
sangat efektif, antara 13 sampai dengan 17 mm memiliki zona hambat
intermediet atau efektif dan ≤ 12 mm memiliki zona hambat resisten atau
kurang efektif.
Besaran diameter zona hambat yang terbentuk dipengaruhi oleh
tinggi rendahnya senyawa atau zat aktif yang terkandung di dalam
ekstrak tersebut. Tinggi rendahnya suatu konsentrasi yang digunakan
tergantung pada jumlah kandungan bahan aktif yang terdapat di dalam
Universitas Sumatera Utara
46
bahan tersebut. Metabolit sekunder yang terkandung di dalam masingmasing ekstrak memiliki efektifitas yang berbeda dalam menghambat
pertumbuhan bakteri. Hal ini menyebabkan terjadinya perbedaan
aktivitas antibakteri dari masing-masing ekstrak.
Hasil penelitian menyatakan bahwa komponen yang terkandung di
dalam ekstrak n-heksana yang merupakan pelarut non polar memiliki
aktivitas antibakteri yang lebih efektif terhadap S.aureus. Menurut
Marjorie (1999) pelarut yang digunakan untuk ekstrak komponen aktif
dalam sampel akan melarutkan komponen aktif sesuai sifat dan
karakteristik pelarut. Untuk pelarut non polar seperti Chloroform
umumnya akan menarik komponen terpenoid dan flavonoid.
Ekstrak pelarut organik daun senduduk mengandung campuran
metabolit sekunder termasuk fenolik, saponin dan terpenoid/steroid.
Menurut Paiva (2010) molekul-molekul tersebut berhubungan dengan
sifat pertahanan dari tanaman tersebut, seperti perlindungan terhadap
cekaman biotik dan abiotik dan pemeliharaan struktur dari tanaman.
Pelarut polar seperti asam organik, semipolar, dan non polar digunakan
untuk mengekstrak kandungan metabolit sekunder pada tanaman yang
memiliki perbedaan dalam struktur polaritas. Ekstrak dari bahan tanaman
yang sama dengan pelarut yang memiliki karakteristik berbeda memiliki
sifat biologis yang berbeda.
Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi dan
metode pengenceran. Disc diffusion test atau uji difusi disk dilakukan
dengan mengukur diameter zona bening (clear zone) yang merupakan
petunjuk adanya respon penghambatan pertumbuhan bakteri oleh suatu
senyawa antibakteri dalam ekstrak. Syarat jumlah bakteri untuk uji
kepekaan/sensitivitas yaitu 105-108 CFU/mL (Hermawan dkk, 2007).
Mekanisme penghambatan antibakteri dapat dikelompokkan
menjadi lima, yaitu menghambat sintesis dinding sel mikrobia, merusak
keutuhan dinding sel mikroba, menghambat sintesis protein sel mikroba,
menghambat sintesis asam nukleat, dan merusak asam nukleat sel
mikrobia (Sulistyo, 1971).
Universitas Sumatera Utara
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Berdasarkan uji skrining fitokimia, daun senduduk mengandung senyawa
flavonoid, terpenoid, tanin dan saponin.
2. Aktivitas antioksidan daun senduduk ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat
(IC50= 29,3984mg/L ) lebih tinggi dibandingkan dengan ektrak padat
metanol
(IC50=35,3462mg/L),
dan
ekstrak
pekat
n-heksana
(IC50=348,7183mg/L).
3.
Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana,
ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat dan ekstrak padat metanol
memberikan diameter zona hambat yang efektif terhadap bakteri S.aureus
dengan diameter masing-masing 17,50 mm; 14,65 mm dan 14,20 mm pada
konsentrasi 500mg/L , dan tidak efektif terhadap bakteri E.coli. Ekstrak nheksana memiliki aktivitas antibakteri paling tinggi dibanding ekstrak padat
metanol dan ekstrak pekat metanol fraksi etil asetat.
5.2 Saran
Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut untuk isolasi dan elusidasi struktur
komponen kimia yang memiliki sifat antioksidan dan antibakteri dari daun
senduduk.
Universitas Sumatera Utara