OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR KUERSETIN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK DALAM TEH HIJAU

  OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR KUERSETIN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI KADAR KUERSETIN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI KADAR KUERSETIN MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) FASE TERBALIK DALAM TEH HIJAU DALAM TEH HIJAU DALAM TEH HIJAU SKRIPSI SKRIPSI SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Ilmu Farmasi Program Studi Ilmu Farmasi Program Studi Ilmu Farmasi Oleh: Oleh: Oleh: Alfonsus Rosario Heppy Dwiyoga Alfonsus Rosario Heppy Dwiyoga Alfonsus Rosario Heppy Dwiyoga 088114056 088114056 088114056 FAKULTAS FARMASI FAKULTAS FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA UNIVERSITAS SANATA DHARMA UNIVERSITAS SANATA DHARMA

  “Jadilah seperti pohon yang ditanam ditepi aliran air, yang menghasilkan buah pada musimnya, dan tidak layu daunnya, serta apa yang diperbuatnya pun berhasil ” (Mazmur 1: 3)

  : Karya ini kupersembahkan untuk Bapak dan Ibu sebagai rasa syukur atas kasih sayang yang berlimpah Kakakku Festy untuk perhatian, semangat, dan dukungannya Teman - teman Almamaterku

  

PRAKATA

Puji Syukur kepada Tuhan Yesus Kristus dan Bunda Maria berkat kasih

karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian serta penyusunan

skripsi yang berjudul “Optimasi dan Validasi Metode Penetapan Kadar Kuersetin

Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik dalam Teh

Hijau” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan

mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta.

  Dalam pelaksanaan penelitian hingga penyusunan skripsi ini, penulis banyak

mendapatkan dukungan dari banyak pihak. Maka dari itu, penulis ingin mengucapkan

terima kasih kepada:

  

1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta.

  

2. C.M. Ratna Rini Nastiti, M.Pharm., Apt. selaku Ketua Program Studi Fakultas

Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta yang turut memberikan saran dan masukan untuk penulis selama tahap penelitian.

  

3. Prof. Dr. Sri Noegrahati Apt, selaku Dosen pembimbing yang telah memberikan

pengarahan, bantuan, tuntunan, kritik, dan saran sejak awal penelitian hingga akhir penyusunan skripsi ini.

  

4. Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si. dan Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen

penguji atas segala masukan dan bimbingannya.

  5. Rini Dwiastuti, M.Sc., atas segala bantuan dalam perijinan penggunaan lab.

  6. Pak Sanjaya, dan Bu Dewi, atas segala ilmu yang diberikan.

  

7. Segenap dosen yang telah berkenan membagikan ilmu kepada penulis selama

belajar di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  

8. Anasthasia Mardila Puspita atas semua waktu, kesabaran, bantuan serta

dukunganmu.

  

9. Teman seperjuangan skripsi: Paulus Setya Dharma, Anasthasia Filipa Veritas da

Silva, Adi Wirasaputra untuk kesabaran, kebersamaan dan suka dukanya.

  

10. Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto, Mas Kethul Ismadi, Mas Ottok dan seluruh

staf laboratorium Fakultas Farmasi serta staf keamanan dan kebersihan Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas bantuan dan kerjasamanya.

  

11. Teman seperjuangan di laboratorium Kimia Analisis Instrumentasi : Ussi, Seco,

Vica, Satya, Sasa, Dimas, Novi, Ike, Yuni dan Elisa,

  

12. Teman-teman FST A 2008 dan seluruh angkatan 2008 atas dukungan dan suka

duka yang diberikan, khususnya Rika, Elya, Widi, Pherty, dan Sisca Devi.

  Semoga pengalaman yang telah kita lalui bersama bisa menjadi bekal untuk perjuangan hidup kita kelak.

  

13. Seluruh pihak, yang tidak dapat disebutkan satu per satu atas yang telah

membantu penulis dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi.

  Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penelitian dan

penyusunan skripsi ini mengingat keterbatasan dan kemampuan penulis, sehingga

  

sangat diharapkan adanya masukan dan saran yang membangun untuk penulis.

Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan berguna bagi dunia ilmu

pengetahuan.

  Penulis

  DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL …………………………………………………… i HALAMAN ii PERSETUJUAN……………………………………………......................

  HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………… iii HALAMAN PERSEMBAHAN………………………………………… iv - PERNYATAAN KEASLIAN KARYA………………………………….

• LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA…………………….
• PRAKATA……………………………………………………………....
• DAFTAR ISI…………………………………………………………….
• DAFTAR TABEL……………………………………………………….
• DAFTAR GAMBAR……………………………………………………. DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………….. -
• INTISARI………………………………………………………………..

  

ABSTRACT……………………………………………………………… -

BAB I. PENGANTAR…………………………………………………...

  1 A. Latar Belakang………………………………………………….

  1 1. Perumusan masalah …………………………………………….

  4 2. Keaslian Penelitian …………………………………………..

  5

  3. Manfaat penelitian …………………………………………

  5 B. Tujuan Penelitian ……………………………………………….

  6 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA …………………………………...

  7 A. Teh Hijau………………………………………..……………….

  7 B. Kuersetin…... ………………………………………………...………

  8 C. Spektrofotometri Ultraviolet……...…………………………………..

  9 D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi………………………………

  11 I. Definisi dan instrumentasi …………………………………..…..

  11 II. Analisis Optimasi KCKT ………………………………………..

  17 III. Validasi Metode Analisis………………………………………….

  25 E. Landasan teori …………………………………………………..

  28 F. Hipotesis …………………………………………………………

  29 BAB III. METODE PENELITIAN …………………………………….

  30 A. Jenis dan rancangan penelitian ………………………………….

  30 B. Variabel dan Defonisi Operasional………………………………

  30 C. Bahan-bahan Penelitian ………………………………………..

  31 D. Alat-Alat Penelitian ……………………………………………..

  31 E. Tatacara Penelitian ……………………………………………..

  32

  1. Penyiapan fase gerak akuabides : methanol : asam fosfat 5%

  32 2. Pembuatan seri larutan baku kuersetin ………………………..

  34 3. Pembuatan Sampel …………………………………………….

  35 4. Optimasi KCKT fase terbalik…………………………………..

  35 5. Validasi Metode KCKT Fase Terbalik………………………….

  36 F. Analisis Hasil Optimasi ……………………………………………..

  36

  1. Panjang Gelombang Maksimum……………………………

  36

  2. Analisis kualitatif ……………………………………………

  36 3. Analisis pemisahan puncak kuersetin…………. …………..

  36 a. Daya pisah (Resolusi)……………………………….

  37

  b. Jumlah lempeng (N) dan HETP……………………………

  37 c. Bentuk Puncak………….………………….……………….

  38 G. Analisis Hasil Validasi………………………………………………

  39 a. Linearitas dan rentang……………………………………..

  39 b. LOD……………………………………………….

  39 c. Repeatability……………………………………....

  39

  d. Uji perbandingan t pada teh hijau adisi 20mg, teh hitam tanpa

  40 R adisi dan teh segar tanpa adisi.

  BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ……………………………………

  41 A. PREPARASI SISTEM KCKT………………………………………

  41 1. Pemilihan Pelarut ……………………………………………….

  41

  2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Kuersetin ………

  41 3. Penyiapan Fase Gerak …………………………………………..

  44

  4. Penyiapan Larutan Kerja untuk Optimasi………………………

  47 B. Optimasi Komposisi dan Kecepatan Alir Fase Gerak dalam

  48 pemisahan Kuersetin dengan Metode KCKT Fase Terbalik a. Fase Gerak akuabides : metanol : asam fosfat 5% (44 : 55 : 1)

  55 dengan flow rate 0,8; 1,0; dan 1,2 mL/menit……………..

  b. Fase Gerak akuabides : metanol : asam fosfat 5% (49 : 50 : 1)

  58 dengan flow rate 0,8; 1,0 dan 1,2 mL/menit ……………… c. Fase Gerak akuabides : metanol : asam fosfat 5% (54 : 45 : 1) .

  61 dengan flow rate 0,8; 1,0 dan 1,2 mL/menit ……………….. C. Validasi Metode Analisis…………………………………………

  63

  1. Repeatability waktu retensi (t ) dan Area Under Curve (AUC)

  63 R

  2. Hubungan linearitas sinyal detektor terhadap konsentrasi

  64 kuersetin……………………………………………………….

  3. Kurva baku……………………………………………………

  69 4. Limit of Detection (LOD)…………………………………….

  71 5. Linearitas…………………………………………...

  76 D. Aplikasi Metode Penetapan Kadar Kuersetin Dalam Teh Segar, Hijau,

  77 dan Hitam…………….…………………………………………….

  1. Teh segar …………………………………………………….

  77 2. Teh hijau…………….……………………………………….

  79

  3. Teh hitam…………….………………………………………

  80

  4. Resolusi……………………………………………

  82 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ………………………………...

  84 A. Kesimpulan ……………………………………………………..

  84 B. Saran ……………………………………………………………

  84 DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………

  85 LAMPIRAN ……………………………………………………………..

  88 - BIOGRAFI PENULIS ………………………………………………….

  

DAFTAR TABEL

  66 Tabel XII Perbandingan rentang……………………………………………

  81 Tabel XXI Resolusi sampel…………………………………………………..

  79 Tabel XX Presisi teh hitam …………………………………………………

  78 Tabel XIX Presisi teh hijau ………………………………………….………

  77 Tabel XVIII Presisi teh segar ……………………………………….…………

  72 Tabel XVII Hubungan r terhadap n………………………………….……….

  71 Tabel XVI Regresi linear pada rentang bawah………………………………

  70 Tabel XV Regresi linear pada rentang tengah………………………………

  67 Tabel XIV Standar deviasi rentang………………………………………….

  66 Tabel XIII Uji Signifikansi…………………………………………………

  64 Tabel XI Batasan range…………………………………………………….

  Halaman

  64 Tabel X Repetisi terhadap AUC…………………………………………

  52 Tabel IX Repetisi terhadap waktu retensi……………………………….

  51 Tabel VIII parameter Tf, N, HETP dan Resolusi………………………….

  47 Tabel VII Pengamatan waktu retensi……………………………………..

  43 Tabel VI Indeks polaritas fase gerak…………………………………….

  33 Tabel V Serapan baku kuersetin dalam pelarut methanol…………….

  27 Tabel IV Komposisi optimasi fase gerak……………………………….

  26 Tabel III %RSD menurut Horwitz dan AOAC…………………………

  14 Tabel II Parameter validasi untuk tiap kategori analisis (Snyder et al., 2010)…………………………………………………………..

  Tabel I Nilai indeks polaritas beberapa pelarut pada KCKT fase terbalik

  82

  

DAFTAR GAMBAR

  25 Gambar 11. Perhitungan nilai resolusi menurutMunson (1991)…………..

  Kromatogram pemisahan kuersetin dalam daun teh hijau (Camellia sinensis O.K.) dengan komposisi fase gerak

  57 Gambar 17.

  Kromatogram pemisahan kuersetin dalam daun teh hijau (Camellia sinenis O.K.)dengan komposisi fase gerak akuabides : metanol : asam fosfat 5% (44 : 55 : 1)……………………….

  43 Gambar 16.

  42 Gambar 15. Struktur auksokrom dan kromofor dari kuersetin…………

  42 Gambar 14 Spektrogram kuersetin 10ppm……………………………

  38 Gambar 13. Spektrogram kuersetin 5ppm……………………………

  37 Gambar 12. Perhitungan tailing factor dan asymetri factor……………

  24 Gambar 10. Perhitungan tailing factor dan asymetri factor……………

  Halaman Gambar 1. Teh hijau……………………………………………………..

  23 Gambar 9. Transfer massa pada fase gerak (Willard et al., 1988)……..

  23 Gambar 8. Transfer massa pada fase diam (Willard et al., 1988)………

  20 Gambar 7 Difusy Eddy (Noegrohati,1994)…………………………….

  19 Gambar 6. Pengukuran efeisiensi Kromatografi dari puncak Gaussian

  Perhitungan nilai resolusi dengan W1/2h (Munson, 1991)..

  18 Gambar 5.

  12 Gambar 4. Pengukuran resolusi dua puncak………………………………..

  9 Gambar 3. Diagram sistem KCKT………………………………………

  7 Gambar 2. Struktur Kuersetin…………………………………………..

  60

  1)……………………………………………………………. .Kromatogram pemisahan kuersetin dalam daun teh hijau Gambar 18. (Camellia sinensis O.K) dengan komposisi fase gerak

  62 akuabides : metanol : asam fosfat 5% (49 : 50 : 1)……………. Gambar 19

  64 Hubungan konsentrasi larutan baku kuersetin dengan sinyal detektor Gambar 20 Kurva linearitas rentang bawah………………………………..

  68 Gambar 21 Kurva linearitas rentang tengah………………………………..

  68 Gambar 22 Kurva linearitas atas……………………………………………

  69 Gambar 23

  71 Plot kurva rentang tengah…………………………………………….. Gambar 24.

  72 Plot kurva rentang bawah…………………………………………….. Gambar 25. Ilustrasi pencarian LOD…………………………………

  73 Gambar 26. Ilustrasi pemisahan Blanko dan LOD…………………..

  74 Gambar 27 Kromatogram teh segar …………………………………

  78 Gambar 28 Kromatogram teh hijau …………………………………

  79 Gambar 29 Kromatogram teh hitam ………….…………………….

  80

DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1. COA KUERSETIN…………………………………………….

  89 Lampiran 2. Contoh spektrogram scaning panjang gelombang maksimum

  90 kuersetin………………………………………………………. Lampiran 3. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase

  91 gerakmakuabides : methanol : asam fosfat 5% (44 : 55 :1)….. Lampiran 4. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase

  94 gerakmakuabides : methanol : asam fosfat 5% (49 : 50 :1)……. Lampiran 5. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase

  98 gerakmakuabides : methanol : asam fosfat 5% (54 : 45 :1)……. Lampiran 6. Nilai Tailing Factor (Tf) puncak Kuersetin pada fase gerak 100 akuabides : methanol : asam fosfat 5% dan contoh perhitungan. Lampiran 7. Nilai N dan HETP dari puncak Kuersetin pada fase gerak 101 akuabides : methanol : asam fosfat 5% dan contoh perhitungan Lampiran 8. Nilai Resolusi (Rs) puncak kuersetin pada sampel daun teh hijau adisi 20ppm dengan fase gerak akuabides : methanol : 102 asam fosfat 5% dan contoh perhitungan……………………..

  Lampiran 9. Kromatogram linearitas dan rentang kuersetin, menggunakan fase gerak dan flowrate hasil optimasi yaitu akuabides : 104 methanol : asam fosfat (54 : 45 : 1)……………………………. Lampiran 10. Perhitungan regresi linearitas menggunakan powerfit dan 111 pembagian range……………………………………………….. Lampiran 11.

  Penimbangan baku kuersetin………………………………….. 112 Lampiran 13. Perhitungan regresi linear rentang bawah dan rentang tengah menggunakan powerfit………………………………………..

  117 Lampiran 14. Data presisi dan contoh perhitungannya……………………….. 118 Lampiran 15. Perhitungan % RSD persamaan Horwitz………………………. 119 Lampiran 16. Perhitungan LOD……………………………………………… 120 Lampiran 17. Contoh Kromatogram Hasil Uji repeatability………………...... 121

  

INTISARI

  Kuersetin merupakan salah satu golongan flavonoid yang terdapat dalam teh hijau dimana memiliki khasiat utama sebagai antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum dan validitas dari metode KCKT itu sendiri sehingga dapat digunakan dalam penetapan kadar kuersetin dalam teh hijau. Sistem KCKT fase terbalik menggunakan kolom C18 dengan pengoptimasian fase gerak akuabides : methanol : asam fosfat 5%. (44 : 55 :1), (49 : 50 : 1) dan (54 : 45 : 1) serta mengubah-ubah flow rate yaitu 0,8; 1,0; 1,2mL/menit dengan detektor ultraviolet pada λmaks 370 nm.

  Hasil penelitian ini menunjukkan kuersetin dalam sampel teh dapat dipisahkan dengan metode KCKT fase terbalik. Kondisi optimum sistem KCKT yang diperoleh adalah k o m p o s i s i fase gerak akuabides : methanol : asam fosfat 5% (54 : 45 : 1) pada flow rate 1,0 mL/menit. Kondisi optimum tersebut mampu menghasilkan waktu retensi (t R ) 15.495 menit, nilai resolusi 8.64, tailing factor (Tf) 1.75, lempeng teoritis (N) 3989dan HETP 0.003760. Serta regresi linear y = 15390 + 49598 x dengan koefisien korelasi (r) 0.995 pada rentang bawah dan regresi linear y = -368905 + 61532 x dengan koefisien korelasi (r) 0.999pada rentang tengah, LOD 0.377ppm, waktu retensi pada sampel (t R ) 15.746. Kata kunci : kuersetin, optimasi dan validasi metode KCKT fase terbalik

  

ABSTRACT

Quercetin is a flavonoid in green tea which has a very potent antioxidant. The

aim from this study is to determine the optimum conditions and the validity of the

  

HPLC method so that the assay can be used to analyse quercetin in green tea.

Reversed-phase HPLC system using C18 column with optimization is done by

varying the composition of mobile phase from aquabidest: methanol: phosphoric acid

5%. (44: 55: 1), (49: 50: 1) and (54: 45: 1) as well as varying the flow rate is 0,8; 1,0;

1,2 mL / min with a UV detector λ maximum at 370 nm.

  The results showed quercetin in samples of green tea may be separated by

reversed-phase HPLC method. The optimum conditions were obtained by HPLC

system with mobile phase aquabidest: methanol: 5% phosphoric acid (54: 45: 1) at

flow rate 1.0 mL / min. Optimum conditions are able to produce retention time t at

  R

15.495 minutes, the value of resolution was 8.64, the tailing factor (Tf) was 1.75,

with theoretical plates (N) 3989 and HETP was 0.003760. With validation result

  = 15390 + 49598x 0.995 at and

  equation y coefficient correlation (r) lowest range

  y = -368905+ 61532x 0.999 at middle range

  

equation coefficient correlation (r) , LOD at

0.377ppm, and retention time (t ) for sample at 15.746.

  R Keyword: quercetin, optimization and validation method of HPLC reversed phase

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Dewasa ini kesadaran masyarakat akan tingkat kesehatan mengalami

  

kemajuan, hal tersebut tampak dalam berbagai usaha untuk meningkatkan kesehatan

maupun mencegah penyakit yang mulai banyak diterapkan baik secara modern

maupun tradisional. Kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi serta perubahan pola

hidup terutama di kota – kota besar menjadikan tubuh lebih rentan terhadap penyakit,

terutama yang berkaitan dengan radikal bebas. Kerusakan akibat radikal bebas dapat

menimbulkan berbagai macam penyakit, diantaranya adalah penyakit jantung,

katarak, reumatik, penyakit pada otak, ginjal, paru – paru, sistem pencernaan, dan

imun. Akibat lain yang ditimbulkan adalah penurunan kualitas hidup serta

mempercepat proses penuaan. Dalam keadaan ini diperlukan suatu substansi yang

dapat mengurangi maupun menjaga tubuh dari radikal bebas yang disebut sebagai

senyawa antioksidan.

• – Secara turun temurun masyarakat membuat ramuan dengan

  memanfaatkan berbagai tanaman berkhasiat yang tersedia di lingkungan. Indonesia

  merupakan salah satu negara di dunia yang kaya akan keanekaragaman sumber daya

  alam hayatinya, maka tidak dapat dipungkiri bahwa penggunaan obat tradisional yang

  2

  Teh merupakan tanaman berkhasiat yang jumlahnya melimpah di

Indonesia, dimana untuk pembudidayaannya itu sendiri sedang dalam usaha

pencapaian maksimum. Sediaan teh juga sangat erat dalam kehidupan sehari – hari

masyarakat Indonesia, dimana pengkonsumsiannya paling banyak digunakan dalam

bentuk minuman. Hal tersebut dikarenakan kebiasaan maupun kenyamanan yang di

tawarkan dari sediaan teh itu sendiri, serta besar khasiatnya yang dipercaya secara

turun – temurun. Sebagai contoh, biasanya teh digunakan sebagai minuman

penyambut tamu. Selain itu teh oleh beberapa kalangan dipercaya dapat memberikan

umur yang panjang.

  Dewasa ini dikenal berbagai hasil pengolahan teh diantaranya adalah teh

hijau (green tea) dan teh hitam (black tea). Teh hijau merupakan produk olahan dari

teh segar, dalam pembuatannya melibatkan proses pelayuan secara cepat untuk

mencegah adanya proses oksidasi dari enzim yang terdapat dalam teh. Sedangkan teh

hitam merupakan sediaan teh dengan melibatkan proses fermentasi dalam

pembuatannya.

  Flavonoid banyak terdapat pada tanaman, tak terkecuali untuk tanaman teh,

dimana flavonid berfungsi sebagai penarik serangga yang membantu penyerbukan,

membantu fotosintesis, antimikroba dan antivirus. Salah satu senyawa yang termasuk

dalam golongan flavonoid tersebut adalah kuersetin. Kuersetin merupakan senyawa

polifenol dengan aktivitas utama sebagai antioksidan dan penangkal radikal bebas.

  3

  Penelitian ini memfokuskan terhadap senyawa kuersetin yang terkandung

dalam teh hijau, dimana peneliti mencoba untuk mengkaji kandungan kuersetin dalam

teh hijau menggunakan instrumentasi kromatografi. Instrumentasi kromatografi yang

digunakan adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Pemilihan KCKT

sebagai media untuk analisis kuersetin dikarenakan KCKT memiliiki selektifitas,

sensitifitas dan daya pisah yang baik.

  KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk

analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang

antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri - industri

makanan. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa seperti :

asam – asam amino, asam – asam nukleat, kadar senyawa aktif obat, produk hasil

samping proses sintesis. KCKT merupakan metode tidak destruktif dan dapat

digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif (Gandjar dan Rohman,

2007).

  Penelitian ini merupakan satu rangkaian penelitian yaitu “Optimasi Proses

Ekstraksi Kuersetin Total pada Teh Hijau dengan Metode KLT Densitometri” oleh

Dharma (2012) dan “Optimasi clean up ekstrak methanol air teh hijau dengan

menggunakan metode Solid Phase Extraction untuk Mendukung Penetapan Kadar

Kuersetin dalam Teh Hijau dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)” oleh

Wirasaputra (2012) dilanjutakn dengan “Validasi Metode dan Penetapan Kadar

  4

  Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Fase Terbalik” oleh Silva (2012).

  Pada penelitian Tosuglu (2003), pernah dilakukan penetapan kadar kuersetin

dari buah tomat. Metode yang digunakan dalam penetapan kadarnya berbeda karena

pada penelitian Tosuglu ini menggunakan RP-HPLC dan GC – MS dengan fase gerak

25:75 (v/v) acetonitril–pH 2.4 buffer fosfat (25% acetonitrile in 0.025 M NaH PO )

  2

  4

sebagai fase gerak pada flow rate of 1.2 mL/min sedangkan penelitian yang akan

dilakukan menggunakan sampel teh hijau dengan komponen penyusun fase gerak

akuabides : methanol : as fosfat.

  Untuk menjamin bahwa metode KCKT fase terbalik yang akan dilakukan

dalam menetapkan kadar kuersetin dalam teh hijau telah memenuhi acceptance

criteria, maka perlu dilakukan validasi metode. Beberapa parameter yang harus

dianalisis antara lain akurasi, presisi, linearitas, rentang, dan spesifisitas.

1. Perumusan masalah

  

a. Bagaimanakah kondisi optimal dari sistem KCKT fase terbalik dengan

mengubah komposisi fase gerak dan flow rate yang mampu menghasilkan pemisahan dengan nilai resolusi ≥ 1.5 terhadap peak terdekat, memiliki nilai angka lempeng (N) yg besar, bentuk peak simetri, serta nilai HETP yang semakin kecil?

  5

  

b. Apakah optimasi metode KCKT fase terbalik yang digunakan mempunyai

validitas yang baik untuk menetapkan kadar kuersetin dalam sampel teh hijau

didasarkan pada parameter repeatability, presisi, linearitas, rentang dan LOD ?

  2. Keaslian penelitian Sejauh pengetahuan penulis, penelitian tentang kuersetin dalam teh hijau

sudah ada yang melakukan yaitu pada penelitian Hplc–Uv And Gc–Ms Characterization

  Of The Flavonol Aglycons Quercetine , Kaempferol, And Myricetin In Tomato Pastes

And Other Tomato-Based Products oleh Tosuglu , O., Unal, M.K.,and Yildrim, Z.,

  

(2003). Namun untuk optimasi dan validasi metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

untuk penetapan kadar kuersetin dalam teh hijau menggunakan fase gerak campuran

akuabides : methanol : asam fosfat 5% (54 : 45 : 1) belum pernah dilakukan.

  3. Manfaat penelitian

  

a. Manfaat teoritis. Dengan penelitian ini dapat memberikan informasi atau

sumbangan pada ilmu pengetahuan tentang optimasi dan validasi metode KCKT fase

terbalik dalam aplikasinya untuk menetapkan kadar kuersetin.

  .

  

b. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

bahwa metode KCKT fase terbalik ini dapat digunakan dalam aplikasinya untuk

menetapkan kadar kuersetin.

  

c. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan tambahan informasi

bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang kefarmasian menetapkan kadar kuersetin

  6

  

dalam suatu bahan alam, tanaman, atau bahkan sediaan farmasi menggunakan metode

KCKT fase terbalik.

B. Tujuan Penelitian

  Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah mengetahui kondisi sistem KCKT

yang optimal dan tervalidasi agar dapat digunakan untuk menetapkan kadar kuersetin

dalam teh hijau.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Teh Hijau Keterangan Botani Menurut Rehder, (1949)

  tanaman teh (Camellia sinensis O.K.) termasuk dalam Famili Theaceae (cit.,Steenis, 1975). Teh merupakan pohon dengan ketinggian 5 – 10 m, namun karena pemangkasan kerapkali seperti

  Gambar 1. Teh (Camellia sinensis O.K.)

  perdu. Ujung ranting dan daun

  sumber : penced 10.com

  muda berambut halus. Daun tersebar, tunggal ; helaian daun elliptis memanjang, dengan pangkal runcing, bergerigi seperti kulit tipis ukuran 2 – 6cm. Bunga diketiak berkelamin 2 dengan garins tengah 3-4 cm, sangat harum dan putih cerah. Daun mahkota pada pangkalnya melekat ringan. Benang sari berlingkaran banyak, yang terluar pada pangkalnya bersatu, melekat dengan daun mahkota, yang terdalam lepas. Tangkai putik bercabang 3. Buah kotak berkayu lebarnya lebih dari panjangnya, biji berjumlah 1-3 (Lawrence,1951).

  Teh hijau memiliki banyak khasiat antara lain menurunkan kolesterol darah, mengurangi kadar gula dalam darah, menurunkan berat badan, mencegah arthritis, kerusakan hati, gigi berlubang, dan keracunan, dan juga sebagai antioksidan, antikanker, antimikroba. Khasiat utama teh berasal dari senyawa polifenol yang secara optimal terkandung dalam daun teh yang masih muda. Daun teh hijau memiliki kandungan 15-30% senyawa polifenol. Teh hijau diolah melalui inaktivasi enzim polifenol oksidase yang terdapat di dalam daun teh tanpa mengalami proses fermentasi. Hal ini berbeda dengan teh lainnya yang mengalami proses semifermentasi maupun fermentasi (Desvina, 2007).

B. Kuersetin

  Teh hijau memiliki daya tarik tersendiri di kalangan konsumen, hingga saat ini sangat digemari karena khasiatnya dalam menjaga kesehatan tubuh.

  Flavonoid merupakan senyawa fenolik yang dihasilkan oleh tumbuhan dan merupakan metabolit sekunder. Flavonoid secara luas telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan, antimikroba, antimutagenik, serta anti kanker. Flavonoid dapat ditemukan dimanapun dari tanaman pangan (Hossain dan Rahman, 2009)

  Kuersetin merupakan salah satu komponen dari golongan flavonoid, yang diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Kuersetin merupakan senyawa berwarna kuning dan menjadi anhydrat pada suhu 95 - 97° C.Kelarutan : larut dalam asam asetat glasial, dalam larutan aqueous alkaline dan praktis tidak larut dalam air (The Merck Index, 1989). Kuersetin memiliki gugus fungsi karbonil dan hidroksil sehingga dapat mengbentuk kompleks dengan beberapa ion logam (Makasheva, 2005).

  Kuersetin (3’,4’-dihidroksiflavonol) merupakan senyawa flavonoid dari kelompok flavonol dan terdapat terutama pada tanaman teh, tomat, apel, kakao, anggur dan bawang. Kuersetin-3-glukosida (isokuersetin), kuersetin-3-rhamnoside (kuersitrin), dan kuersetin-3-rutinoside (rutin) adalah glikosida kuersetin. Flavonol kuersetin, mirisetin, robinitin, dan gossipetin memiliki sifat antioksidan yang amat potensial

  Selain bermanfaat sebagai antioksidan, kuersetin memiliki banyak manfaat pada kesehatan manusia yakni perlindungan kardiovaskular, aktivitas antikanker, antibisul, aktivitas antialergi, mencegah terjadinya katarak, serta memiliki efek antiinflamasi (Cahanar dan Suhanda, 2006).

  Gambar 2, Struktur kuersetin (Nuengchamnong, 2004)

C. Spektrofotometri Ultraviolet

  Serapan cahaya molekul dalam daerah spektrum ultraviolet dan visible tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Spektrofotometri ultraviolet dan visible dari senyawa – senyawa organik berkaitan erat dengan transisi – transisi biasanya antara orbital ikatan atau orbital pasangan elektron bebas dan orbital non ikatan tak jenuh atau orbital non ikatan. Terdapat keuntungan yang selektif dari serapan ultraviolet, yaitu gugus – gugus karakteristik dapat dikenal dalam molekul yang sangat kompleks (Sastrohamidjojo, 2002)