Penetapan kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat merk ``X`` menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik - USD Repository
PENETAPAN KADAR TEOBROMIN DAN KAFEIN DALAM EKSTRAK
SERBUK COKELAT MERK “X” MENGGUNAKAN METODE
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) d elete the image and then insert it again. hav e been corrupted. Restart y our computer, and then open the file again. I f the red x still appears, y ou may hav e to The image cannot be display ed. Your computer may not hav e enough memory to open the image, or the image may Program Studi Farmasi
Oleh: Melisa Darmawan
NIM : 088114162
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
HALAMAN PERSEMBAHAN
Kupersembahkan karyaku ini untuk: Tuhan Yesus Kristus yang sangat luar biasa Kedua orang tuaku tersayang Kakak-kakakku tercinta Sahabat dan teman-temanku Almamater yang kubanggakan
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas segala limpahan berkat dan kasih-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Ekstrak Serbuk Cokelat Merk “X” Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini, penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Ipang Djunarko, M. Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M. S., Apt. selaku dosen pembimbing yang dengan sabar memberikan pengarahan, masukan, kritik dan saran baik selama penelitian maupun penyusunan skripsi ini.
3. Jeffry Julianus, M. Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membangun dalam penyusunan skripsi dan dosen pembimbing akademik atas bimbingan dan semangat yang telah diberikan.
4. Lucia Wiwid Wijayanti, M. Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membangun dalam penyusunan skripsi.
5. Rini Dwiastuti, M. Sc, Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
6. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan ilmu demi kemajuan mahasiswa dalam bidang farmasi.
7. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma: Mas Bimo, Mas Parlan, Mas Kunto, Mas Otok, dan Pak Ketul yang telah banyak membantu selama penelitian di laboratorium.
8. Perpustakaan Universitas Sanata Dharma atas koleksi buku-buku dan fasilitas internet sehingga mempermudah penulis dalam memperoleh bahan-bahan yang dibutuhkan dalam penulisan skripsi ini.
9. Keluargaku tercinta, Papa Iwan Darmawan, Mama Maria Ningrum D, Mam Christiana, Tante Lian, Ci Fen2, Oh Rudy, Ci Cen2, yang tidak pernah berhenti memberikan semangat dan doa sampai terselesaikannya skripsi ini.
10. Eka Riusinta Wati dan Monica Satya R. Y, teman seperjuangan, tempat berbagi keluh kesah dan kegembiraan selama penelitian dan penyusunan skripsi.
11. Keluarga kedua sekaligus sahabat-sahabatku Sari Tambunan, Novie Imoliana, Ade Mauryn, Devi Sinaga, Mariana, Octo Rahadian Pius, Ana Sofiana, Agnes Fajarwati, Cornelius Brian, Sisca Devi, dan Gary. Terima kasih untuk semangat, kebersamaan, canda, tawa, suka, duka yang telah kita lalui bersama.
12. Grup “antistress” Yuni Rogan, Elisa Aster, Dhimas Bayu Kinasih, Rosita Secoadi, Vinsencia Vica, Heppy, Paul, Adi Wirasaputra, Velly, Novie
Imoliana, dan Meiske Munda. Terima kasih untuk diskusi dan kebersamaannya selama penelitian di laboratorium.
13. Kelompok praktikum C
2 , Dian, Yuni, Elisa, Seco, Uchan, Satya, Vica, Asti,
dan Tika yang telah memberikan pengalaman berharga, keceriaan, kebersamaan, suka duka selama praktikum serta telah memberikan semangat dalam penyusunan dan ujian skripsi.
14. Sari Tambunan, Elya, Rika, Dina, Amel, Wiwik, There, Citra, Nona yang telah berbagi pengalaman, informasi, masukan, serta telah memberikan semangat dan dukungan secara moril.
15. Teman-teman FST A dan B atas kebersamaan, tawa, canda, cerita dan kekompakan yang begitu indah dan tak terlupakan.
16. Keluarga besar kost “Sari Ayu I”, Ibu Anti, Opung Devi, Morin, Novie, Marjan, Inang, Monik, Kak Yanti, Nina, Rotua, Yoestenia, Iness, Kak Ade, Vina, Ika Lestari, dan Jolina atas semangat yang diberikan kepada penulis dalam penyusunan dan ujian skripsi.
17. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah membantu penulis dalam mewujudkan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, sehingga segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Semoga skripsi ini membantu dan bermanfaat bagi pembaca pada khususnya dan ilmu pengetahuan pada umumnya.
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL ……………………………………………………… i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING …………………….……. ii HALAMAN PENGESAHAN ……………………………………….…… iii HALAMAN PERSEMBAHAN …………………………………….……. iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA …………………………………. v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ….. vi PRAKATA ………………………………………………………..………. vii DAFTAR ISI ………………………………………………..…………….. x DAFTAR TABEL ……………………………………………..………….. xiv DAFTAR GAMBAR ………………………………………..…………….. xv DAFTAR LAMPIRAN ………………………………………..………….. xvii
INTISARI ………………………………………………..………………... xviii
ABSTRACT …………………………………………………..……………. xix
BAB I. PENGANTAR …………………………………………..………...1 A. Latar Belakang …………………………………………………..……..
1 1. Permasalahan ………………………………………………..……..
5 2. Keaslian Penelitian …………………………………………..…….
5 3. Manfaat Penelitian ……………………………………………..…..
6 B. Tujuan Penelitian ………………………………………………..……..
6 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA …………………………………….
8
A.
8 Cokelat (Theobroma cocoa) …...………………………………………
B. Penyarian ………………………………………………………………
9 1. Ekstrak ……………………………………………………………..
10 2. Cairan Penyari ………………………………...…………………...
10 3. Metode Ekstraksi secara Soxhletasi ……………………………….
11 C. Teobromin ……………………………………………………………..
13 D. Kafein ……………………………………………………………...…..
14 E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ……………………………………..
16
1. Definisi dan Instrumentasi …………………………………………
16 2. Pembagian Jenis Kromatografi …………………………………….
17 3. Kromatografi Partisi ……………………………………………….
18 4. Pemisahan Puncak dalam Kromatografi ……...…………………...
23
5. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif …………………………………
25 F. Keterangan Empiris ……………………………………………………
26 BAB III. METODE PENELITIAN ……………………………………….
28 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ………………………………………..
28 B. Variabel Penelitian …………………………………………………….
28 C. Definisi Operasional …………………………………………………...
29 D. Bahan Penelitian ……………………………………………………….
29 E. Alat Penelitian …………………………………………………………
30 F. Tata Cara Penelitian …………………………………………………...
30 1. Pemilihan Sampel ………………………………………………….
30
3.
31 Pembuatan Larutan Stok Teobromin dan Kafein ………………….
4. Pembuatan Larutan Intermediet Teobromin dan Kafein …………..
31 5. Pembuatan Seri Larutan Baku Campuran Teobromin dan Kafein ...
32
6. Penetapan Panjang Gelombang Maksimum Teobromin dan Kafein dengan Spektrofotometer UV ……………………………………..
32 7. Pembuatan Kurva Baku Teobromin dan Kafein …………………..
33 8. Pembuatan Larutan NaOH 0,1 M ………………………………….
33
9. Penetapan Jumlah Sirkulasi Ekstraksi dengan Metode Soxhletasi yang Menghasilkan Kadar Teobromin dan Kafein Maksimum …...
33 10. Preparasi Sampel …………………………………………………..
34
11. Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Sampel dengan Penambahan Larutan Baku Campuran Teobromin dan Kafein…….
35 12. Penetapan Kadar Campuran Teobromin dan Kafein dalam Sampel.
36 G. Analisis Hasil …………………………………………………………..
37 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN …………………………………
38 A. Pemilihan Sampel ……………………………………………………...
38 B. Pembuatan Fase Gerak ………………………………………………...
40 C. Pembuatan Larutan Baku Teobromin dan Kafein ……………………..
42 D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Teobromin dan Kafein dengan Spektrofotometer UV ………………………………………….
44 E. Pembuatan Kurva baku Teobromin dan Kafein ……………………….
47 F. Preparasi Sampel Serbuk Cokelat dengan Ekstraksi secara Soxhletasi .
48 Cokelat yang Menghasilkan Kadar Maksimum ……………………….
53 H. Analisis Kuallitatif Berdasarkan Waktu Retensi (t R ) Teobromin dan Kafein ………………………………………………………………….
57 I. Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Sampel dengan Penambahan Larutan Baku Campuran Teobromin dan Kafein ………..
61 J. Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Ekstrak Serbuk Cokelat …………………………………………………………………
62 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ………………………………….
64 A. Kesimpulan …………………………………………………………….
64 B. Saran …………………………………………………………………...
64 DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………..
66 LAMPIRAN ……………………………………………………………….
70 BIOGRAFI PENULIS ……………………………………………………. 100
DAFTAR TABEL
Tabel I Indeks polaritas beberapa pelarut ………………………………..22 Tabel II Pembuatan larutan campuran teobromin dan kafein …………….
36 Tabel III Persyaratan keseragaman bobot kemasan serbuk cokelat ……….
39 Tabel IV Kadar rata-rata teobromin pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi ………………………………………………………….
55 Tabel V Kadar rata-rata kafein pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi.
56 Tabel VI Perhitungan kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat …………………………………………………………...
63
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1 Cokelat (Theobroma Cacao) ………………………………...42 Gambar 11 Interaksi trietilamin dengan residu silanol dalam kolom C 18 ..
48 Gambar 16 Reaksi pembasaan teobromin menggunakan larutan NaOH 0,1 M ……………………………….......................................
48 Gambar 15 Kurva hubungan antara jumlah kafein dengan respon AUC ...
45 Gambar 14 Kurva hubungan antara jumlah teobromin dengan respon AUC …………………………………………………………
C) dengan λ maks = 275 nm ……….
o
45 Gambar 13 Spektra serapan teobromin dan kafein dalam pelarut akuabides panas (suhu 80
42 Gambar 12 Gugus kromofor dan auksokrom teobromin dan kafein ……..
24 Gambar 10 Struktur trietilamin ………………………………..................
8 Gambar 2 Diagram Soxhlet extractor ………………………………......
20 Gambar 9 Pemisahan dua senyawa ………………………………..........
20 Gambar 8 Reaksi pembuatan kolom oktadesilsilan …………………….
18 Gambar 7 Reaksi silanasi ……………………………….........................
17 Gambar 6 Mekanisme pemisahan kromatografi partisi ………………...
14 Gambar 5 Peralatan KCKT ………………………………......................
14 Gambar 4 Struktur kafein ……………………………...……..................
11 Gambar 3 Struktur teobromin ………………………………..................
51 Gambar 17 Reaksi pembasaan kafein menggunakan larutan NaOH 0,1 M 51 Gambar 18 Kurva hubungan antara jumlah sirkulasi ekstraksi vs kadar
teobromin (% b/b) pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi.
54 Gambar 19 Kurva hubungan antara jumlah sirkulasi ekstraksi vs kadar kafein (% b/b) pada penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi …..
55 Gambar 20 Kromatogram baku campuran teobromin (60 ppm) dan kafein (30 ppm) ……………………………….......................
57 Gambar 21 Kromatogram sampel ekstrak serbuk cokelat ……………….
58 Gambar 22 Gugus non polar teobromin dan kafein ……………………...
59 Gambar 23 Interaksi teobromin dengan fase diam C
18 melalui interaksi van Der Waals ……………………………….........................
59 Gambar 24 Interaksi kafein dengan fase diam C
18 melalui interaksi van Der Waals ………………………………................................
60 Gambar 25 Interaksi teobromin dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60, v/v) melalui interaksi hidrogen .
60 Gambar 26 Interaksi kafein dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60, v/v) melalui interaksi hidrogen ………………...
61
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Sertifikat analisis teobromin ………………………………..71 Lampiran 2 Sertifikat analisis kafein ……………………………………
72 Lampiran 3 Penimbangan serbuk cokelat tiap kemasan untuk perhitungan keseragaman bobot sampel serbuk cokelat…….
73 Lampiran 4 Penimbangan sampel serbuk cokelat ……………………….
74 Lampiran 5 Penimbangan bobot tetap ekstrak cokelat …………………..
76 Lampiran 6 Kromatogram sampel penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi ..
78 Lampiran 7 Kromatogram sampel menggunakan 34 kali sirkulasi ……...
86 Lampiran 8 Data kadar teobromin penentuan jumlah sirkulasi …………
90 Lampiran 9 Data kadar kafein penentuan jumlah sirkulasi ……………...
92 Lampiran 10 Data kadar teobromin dan contoh perhitungan kadar teobromin …………………………………………………...
94 Lampiran 11 Data kadar kafein dan contoh perhitungan kadar kafein …...
96 Lampiran 12 Perhitungan konversi kadar teobromin dan kafein dalam kemasan (45 gram) …………………………………………
98 Lampiran 13 Perhitungan CV teobromin dan kafein dalam sampel ……...
99
INTISARI
Teobromin dan kafein merupakan dua komponen yang terdapat dalam serbuk cokelat. Kombinasi teobromin dan kafein dalam suatu sediaan dapat meningkatkan efek farmakologis yang diberikan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah sirkulasi ektraksi yang menghasilkan kadar maksimum dan menetapkan kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental deskriptif. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang digunakan adalah suatu sistem dengan kondisi optimal dan memenuhi parameter validasi. Sistem KCKT fase terbalik yang optimal menggunakan fase diam Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-5C
18 ) merek KNAUER dimensi 250 mm x 4,6 mm,
ukuran partikel 5 µ m, fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60, v/v), kecepatan alir 0,8 mL/ menit dengan detektor UV pada λ maks 275 nm.
Jumlah sirkulasi ekstraksi yang memberikan kadar teobromin dan kafein yang maksimum adalah sebanyak 37 kali sirkulasi. Kadar teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat yang diteliti, yaitu 0,11 % (b/b) dengan nilai CV = 2,10% untuk teobromin dan 0,09 % (b/b) dengan nilai CV = 1,98% untuk kafein.
Kata kunci: teobromin, kafein, KCKT fase terbalik, soxhletasi, penetapan
kadar, serbuk cokelat
ABSTRACT
Theobromine and caffeine are two components in chocolate powder. The combination of theobromine and caffeine in a product can increase the pharmacologic effect. This study aims to determine the concentration maximum extraction circulation and determine theobromine and caffeine in cocoa powder extract using High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
This study is an experimental descriptive. The reversed phase High Performance Liquid Chromatography (HPLC) which is used is a system with optimum condition and fulfill the validation parameters. The optimal conditions of HPLC system is used stationary phase chromasil octadecylsylane C-18 (100-
5C- ) 5 µm merk KNAUER 250 mm x 4.6 mm, mobile phase methanol :
18
aquabides/TEA 3% (40 : 60, v/v), flow rate 0.8 mL/min with UV detector at wavelength 275 nm.
The extraction circulation amount which provide the maximum concentration of theobromine and caffeine is 37 circulations. The concentration of theobromine and caffeine in chocolate powder are 0.11% (w/w) with the value of CV = 2.10% for theobromine and 0.09% (w/w) with the value of CV = 1.98% for caffeine. Keywords: theobromine, caffeine, reverse phase HPLC, soxhletasi, determination, cocoa powder
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Cokelat merupakan makanan yang tidak asing lagi di tengah masyarakat
sekarang ini, bahkan cokelat merupakan makanan yang digemari segala usia mulai dari anak-anak sampai orang tua. Perkembangan teknologi membuat cokelat tidak hanya dinikmati dalam bentuk buah cokelat saja, namun sekarang ini cokelat dapat diolah menjadi beranekaragam bentuk makanan, diantaranya cokelat batangan, permen cokelat, biskuit cokelat, ice cream, minuman, dan serbuk cokelat (Mutiara, 2011). Serbuk cokelat merupakan salah satu bentuk cokelat yang sering digunakan sebagai campuran dalam pembuatan beranekaragam makanan, antara lain roti cokelat, pudding cokelat, dan susu cokelat.
Banyak masyarakat menggemari berbagai makanan yang terbuat dari cokelat, namun hanya sedikit orang yang mengetahui kandungan dalam cokelat yang sering mereka konsumsi. Cokelat merupakan makanan yang terbuat dari biji buah kakao (cacao) yang dijemur atau dikeringkan selanjutnya digiling dan ditambahkan bahan-bahan lainnya seperti mentega, gula dan susu bubuk, melewati beberapa proses produksi hingga menghasilkan batangan-batangan cokelat (Utami, 2011).
Cokelat mengandung dua komponen utama, yaitu: teobromin dan kafein. Efek farmakologis teobromin serupa dengan kafein, tetapi dalam jumlah yang mengandung teobromin dibandingkan kafein. Walau tidak terdapat dasar yang kuat, kebanyakan ilmuwan percaya bahwa efek stimulan kombinasi teobromin dan kafein dalam cokelat adalah dua kali lebih besar dibanding kafein (Weinberg el al ., 2010).
Kafein yang selama ini dikenal oleh masyarakat luas menimbulkan efek negatif, namun pada kenyataanya kafein bersama dengan teobromin mempunyai daya kerja positif sebagai stimulan sistem syaraf pusat, stimulan otot jantung, meningkatkan aliran darah melalui arteri koroner, relaksasi otot polos bronki, dan aktif sebagai diuretika dengan tingkatan yang berbeda. Daya kerja sebagai stimulan sistem syaraf pusat kafein sangat menonjol sehingga umumnya digunakan sebagai stimulan sentral (Qiqi, 2001). Efek rangsangan yang dihasilkan oleh cokelat berasal dari efek kombinasi teobromin dan kafein (Utami, 2011).
Kandungan teobromin dan kafein dalam cokelat, khususnya serbuk cokelat akan menimbulkan dampak positif atau negatif, tergantung dari kadar yang ada dalam serbuk cokelat. Kandungan teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat yang belum diketahui oleh masyarakat inilah yang seharusnya diketahui kadarnya secara pasti supaya masyarakat lebih bijak dalam mengkonsumsi serbuk cokelat. Masyarakat tidak hanya menjadikan cokelat sebagai makanan kegemaran, namun cokelat akan menjadi makanan yang memberikan dampak positif bagi tubuh bila digunakan secara tepat.
Penelitian ini juga ingin membuktikan apakah benar dalam serbuk cokelat yang dianalisis mengandung teobromin dan kafein sebagai unsur utama, sehingga dapat dipastikan bahwa produk cokelat yang dihasilkan mengandung teobromin dan kafein tidak sekedar menggunakan pewarna cokelat.
Penetapan kadar teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat harus melalui beberapa tahap, antara lain dengan mengekstraksi serbuk cokelat supaya didapatkan kandungan teobromin dan kafein yang terpisah dari komponen lain yang tidak dikehendaki. Sistem ekstraksi yang dipilih adalah metode soxhletasi karena lebih praktis, hanya kemungkinan kecil zat yang diekstraksi hilang selama proses ekstraksi (Khopkar, 1990), cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit daripada metode ekstraksi lainnya sehingga diperoleh hasil ekstrak yang lebih pekat (Mitra, 2003), dan senyawa teobromin dan kafein merupakan senyawa yang tahan terhadap panas (Anonim, 1986). Proses soxhletasi serbuk cokelat akan menggunakan penyari klorofom karena teobromin dan kafein mempunyai kelarutan yang tinggi dalam klorofom. Metode soxhletasi juga memerlukan penentuan jumlah sirkulasi ekstraksi, karena jumlah sirkulasi merupakan parameter konstan yang dapat diamati, dengan menggunakan kondisi yang sama (suhu, jenis dan jumlah pelarut) pada masing-masing proses ekstraksi. Hal ini dilakukan supaya senyawa teobromin dan kafein dalam sampel serbuk cokelat dapat terambil seluruhnya.
Ekstrak serbuk cokelat yang diperoleh dengan cara soxhletasi akan ditetapkan kadarnya dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik karena teobromin dan kafein memiliki kepolaran yang berbeda, sehingga dapat dipisahkan karena adanya interaksi antara yang bersifat polar. Selain itu, KCKT juga memiliki kelebihan yaitu cepat, sensitif dan memiliki daya pisah yang baik (Jhonson and Stevenson, 1978). Metode KCKT yang digunakan harus tervalidasi sebelumnya untuk memberikan jaminan terhadap hasil penetapan kadar pada sampel sehingga dapat dipercaya kebenarannya.
Penelitian ini mengacu dari penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh Wati (2012) tentang optimasi komposisi dan flow rate fase gerak pada penentuan kadar teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat dengan menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase terbalik. Hasil optimasi yang didapat pada sistem KCKT yang optimum menggunakan fase gerak campuran metanol : akuabides/TEA 3% dengan komposisi 40 : 60 (v/v), fase diam Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-5C
18 ) merek KNAUER dimensi 250 mm
x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µ m dengan kecepatan alir 0,8 mL/menit. Selain itu, penelitian ini juga mengacu pada penelitian yang telah dilakukan oleh Yunita (2012) tentang validasi metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi fase terbalik pada penetapan kadar teobromin dan kafein dalam serbuk cokelat merk “X” yang memenuhi syarat parameter validitas yang baik, meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, dan presisi. Hal tersebut yang mendasari penelitian Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Ekstrak Serbuk Cokelat Merk “X” Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat disusun permasalahan sebagai berikut:
1. Berapakah jumlah sirkulasi ekstraksi serbuk cokelat merk “X” dengan menggunakan metode soxhletasi yang menghasilkan kadar teobromin dan kafein maksimum?
2. Berapakah kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat merk “X” hasil penetapan menggunakan metode KCKT fase terbalik?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh penelusuran pustaka yang penulis lakukan, telah dilakukan penetapan kadar teobromin dan kafein dalam berbagai produk kopi menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan fase gerak metanol : akuabides/bufer ammonium asetat pH 7,5 dengan perbandingan 20 : 80 (v/v), fase diam Phenomenex Kinetex 2.6 um XB C-18, kecepatan alir 1,0 mL/menit, detektor UV pada panjang gelombang maksimum 272 nm oleh Czech et al.
(2011). Penetapan kandungan metilksantin dan polifenol dalam produk cokelat pernah dilakukan menggunakan metode KCKT, dengan fase gerak metanol : akuabides : asam asetat (20 : 79 : 1, v/v), fase diam µ-Bondapak 10 µ m (30 cm x 4,0 mm), kecepatan alir 1,0 mL/min oleh Ramli et al. (2001).
Penelitian mengenai Penetapan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Ekstrak Serbuk Cokelat Merk “X” Menggunakan Metode Kromatografi Cair
3. Manfaat Penelitian
Penelitian yang dilakukan oleh penulis, diharapkan dapat bermanfaat sebagai berikut: a. Manfaat Teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan terhadap ilmu pengetahuan tentang penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi dengan metode soxhletasi dan tentang metode KCKT sehingga dapat digunakan untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein.
b. Manfaat Metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi prosedur penetapan jumlah sirkulasi ekstraksi dengan metode soxhletasi yang menghasilkan kadar maksimum dan penggunaan metode KCKT fase terbalik dalam penetapan kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat merk “X”.
c. Manfaat Praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai jumlah sirkulasi ektraksi menggunakan metode soxhletasi yang memberikan kadar teobromin dan kafein yang maksimal dalam ekstrak serbuk cokelat merk “X”.
B. Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang ada, maka penelitian ini bertujuan sebagai berikut:
1. Menetapkan jumlah sirkulasi ekstraksi serbuk cokelat merk “X” dengan metode soxhletasi yang menghasilkan kadar teobromin dan kafein maksimum.
2. Menetapkan kadar teobromin dan kafein dalam ekstrak serbuk cokelat merk “X” menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang telah tervalidasi.
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA A. Cokelat (Theobroma cacao)Gambar 1. Cokelat (Theobroma cacao)
Cokelat dihasilkan melalui serangkaian proses dari biji kakao. Biji kakaoini berasal dari tanaman kakao, Theobroma cacao, yang tumbuh hanya di daerah tropis. Istilah cokelat itu sendiri berasal dari xocolatl (bahasa suku Aztec) yang berarti minuman pahit (Alexander et al., 2008).
Secara garis besar, cokelat mengandung lemak 31%, karbohidrat 14%, dan protein 9%. Protein cokelat kaya akan asam amino triptofan, fenilalanin, dan tirosin. Meski cokelat mengandung lemak tinggi namun relatif tidak mudah tengik karena cokelat mengandung 6% polifenol, yang berfungsi sebagai antioksidan pencegah tengik. Cokelat mengandung berbagai macam gula, pati, protein sayuran, kalium, magnesium, kalsium, natrium, zat besi, krom, berbagai macam vitamin (A, B
1 tiamin, B 2 riboflavin, D dan E), kafein dan feniletilamin (Mutiara, 2011).
B. Penyarian
Penyarian atau ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang terlarut supaya terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. Pada proses penyarian terjadi perpindahan masa zat aktif yang semula berada di dalam sel akan ditarik oleh cairan penyari. Proses penyarian dapat dibagi pada tahapan pembuatan serbuk, penyarian, dan pemekatan. Hasil penyarian akan semakin baik apabila serbuk semakin halus, karena permukaan serbuk simplisia yang bersentuhan dengan penyari akan semakin luas. Akan tetapi pertimbangan ini tidak selalu dapat dilaksanakan karena dengan semakin halus serbuk simplisia juga akan mengganggu proses penyarian. Hal ini dikarenakan serbuk yang terlalu halus tersebut dapat membentuk suspensi sehingga sulit dipisahkan dari hasil penyarian. Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi cairan penyari (Anonim, 1986).
Ekstraksi dilakukan untuk menyari zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut. Zat-zat aktif terdapat di dalam sel, namun sel tanaman dan hewan berbeda demikian pula ketebalannya, sehingga diperlukan metode ekstraksi dengan pelarut tertentu dalam mengekstraksinya (Harbone, 1987).
Tujuan ekstraksi bahan alam adalah untuk menarik komponen kimia yang terdapat pada bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut, dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut (Anonim, 1986).
1. Ekstrak Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir pelarut diuapkan menjadi ekstrak kental atau ekstrak kering (Anonim, 1986).
Pembuatan ekstrak yang baik perlu memperhatikan beberapa tahap karena akan mempengaruhi mutu ekstrak seperti keseragaman kandungan kimia, sifat fisiknya, khasiat, dan keamanannya (Sidik dan Mudahar, 2000).
2. Cairan Penyari Cairan penyari yang digunakan dalam proses pembuatan ekstrak adalah pelarut yang optimal untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau aktif, dengan demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan dari senyawa kandungan lainnya. Diharapkan, ekstrak yang diperoleh hanya mengandung sebagian besar senyawa yang diinginkan. Ekstrak kental diperoleh jika cairan pelarut yang digunakan dapat melarutkan hampir semua metabolit sekunder yang terkandung (Anonim, 2000).
Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor. Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut ini: a. murah dan mudah diperoleh
b. stabil secara fisika dan kimia
c. bereaksi netral
d. mudah menguap dan tidak mudah terbakar f. tidak mudah mempengaruhi zat berkhasiat
g. diperbolehkan oleh peraturan dengan pertimbangan keamanan/toksisitas (Anonim, 1986).
Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus dipilih berdasarkan kemampuannya dalam melarutkan kandungan zat aktif yang maksimal dan seminimal mungkin bagi unsur yang tidak diinginkan (Ansel, 1985).
3. Metode Ekstraksi secara Soxhletasi Alat Soxhlet adalah suatu alat terbuat dari gelas yang bekerja secara kontinyu dalam menyari. Pada proses ini sampel yang disari dimasukkan pada alat Soxhlet, lalu dielusi dengan pelarut yang cocok sedemikian rupa sehingga akan terjadi dua kali sirkulasi dalam waktu 30 menit (Harbone, 1987).
Gambar 2. Diagram soxhlet extractor (Mitra, 2003)
Soxhlet (gambar 2) merupakan alat yang digunakan untuk penyarian berkesinambungan. Prinsipnya adalah pelarut di labu penampung diuapkan, uap naik ke atas melalui pipa samping dan diembunkan kembali oleh pendingin tegak, selanjutnya menetes turun ke tabung berisi serbuk simplisia yang dibungkus kertas saring. Cairan penyari yang menetes akan melarutkan zat aktif dan bila volumenya telah mencapai permukaan sifon, seluruh cairan sirkulasi ini berlangsung terus-menerus sehingga zat aktif yang hendak diekstraksi harus tahan terhadap pemanasan (Anonim, 1986). Ekstraksi sempurna ditandai bila cairan sifon tidak berwarna atau sirkulasi ekstraksi telah mencapai 20-25 kali (Utami, 2011).
Bahan yang akan diekstraksi diletakkan dalam sebuah kantong ekstrak dalam sebuah alat ekstraksi dari gelas yang bekerja kontinyu. Wadah gelas yang berisi sampel diletakkan diantara labu penampung dan suatu pendingin aliran balik. Labu tersebut berisi bahan pelarut yang mudah menguap mencapai ke pendingin aliran balik melalui pipa samping, berkondensasi di dalamnya, menetes ke atas bahan yang akan diekstraksi dan membawa keluar bahan yang diekstraksi. Larutan yang terkumpul di dalam wadah gelas dan setelah mencapai tinggi maksimal secara otomatis dipindahkan ke dalam labu, dengan demikian zat yang akan terektraksi terakumulasi melalui penguapan bahan pelarut murni berikutnya. Pada cara ini cairan pengekstrak terus diperbaharui, artinya bahan pelarut bebas bahan aktif akan menyari pada sirkulasi berikutnya (Voigt, 1971).
Cara soxhletasi lebih praktis dan hanya kemungkinan kecil zat yang diekstraksi hilang selama proses ekstraksi berlangsung. Efisiensi yang tinggi pada soxhletasi dipengaruhi oleh viskositas cairan penyari dan faktor-faktor yang mempengaruhi kecepatan tercapainya kesetimbangan (Khopkar, 1990). Kelebihan metode soxhletasi: a. Uap panas tidak melalui serbuk simplisia tetapi melalui pipa samping.
b. Cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit dibanding metode ekstraksi lainnya dan menghasilkan ekstrak yang lebih pekat.
c. Serbuk simplisia disari dengan cairan penyari yang murni sehingga dapat menyari zat aktif lebih banyak.
d. Penyarian dapat diteruskan sesuai keperluan tanpa menambah volume cairan penyari. Hal ini sangat menguntungkan karena selain ekonomis, akan diperoleh ekstrak yang lebih kental. Kekurangan metode soxhletasi:
a. Larutan dipanaskan terus-menerus sehingga kurang cocok untuk zat aktif yang tidak tahan pemanasan. Hal ini dapat diperbaiki dengan menambah peralatan yang dapat mengurangi tekanan udara.
b. Cairan penyari dididihkan terus-menerus sehingga penyari yang baik harus murni atau campuran azeotrop (Anonim, 1986).
C. Teobromin
Teobromin atau 3,7-dimetilksantin merupakan turunan ksantin yang termasuk dalam golongan alkaloid, terdapat dalam biji Theobroma cacao. Berupa serbuk kristal putih dengan rumus molekul C
7 H
8 N
4 O 2 dan bobot molekul 180,2
g/mol yang memiliki titik lebur 290°C; bersifat basa dengan pKa 10,0 (25
o
C) (Clarke, 1986). Teobromin mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 101,0% dari 3,7-dimetilksantin (Anonim, 2011). Serbuk cokelat kakao mengandung teobromin antara 18-38 g/kg (Alexander et al., 2008).
Teobromin (gambar 3) memiliki kelarutan: 1 dalam 2000 air, 1 dalam 150 air panas, 1 dalam 2500 etanol, dan 1 dalam 6000 kloroform. Teobromin tidak larut dalam pelarut eter. Teobromin dalam larutan dengan pH 9,4; serapan
% maksimumnya 273 mµ ( = 550). H N N O CH 3 O N CH
3
N Gambar 3. Struktur TeobrominMetode analisis yang paling sering digunakan untuk menganalisis kandungan teobromin dalam makanan adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Banyak metode lain yang dapat digunakan untuk menganalisis teobromin, antara lain kromatografi gas-spektrofotometer massa atau Spektrofotometer UV/Vis. Penyarian kandungan teobromin dalam makanan dapat dilakukan menggunakan metode maserasi dengan pemanasan (Cezch et al., 2011).
D. Kafein
Kafein memiliki sinonim 1,3,7-trimetilksantin dengan rumus molekul C
8 H
10 N