Penetapan Kadar Kofein Terlarut dalam Secangkir Kopi secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

  Lampiran 1.Kromatogram Penyuntikan Kofein Baku untukMencari

  Perbandingan Komposisi Fase Gerak

  RT (min) Area k' Asym N 8,61 245944 859,67 1,56* 5955

  A

  RT (min) Area k' Asym N 8,14 1310791 813,00 1,30* 6542

  B Keterangan :

  A = kromatogram hasil penyuntikan larutan kofein konsentrasi 60 ppm dengan perbandingan fase gerak Metanol – aquabidest (10 : 90) laju alir 1 ml/menit. B = kromatogram hasil penyuntikan larutan kofein konsentrasi 60 ppm dengan perbandingan fase gerak Metanol – aquabidest (30 : 70) laju alir 1 ml/menit.

  RT (min) Area k' Asym N 5,71 1507505 570,33 1,95* 3578

  A

  RT (min) Area k' Asym N 4,17 1605786 415,67 1,80* 2481

  B Keterangan :

  A = kromatogram hasil penyuntikan larutan kofein konsentrasi 60 ppm dengan perbandingan fase gerak Metanol – aquabidest (40 : 60) laju alir 1 ml/menit B = kromatogram hasil penyuntikan larutan kofein konsentrasi 60 ppm dengan perbandingan fase gerak Metanol – (50 : 50) laju alir 1 ml/menit

  aquabidest

  Lampiran 2.Kromatogram Penyuntikan Kofein Baku pada Pembuatan

  Kurva Kalibrasi

  RT (min) Area k' Asym N 7,80 1162306 779,00 1,32* 5643

  Kromatogram hasil penyuntikan larutan kofein BPFI konsentrasi 50 µg/ml.

  RT (min) Area k' Asym N 7,83 1586366 781,67 1,29* 5751

  Kromatogram hasil penyuntikan larutan kofein BPFI konsentrasi 70 µg/ml.

  RT (min) Area k' Asym N 7,83 2047081 782,33 1,30* 5711

  Kromatogram hasil penyuntikan larutan kofein BPFI konsentrasi 90 µg/ml.

  RT (min) Area k' Asym N 7,83 2496622 781,67 1,31* 5830

  Kromatogram hasil penyuntikan larutan kofein BPFI konsentrasi 110 µg/ml.

  RT (min) Area k' Asym N 7,85 2946254 784,33 1,31* 5770

  Kromatogram hasil penyuntikan larutan kofein BPFI konsentrasi 130 µg/ml.

  32557 4 , =

  ( ) ( )( ) ( ) ( )

  ( ) n

  X X Y n

  X XY a

  / /

  2

  2

  Σ − Σ Σ Σ − Σ

  =

  44500 450 5 / 1011039650 450 10238629 5 /

  12 Y b aX + = Keterangan: Y = luas area, a = slope, X = konsentrasi (µg/ml), b = intersep.

  2

  − −

  =

  ( ) ( ) ( ) ( ) 40500 44500 921476610 1011039650 −

  − = 4000 89563040

  = = 22390 76 , Y aX b − =

  ( )( )

  90 22390 76 , = 2047725 8 , −

  ( ) ( )( ) ( )

  13 Rata

  

Lampiran 3.Perhitungan Persamaan Garis Regresi dan Koefisien Korelasi dari

  1 50 1162306 58115300 2500 1,350955238x10

  Kofein BPFI

  Tabel 4. Data Hasil Penyuntikan Kofein BPFI

  No

  X Y

  XY

  X

  2 Y

  2

  12

  450 10238629 1011039650 44500 2,297158699x10

  2 70 1586366 111045620 4900 2,516557086x10

  12

  3 90 2047081 184237290 8100 4,190540621x10

  12

  4 110 2496622 274628420 12100 6,233121411x10

  12

  5 130 2946254 383013020 16900 8,680412633x10

  12 ∑

• rata 90 2047725,8 202207930 8900 4,594317398x10

  4 ( Σ

  76 X 32557 , + Jadi Persamaan regresi yangdidapat : Y = 22390 ,

  XY ) ( )( ) − Σ X Σ Y / n r = _{2 2 2}

₂

  Σ

  X − ( ∑ X ) / n Σ Y − ( ) Σ Y / n [ ( ) ] [ ( ) ]

  (1011039650) − (450)(10238629)/5

  =

  2

  13

  2

  ) /5][(2,297158699 /5]

  �[(44500) − (450) 10 − (10238629) 1011039650

  − 921476610 =

  13

  13

  ) )] − (2,096590476 10

  �[(44500) − (40500][(2,297158699 10 89563040

  =

  12

  )] �[4000][(2,00568223x10

  89563040 =

  89569687,51 = 0,9999

• =

  =

  22390 76 , 9961 4944 , 10 x =

  10 =

  Sy x BatasKuant itasi

  3347 , 1 = µg/ml Slope x

  22390 76 , 9961 4944 , 3 x =

  3 =

  Sy x BatasDetek si

  = 9961 4944 , Slope x

  = SB

  ( 297694114 5 , −

  5 )

  2

  SB

  ∑ n Yi Y

  − −

  

Lampiran 4. Perhitungan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

  X Y

  Kofein Persamaan regresi

  

32557 4 ,

22390 76 ,

  X Y

  No Konsentrasi

  (mcg/ml) Luas

  Puncak Yi Y – Yi ( Y - Yi )²

  1 50 1162306 1152095,4 10210,6 104256352,4

  2 ) ( ²

  2 70 1586366 1599910,6 -13544,6 183456189,2

  3 90 2047081 2047725,8 -644,8 415767,04

  4 110 2496622 2495541 1081 1168561

  5 130 2946254 2943356,2 2897,8 8397244,84

  ∑

  297694114,5

  4489 , 4 = µg/ml

  Lampiran 5. Data Hasil Perhitungan Kadar Kofein dalam Berbagai Jenis Sampel Kopi No Nama Perlakuan Luas Area Kadar(mg) Rata-rata

  1 Kopi Luwak 1 1165807 91,1023

  90,4723

  2 1156560 90,3589 3 1140787 89,0909 4 1154884 90,2242 5 1164687 91,0122 6 1165101 91,0455

  2 Kopi Arabika 1 1088184 84,8621

  84,3963

  2 1078625 84,0937 3 1084479 84,5643 4 1088195 84,8630 5 1081954 84,3613 6 1072826 83,6275

  3 Kopi Robusta 1 2046986 161,9405

  160,6638

  2 2028593 160,4619 3 2052296 162,3674 4 2022495 159,9717 5 2031780 160,7181 6 2004479 158,5234

  Lampiran 6.Kromatogram Hasil Penyuntikkan Sampel Kopi Luwak.

  RT (min) Area k' Asym N 8,08 1165807 807,00 1,33* 6182

  A

  RT (min) Area k' Asym N 8,03 1156560 801,67 1,38* 5986

  B

  Lampiran 2 (lanjutan) RT (min) Area k' Asym N 8,04 1140787 803,00 1,38* 6006

  C

  RT (min) Area k' Asym N 8,15 1154884 814,33 1,37* 5863

  D

  Lampiran 2 (lanjutan) RT (min) Area k' Asym N 8,23 1164687 822,33 1,34* 5939

  E

  RT (min) Area k' Asym N 7,93 1165101 791,67 1,42* 6160

  F

  

Keterangan: A, B, C, D, E dan F adalah kromatogram hasil penyuntikan sampel

  kopi luwakyangdianalisa secara KCKT pada kolom C18 (250 mm x 4,60 mm), dengan perbandingan fase gerak metanol – aquabidest (30:70), laju alir 1 ml/menit, dideteksi pada panjang gelombang 273 nm.

  

Lampiran 7. Analisis Data Statistik Untuk Menentukan Jumlah Kofein

  Sebenarnya dalam Sampel Kopi Luwak

  Tabel 5. Data Hasil Penyuntikan Sampel Kopi Luwak

  No Perlakuan Area Konsentrasi Jumlah kofein diperoleh dalam (µg/ml) secangkir(mg) 1 1165807 50,6124 91,0980

  2 1156560 50,1994 90,3589 Kopi 3 1140787 49,4949 89,0909

  Luwak 4 1154884 50,1245 90,2242 5 1164687 50,5623 91,0122 6 1165101 50,5808 91,0455

  Hasil pengolahan data sampel kopi luwak

  2 No Jumlah kofein (x)

  (X- X ) (X- X ) 1 91,098 0,6264 0,3923 2 90,3589 -0,1127 0,0127 3 89,0909 -1,3807 1,9063 4 90,2242 -0,2474 0,0612 5 91,0122 0,5406 0,2922 6 91,0455 0,5739 0,3293

  2 X = 90,4716

  =2,994 Σ(X- X )

  2

  (

  X − X )

  2,994

  ∑ SD =

  = = 0,7738

  n −

  1

  5 Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = 5 diperoleh nilai t tabel =4,0321. Data diterima jika t hitung ‹ t tabel .

  X −

  X

  t =

  hitung SD / n

  0,6264

  t hitung data 1 = =1,9829

  0,7738 /

  6 0,1127 -

  t hitung data 2 = = -0,0594

  0,7738 /

  6

• 1,3807

  t hitung data 3 = = -4,3706 (ditolak)

  0,7738 /

  6 0,7831 -

  t hitung data 4 = = -0,7831

  0,7738 /

  6 0,5406

  t data 5 = = 1,7113

  hitung 0,7738 /

  6 0,5739

  t hitung data 6 = = 1,8167

  0,7738 /

  diterima dengan t tabel = 4,6041 ( α = 0,01, dk = 4 )

  2 No Jumlah kafein (x)

  (X- X ) (X- X ) 1 91,098 0,3503 0,1227 2 90,3589 -0,3888 0,1511 3 90,2242 -0,5235 0,2740 4 91,0122 0,2645 0,0699 5 91,0455 0,2978 0,0887

  2 X = 90,7477

  = 0,7064 ∑(X- X )

  2

  (

  X − X )

  0,7064

  ∑ SD = =

  = 0,4202 −

  1

  n

  4 X −

  X

  t =

  hitung SD / n

  0,3503

  t hitung data 1 = = 1,8623

  0,4202 /

  5

• 0,3888

  t hitung data 2 = = -2,0689

  0,4202 /

  5

  0,5235 - t hitung data 3 = = -2,7857 0,4202 /

  5

  0,2645

  t data 4 = = 1,4075

  hitung 0,4202 /

  5

  0,2978

  t hitung data 5 = = 1,5847

  0,4202 /

  ≤ t tabel maka semua data diterima Jadi rentang jumlah kofein dalam minuman:

  SD

  µ = X ± t (tabel) x

  n

  0,4202 = 90,7477± 4,60409 x

  5 = (90,7477± 0,8652) mg.

  Lampiran 8.Kromatogram Hasil Penyuntikkan Sampel Kopi Arabika RT (min) Area k' Asym N 8,20 1088184 819,00 1,20* 6122

  A

  RT (min) Area k' Asym N 8,17 1078625 816,33 1,22* 6250

  B

  Lampiran 8 (lanjutan) RT (min) Area k' Asym N 8,15 1084479 813,67 1,19* 6241

  C .

  RT (min) Area k' Asym N 8,16 1088195 815,00 1,14* 6349

  D

  Lampiran 8 (lanjutan) RT (min) Area k' Asym N 8,17 1081954 816,33 1,15* 6391

  E

  RT (min) Area k' Asym N 8,15 1072826 813,67 1,15* 6328

  F kopi arabikayangdianalisa secara KCKT pada kolom C18 (250 mm x 4,60 mm), dengan perbandingan fase gerak metanol – aquabidest (30:70), laju alir 1 ml/menit, dideteksi pada panjang gelombang 273 nm.

  

Lampiran 9.Analisis Data Statistik Untuk Menentukan Jumlah Kofein

  / −

  hitung

  ‹ t

  tabel .

  t hitung =

  SD n

  X X

  0,4788 6 / 0,4668

  tabel

  t

  hitung

  data 2 =

  0,4788 6 / 0,3016 -

  = -1,5429 No Perlakuan Area Konsentrasi diperoleh

  (µg/ml) Jumlah kofein dalam secangkir(mg)

  Kopi Arabika 1 1088184 47,1456 84,8621

  = 4,0321. Data diterima jika t

  Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = 5 diperoleh nilai t

  Sebenarnya dalam Sampel Kopi Arabika

  2

  Tabel 6. Data Hasil Penyuntikan Sampel Kopi Arabika

  Hasil pengolahan data sampel kopi arabika No Jumlah kofein (x)

  (X- X ) (X- X )

  2

  1 84,8621 0,4668 0,2179 2 84,0937 -0,3016 0,0909 3 84,5643 0,1690 0,0285 4 84,8630 0,4677 0,2187 5 84,3613 -0,0340 0,0011 6 83,6275 0,7678 0,5895

  X = 84,3953

  Σ(X- X )

  = 1,1466

  = = 0,4788

  1 ) (

  2

  − −

  =

  ∑ n

  X X SD

  5 1,1466

  2 1078625 46,7187 84,0937 3 1084479 46,9801 84,5643 4 1088195 47,1461 84,8630 5 1081954 46,8674 84,3613 6 1072826 46,4597 83,6275

  0,1690

  t hitung data 3 = = 0,8646

  0,4788 /

  6 0,4677

  t hitung data 4 = = 2,3927

  0,4788 /

  6

• 0,0340

  t data 5 = = 0,1739

  hitung 0,4788 /

  6 0,7678

  t hitung data 6 = = 3,9279

  0,4788 /

  ≤ t tabel maka semua data diterima Jadi rentang jumlah kofein dalam minuman:

  SD

  µ = X ± t (tabel) x

  n

  0,4788 = 84,3953± 4,03214 x

  6 = (84,3953± 0,7881) mg.

  Lampiran 10.Kromatogram Hasil Penyuntikkan Sampel Kopi Robusta RT (min) Area k' Asym N 7,87 2046986 786,33 1,48* 6003

  A

  RT (min) Area k' Asym N 7,85 2028593 783,67 1,42* 6902

  B

  Lampiran 10 (lanjutan) RT (min) Area k' Asym N 7,87 2052296 785,67 1,50* 6164

  C

  RT (min) Area k' Asym N 7,86 2022495 785,00 1,49* 6493

  D

  Lampiran 10 (lanjutan) RT (min) Area k' Asym N 7,87 2031780 785,67 1,45* 6636

  E

  RT (min) Area k' Asym N 7,85 2004479 784,33 1,44* 6799

  F

  Keterangan: A, B, C, D, E dan F adalah kromatogram hasil penyuntikan sampel

  kopi robustayangdianalisa secara KCKT pada kolom C18 (250 mm x 4,60 mm), dengan perbandingan fase gerak metanol - aquabidest (30:70), laju alir 1 ml/menit, dideteksi pada panjang gelombang 273 nm.

  

Lampiran 11. Analisis Data Statistik Untuk Menentukan Jumlah Kofein

  Sebenarnya dalam Sampel Kopi Robusta

  Tabel 7. Data Hasil Penyuntikan Sampel Kopi Robusta

  No Perlakuan Area Konsentrasi Jumlah kofein diperoleh dalam (µg/ml) secangkir(mg) 1 2046986 89,9669 161,9405

  2 2028593 89,1455 160,4619 Kopi 3 2052296 90,2041 162,3674

  Robusta 4 2022495 88,8731 159,9717 5 2031780 89,2878 160,7181 6 2004479 88,0685 158,5234

  Hasil pengolahan data sampel kopi robusta

  2 No Jumlah kofein (x)

  (X- X ) (X- X ) 1 161,9405 1,2767 1,6299 2 160,4619 -0,2019 0,0407 3 162,3674 1,7036 2,9022 4 159,9717 -0,6921 0,4790 5 160,7181 0,0543 0,0029 6 158,5234 -2,1404 4,5813

  2 X =160,6638 =9,6360

  Σ(X- X )

  2

  (

  X − X )

  9,6360

  ∑ SD = =

  = 1,3882

  n −

  1

  5 Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = 5 diperoleh nilai t tabel = 4,0321. Data diterima jika t hitung ‹ t tabel .

  X −

  X

  t hitung =

  SD / n 1,2767

  t data 1 = = 2,2527

  hitung 1,3882 /

  6 0,2019 -

  t hitung data 2 = = -0,3562

  1,3882 /

  6

  1,7036

  t hitung data 3 = = 3,0060

  1,3882 /

  6

• 0,6921

  t hitung data 4 = = -1,2212

  1,3882 /

  6 0,0543

  t data 5 = = 0,1739

  hitung 1,3882 /

  6

• 2,1404

  t hitung data 6 = = -3,7767

  1,3882 /

  ≤ t tabel maka semua data diterima jadi rentang jumlah kofein dalam minuman:

  SD

  µ = X ± t (tabel) x

  n

  1,3882 = 160,6638± 4,03214 x

  6 = (160,6638± 2,2851) mg.

  Lampiran 12. Kromatogram Hasil Penyuntikan Uji Recovery Pada Sampel Kopi

  Luwak

  RT (min) Area k' Asym N 8,09 1706944 808,33 1,18* 4663

  A

  RT (min) Area k' Asym N 8,03 1714603 802,33 1,21* 4608

  B

  Lampiran 12 (lanjutan) RT (min) Area k' Asym N 7,97 1703839 779,00 1,32* 5643

  C

  RT (min) Area k' Asym N 8,09 1712622 807,67 1,19* 4783

  D

  Lampiran 12 (lanjutan) RT (min) Area k' Asym N 8,09 1711343 807,67 1,18* 4776

  E

  RT (min) Area k' Asym N 8,06 1704081 805,00 1,19* 4708

  F

  

Keterangan: A, B, C, D, E dan F adalah kromatogram hasil penyuntikan

  recovery pada sampel kopi luwakyangdianalisa secara KCKT pada kolom C18 (250 mm x 4,60 mm), dengan perbandingan fase gerak metanol – aquabidest (30:70), laju alir 1 ml/menit, dideteksi pada panjang gelombang 273 nm.

  Lampiran 13.Analisis Data Statistik Hasil Uji Persen Recovery Tabel 8. Data Hasil Penyuntikan Kofein Pada Uji Perolehan Kembali

  2 −

  0,7363 6 / 0,315 -

  / − t hitung data 1 =

  X X

  SD n

  t hitung =

  tabel .

  ‹ t

  hitung

  = 4,0321. Data diterima jika t

  tabel

  α = 0,01, dk = 5 diperoleh nilai t

  = 0,7363 Pada interval kepercayaan 99% dengan nilai

  6 7112 ,

  NO Area Konsentrasi diperoleh(µg/ml) Kadar (%) 1 1706944 74,7802 87,00

  1

  =

  ∑ n x x

  1 ² − −

  ( )

  =2,7112 SD =

  2

  6 X = 87,325 ∑(X- X )

  1 87,00 -0,315 0,0992 2 88,24 0,915 0,8372 3 86,51 -0,815 0,6642 4 87,92 0,595 0,3540 5 87,72 0,395 0,1560 6 86,55 -0,775 0,6006

  2

  (X- X ) (X- X )

  Pengolahan data statistik uji perolehan kembali No Kadar (%)

  2 1714603 75,1223 88,24 3 1703839 74,6415 86,51 4 1712622 75,0338 87,92 5 1711343 74,9767 87,72 6 1704081 74,6524 86,55

  = -1,0479

  0,915

  t hitung data 2 = = 3,0439

  0,7363 /

  6

• 0,815

  t hitung data 3 = = -2,7113

  0,7363 /

  6 0,595

  t data 4 = = 1,9794

  hitung 0,7363 /

  6 0,395

  t hitung data 5 = = 1,3140

  0,7363 /

  6

• 0,775 t hitung data 6 = = -2,5782

  0,7363 /

  6 Uji presisi dilihat dari nilai RSD

  SD

  RSD = x 100 %

  X

  , 7363 = x 100 % 87 , 3250

  = 0,8431%

  Lampiran 14.Perhitungan Jumlah Kofein Sebenarnya dalam Secangkir Kopi

  Volume minuman dalam satu cangkir = 180 ml Volume minuman yang dipipet = 1,0 ml

  Dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda (faktor pengenceran = 10) Luas area atau puncak (y) = 1165807

  Persamaan garis regresi Kofein BPFI Y = 22390,76 x + 32557,4

• Y b X =

  a

  1165807 32557,4 - = 22390 ,

  76 = 50,6124 µg/ml

  Kadar Kofein = X x faktor pengenceran = 50,6124 µg/ml x 10 = 506,1240 µg/ml

  Maka jumlah kofein dalam secangkir kopi adalah : = 506,1240 µg/ml x 180 ml

  = 91102,32 µg = 91,1023 mg

  Lampiran 15.Perhitungan Kadar Kofein Pada Uji Perolehan Kembali

  Volume minuman dalam satu cangkir = 180 ml Volume minuman yang dipipet = 1,0 ml Dimasukkan dalam labu takar 10 ml dan diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda (faktor pengenceran = 10) Luas area (y) = 1706944 Pers. Regresi Y = 22390,76 X + 32557,4

• b Y = 22390 76 ,

  X =

  a

  32557,4 - 1706944 = 74,7802 µg/ml

  Kadar Kofein = X x faktor pengenceran = 74,7802 µg/ml x 10 = 747,8020 µg/ml

  Maka jumlah kofein dalam secangkir kopi adalah = 747,8020 µg/ml x 180 ml = 134604,36 µg = 134,6043 mg

  % perolehan kembali = % 100

  x A C

• CA - CF

  = % 100

  50 91,1023 mg - mg 134,6043

  x mg

  = 87,00 %

  Lampiran 16. Gambar Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dan

  Vial Autosampler

A B

  Keterangan : A = Seperangkat Instrumen KCKT (Hitachi) dan komputer sebagai perangkat pendukung B = Vial AutosamplerL-2200

  Lampiran 17.Gambar Perangkat Pendukung Penelitian Lainnya.

  Sonifikator Branson (1510) Neraca Analitik

  Pompa Vakum (Gast DO A-PG04-BN) dan Penyaring Fase Gerak Neraca Analitik

  Sonifikator Kudos

  Lampiran 18. Sertifikat Pengujian Kofein BPFI

  Lampiran 19.Nilai Distribusi t