Optimasi dan Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) pada Penetapan Kadar Siklamat dalam Minuman Ringan

OPTIMASI DAN VALIDASI METODE KROMATOGRAFI

CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) PADA PENETAPAN

KADAR SIKLAMAT DALAM MINUMAN RINGAN

SKRIPSI

OLEH:

BINTANG DWIPUTRA

NIM 091501050

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

OPTIMASI DAN VALIDASI METODE KROMATOGRAFI

CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) PADA PENETAPAN

KADAR SIKLAMAT DALAM MINUMAN RINGAN

SKRIPSI

Diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

OLEH:

BINTANG DWIPUTRA NIM 091501050

PROGRAM STUDI SARJANA FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN

PENGESAHAN SKRIPSI

OPTIMASI DAN VALIDASI METODE KROMATOGRAFI

CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) PADA PENETAPAN

KADAR SIKLAMAT DALAM MINUMAN RINGAN

OLEH:

BINTANG DWIPUTRA 091501050

Dipertahankan di Hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara

Pada Tanggal: 16 Agustus 2014

Pembimbing I, Panitia Penguji,

Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt. NIP 195201041980031002 NIP 195008281976032002

Pembimbing II, Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt. NIP 195201041980031002

Prof. Dr.rer.nat. E. De Lux Putra, SU., Apt. Drs. Nahitma Ginting, M.Si., Apt NIP 195306191983031001 NIP 195406281983031002

Dra. Sudarmi, M. Si., Apt.

NIP 195409101983032001

Medan, September 2014 Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara Dekan,

Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 19531128198303100

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala Puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat, hidayah, dan kemudahan kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi dengan judul “Optimasi dan Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) pada Penetapan Kadar Siklamat dalam Minuman Ringan”. Skripsi ini diajukan sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi dari Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.

Pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan fasilitas selama masa pendidikan. Bapak Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si., Apt., dan Bapak Prof. Dr. rer. nat. Effendy De Lux Putra, S.U., Apt., yang membimbing penulis dengan penuh kesabaran dan tanggung jawab selama penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini. Bapak dan Ibu staf pengajar Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah mendidik selama perkuliahan. Bapak Koordinator Laboratorium Penelitian yang telah memberikan fasilitas, petunjuk dan membantu selama penelitian. Ibu Prof. Dr. Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt., Bapak Drs. Nahitma Ginting, M.Si., Apt., dan Ibu Dra. Sudarmi, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang memberikan masukan, kritik, arahan dan saran dalam penyusunan skripsi ini dan Ibu Sumaiyah, S.Si., M.Si., Apt., selaku dosen penasehat akademik yang telah banyak membimbing penulis selama masa perkuliahan hingga selesai.

Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tiada terhingga kepada Ayahanda Kamaluddin, dan Ibunda Ns. Chuchum Sumiarty, S.Kep. CVRN tercinta, atas doa dan pengorbanannya dengan tulus dan ikhlas, juga kepada Kakanda Surya Gemilang, dan Adinda Sukma Juwita, serta teman-teman mahasiswa Farmasi Angkatan 2009 yang selalu setia memberi doa, dorongan dan motivasi kepada penulis selama menempuh pendidikan S-1 Farmasi.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangannya, oleh karena itu sangat diharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak guna perbaikan skripsi ini. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.

. Medan, Agustus 2014

Penulis,

Bintang Dwiputra

OPTIMASI DAN VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) PADA PENETAPAN KADAR

SIKLAMAT DALAM MINUMAN RINGAN Abstrak

Penggunaan bahan tambahan pangan dewasa ini sangat beragam, dari pengawet sampai pemberi aroma dan pemanis. Pemanis buatan yang termasuk dalam bahan tambahan pangan adalah pemanis pengganti gula (sukrosa), yang salah satunya adalah siklamat. Penggunaan siklamat dibatasi oleh BPOM karena memiliki efek samping, yaitu dapat menyebabkan kanker prostat. Metode penetapan kadar siklamat telah ditetapkan oleh BPOM untuk sediaan sirup, tetapi keberhasilan suatu metode tergantung daripada matriks sampel sehingga metode analisa siklamat dalam sirup belum tentu dapat digunakan untuk sediaan lain. Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan optimasi dan validasi metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) pada penetapan kadar natrium siklamat dalam minuman ringan dan untuk mengetahui kesesuaian kadar natrium siklamat dalam minuman ringan yang beredar di pasaran yang ditetapkan secara KCKT dengan ketentuan yang ditetapkan BPOM.

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan alat KCKT Agilent dengan kolom Agilent C18 (150 x 4,6 mm). Jenis sediaan minuman ringan yang digunakan

adalah Teajus, Sisri, X-Teh, Nutrijeruk, Vitacool, and Segar Sari yang beredar di pasaran. Optimasi yang dilakukan pada penetapan kadar secara KCKT antara lain pH dapar fosfat dan komposisi fase gerak dapar fosfat dan methanol yang dideteksi dengan detektor UV-Vis pada panjang gelombang 201 nm.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa komposisi fase gerak dapar fosfat pH 7,0 : methanol dengan perbandingan 70:30 menghasilkan kondisi kromatografi yang optimal dalam penetapan kadar Na siklamat dalam minuman ringan secara KCKT. Metode ini memberikan hasil akurasi dan presisi yang baik dengan % recovery = 101,98%, relatif standar deviasi (RSD) = 0,15%; batas deteksi (LOD) = 9,37 ppm dan batas kuantitasi (LOQ) = 31,25 ppm. Dari enam minuman ringan yang dianalisis, tiga di antaranya, yaitu Nutrijeruk, Vitacool, dan Segar Sari dapat ditentukan kadarnya secara KCKT, dimana kadar Nutrijeruk dan Vitacool yang diperoleh melebihi batas yang ditentukan oleh BPOM sementara Segar Sari memenuhi persyaratan yaitu mengandung Na Siklamat tidak lebih dari 1000 ppm. Sedangkan untuk jenis minuman Teajus, Sisri, dan X-Teh tidak dapat dianalisis dengan kondisi kromatografi yang dilakukan.

OPTIMIZATION AND VALIDATION OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD FOR CYCLAMATE

DETERMINATION IN SOFT DRINKS Abstract

The use of food additives nowadays is varied, from preservatives to aromatics and sweeteners. Artificial sweetener included in food additives is a sweetener used to replace sugar (sucrose), such as cyclamate. The usage of cyclamate is limited by BPOM because of the adverse effect of cyclamate that may cause prostate cancer. BPOM made a method to determine cyclamate amount in syrup. However, a success of a method depends on the matrix of the sample used, therefore, the method used for syrup may not be able to be used for soft drinks. The purposes of this study were to optimize and validate the HPLC method for determination of cyclamate in soft drinks and to determine whether the concentration of cyclamate in soft drinks distributed in the markets is suitable according to the BPOM regulations.

This study was done with Agilent HPLC with Agilent C18 column (150 x

4,6 mm). The soft drinks used in this study were Teajus, Sisri, X-Teh, Nutrijeruk, Vitacool, and Segar Sari distributed in the market. The optimations of the HPLC method in determining the concentration of Na Cyclamate were phosphate buffer’s pH and mobile phase composition of phosphate buffer and methanol detected with UV-Vis detector at 201 nm.

The research showed that phosphate buffer pH 7.0 : methanol as mobile phase was the optimal chromatography condition in determining Na cylamate in soft drinks using High performance Liquid Chromatography. This method gave good accuration and precision with % recovery = 101.98%, relative standard deviation (RSD) = 0.15%; limit of detection (LOD) = 9.37 ppm and limit of quantitation (LOQ) = 31.25 ppm. There were six soft drink samples analyzed, three samples -Nutrijeruk, Vitacool, and Segar Sari- could be determined using HPLC where the concentrations of cyclamate in Nutrijeruk and Vitacool were higher than the concentration allowed by BPOM while Segar Sari was acceptable according to the BPOM regulations (not more than 1000 ppm) and the samples Teajus, Sisri, and X-Teh could not be determined using the chromatography condition used.

DAFTAR ISI

Halaman

JUDUL ... i

HALAMAN JUDUL ... ii

PENGESAHAN SKRIPSI ... iii

KATA PENGANTAR ... iv

ABSTRAK ... vi

ABSTRACT ... vii

DAFTAR ISI ... viii

DAFTAR TABEL .. ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... ... xiv

BAB I PENDAHULUAN .... ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah ... 3

1.3 Hipotesis ... 3

1.4 Tujuan Penelitian ... 4

1.5 Manfaat Penelitian ... 4

1.6 Kerangka Pikir Penelitian ... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 6

2.1 Natrium Siklamat ... 6

2.1.1 Sifat Fisikokimia ... 6

2.1.2 Penggunaan ... 6

2.2 Minuman Ringan ... 7

2.3 Kromatografi ... 7

2.3.1 Penggunaan Kromatografi ... 7

2.3.2 Puncak Asimetris ... 8

2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ... 8

2.4.1 Cara Kerja KCKT ... 9

2.4.2 Komponen KCKT ... 10

2.4.3 Wadah Fase Gerak ... 10

2.4.4 Pompa ... 10

2.4.5 Injektor ... 11

2.4.6 Kolom ... 11

2.4.7 Detektor ... 12

2.4.8 Pengolahan Data ... 12

2.4.9 Fase Gerak ... 13

2.4.10Dapar ... 14

2.4.11Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .... 14

2.5 Validasi Metode ... 15

2.5.1 Akurasi (Kecermatan) ... 15

2.5.2 Presisi (Keseksamaan) ... 15

2.5.3 Spesifitas (Selektifitas) ... 15

2.5.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ... 15

2.5.5 Linearitas ... 16

2.5.6 Rentang (Kisaran) ... 16

2.5.8 Kekasaran (Ketangguhan) ... 16

BAB III METODE PENELITIAN ... 17

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ... 17

3.2 Alat dan Bahan ... 17

3.2.1 Alat ... ... 17

3.2.2 Bahan ... ... 17

3.3 Pengambilan Sampel ... 18

3.4 Prosedur Kerja ... 18

3.4.1 Pembuatan fase gerak ... 18

3.4.2 Pembuatan pelarut ... 18

3.4.3 Prosedur analisis menggunakan KCKT ... 18

3.4.3.1 Penyiapan kromatografi cair kinerja tinggi ... 18

3.4.3.2 Penentuan perbandingan fase gerak yang optimum .. ... 18

3.4.4 Analisis kualitatif ... 19

3.4.4.1 Uji identifikasi Na Siklamat ... 19

3.4.5 Analisis kuantitatif ... 19

3.4.5.1 Pembuatan larutan induk baku Na Siklamat BPFI ... 19

3.4.5.2 Pembuatan kurva kalibrasi Na Siklamat BPFI 19

3.4.5.3 Penetapan kadar sampel ... 20

3.4.5.4 Analisis data penetapan kadar secara statistik .. 20

3.4.6 Validasi metode ... 21

3.4.6.2 Presisi (keseksamaan) ... 22

3.4.6.3 Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) 22 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 24

4.1 Penentuan pH dapar fosfat ... 24

4.2 Penentuan Komposisi Fase Gerak ... 25

4.3 Analisis Kualitatif ... 26

4.4 Analisis Kuantitatif ... 27

4.4.1 Penentuan kurva kalibrasi ... 27

4.4.2 Penetapan kadar analit dalam sampel yang dianalisis . 28 4.5 Hasil Uji Validasi ... 29

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 31

5.1 Kesimpulan ... 31

5.2 Saran ... 31

DAFTAR PUSTAKA ... 32

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 4.1 Pengaruh pH dapar fosfat terhadap parameter kromatogram ... 24 Tabel 4.2 Pengaruh komposisi fase gerak terhadap parameter

kromatogram ... 25 Tabel 4.3 Hasil penetapan kadar Na Siklamat dalam minuman

ringan ... 28 Tabel 4.4 Hasil Pengujian Validasi, dengan parameter akurasi,

presisi, batas deteksi (LOD), batas kuantitasi (LOQ) Na Siklamat Vitacool dengan menggunakan metode adisi standar ... 30

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1.1 Kerangka Pikir Penelitian ... 5 Gambar 4.1 Kromatogram Na Siklamat secara KCKT menggunakan

kolom Agilent Eclipse XDB (150 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak dapar fosfat : methanol (70 : 30) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl dan deteksi pada panjang gelombang 201 nm ... 26 Gambar 4.2 Kromatogram hasil spike secara KCKT menggunakan

kolom Agilent Eclipse XDB (150 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak dapar fosfat : methanol (70 : 30) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl dan deteksi pada panjang gelombang 201 nm ... 27 Gambar 4.3 Kurva kalibrasi Na Siklamat BPFI secara KCKT

menggunakan kolom Agilent Eclipse XDB (150 x 4,6 mm) dengan perbandingan fase gerak dapar fosfat:methanol (70:30) dan laju alir 1 ml/menit, volume penyuntikan 20 µl dan deteksi pada panjang gelombang 201 nm ... 28

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1 Kromatogram penyuntikan larutan Na Siklamat

untuk mencari pH dapar fosfat yang optimum pada analisis ... ... 34 Lampiran 2 Kromatogram penyuntikan larutan Na Siklamat

untuk mencari komposisi fase gerak dapar fosfat : methanol yang optimum pada analisis ... 37 Lampiran 3 Kromatogram larutan Na Siklamat BPFI pada

pembuatan kurva kalibrasi ... 47 Lampiran 4 Perhitungan persamaan regresi dari kurva kalibrasi Na

Siklamat BPFI yang diperoleh secara KCKT pada panjang gelombang 201 nm ... 50 Lampiran 5 Perhitungan recovery dengan metode adisi standar

... ... 52 Lampiran 6 Kromatogram hasil recovery dari sampel Vitacool

... ... 53 Lampiran 7 Hasil pengujian validasi, dengan parameter akurasi,

presisi, batas deteksi (LOD), batas kuantitasi (LOQ) Na Siklamat pada tablet Vitacool dengan menggunakan metode adisi standar ….. ... 59 Lampiran 8 Contoh perhitungan % recovery dengan metode adisi

standar ... 60 Lampiran 9 Perhitungan batas deteksi (LOD) dan batas

kuantitasi (LOQ) ... 61 Lampiran 10 Kromatogram dari Nutrijeruk ... 62 Lampiran 11 Contoh perhitungan untuk mencari kadar Na siklamat

dalam sampel ... 65 Lampiran 12 Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya

dari penyuntikkan larutan nutrijeruk ... 66 Lampiran 13 Tabel hasil analisa kadar Na siklamat dalam

Nutrijeruk ... ... 69 Lampiran 14 Kromatogram dari larutan Vitacool ... 70

Lampiran 15 Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya

dari penyuntikkan larutan Vitacool ... 73

Lampiran 16 Tabel hasil analisa kadar Na siklamat dalam Vitacool . 75 Lampiran 17 Kromatogram dari larutan Segar Sari ... 76

Lampiran 18 Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya dari penyuntikkan larutan Segar Sari ... 79

Lampiran 19 Tabel hasil analisa kadar Na siklamat dalam Segar Sari ... ... 81

Lampiran 20 Daftar Spesifikasi Sampel ... 82

Lampiran 21 Tabel Nilai Distribusi t ... 84

Lampiran 22 Sertifikat Na Siklamat BPFI ... 85

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penggunaan bahan tambahan pangan dewasa ini sangat beragam, dari pengawet sampai pemberi aroma dan pewarna. Berkembangnya bahan tambahan pangan mendorong pula perkembangan makanan hasil olahan pabrik, yakni bertambah aneka ragam jenisnya serta ragam cita rasa maupun kenampakannya (Saparinto dan Hidayati, 2006). Pemanis buatan yang termasuk dalam bahan tambahan pangan adalah pemanis pengganti gula (sukrosa), yaitu senyawa yang memberikan persepsi rasa manis, tetapi tidak memberikan nilai gizi (non-nutritive sweeteners). Salah satu jenis pemanis buatan ini adalah siklamat (Saparinto dan Hidayati, 2006).

Penggunaan utama dari siklamat termasuk minuman ringan, minuman jus buah, sirup, buah yang telah diproses, permen karet, jeli, selai dan topping berbahan gelatin (Hunt., et al, 2011). Penggunaan siklamat dibatasi oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) karena efek samping dari siklamat, yaitu dapat menyebabkan kanker prostat maka menurut Keputusan Kepala BPOM Tahun 2004, penggunaan siklamat dalam minuman ringan tidak boleh melebihi 1000 ppm.

Minuman ringan adalah minuman yang tidak mengandung alkohol, merupakan minuman olahan dalam bentuk bubuk atau cair yang mengandung bahan makanan atau bahan tambahan lainnya baik alami maupun sintetik yang dikemas dalam kemasan siap untuk dikonsumsi (Cahyadi, 2005).

Menurut Metode Analisis BPOM (2006) penetapan kadar siklamat untuk sediaan sirup dilakukan secara KCKT menggunakan fase gerak dapar fosfat pH 4,5 : methanol dengan perbandingan 70:30 pada suhu 40ºC menggunakan kolom C18 (250 x 4,6 mm) laju alir 1 ml/menit dan Ibrahim (2006) juga melakukan

penetapan kadar siklamat dalam sirup, cincau, manisan, dan es mambo dengan KCKT menggunakan air dan asetonitril dengan perbandingan 95:5 menggunakan kolom Luna C18 dan laju alir 1 ml/menit pada panjang gelombang 220 nm dan

suhu percobaan 25ºC, tetapi keberhasilan suatu metode tergantung daripada matriks sampel sehingga metode yang digunakan untuk sirup belum tentu dapat digunakaan untuk sampel lain. Sementara Wibowotomo (2008) melakukan penetapan kadar Na Siklamat dalam minuman ringan dengan kondisi kromatografi yang sama, tetapi dengan terlebih dahulu dilakukan ekstraksi menggunakan eter. Metode lain yang dapat digunakan untuk penetapan kadar Na Siklamat antara lain secara spektrofotometri UV (Sjöberg dan Alanko , 1987) dan Titrasi Nitrimetri (FAO, 1996).

Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) memiliki banyak keuntungan antara lain dapat digunakan untuk analisis suatu zat dalam jumlah kecil, waktu analisisnya relatif singkat, cukup sensitif dan selektif serta mudah dalam interpretasi data yang diperoleh (Gandjar dan Rohman, 2007).

Berdasarkan hal tersebut di atas, peneliti ingin melakukan optimasi untuk penetapan kadar natrium siklamat dalam minuman ringan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan berbagai pH dapar fosfat dan perbandingan fase gerak dapar fosfat : methanol. Untuk menguji validitas kondisi kromatografi yang diperoleh dilakukan uji validasi metode dengan parameter

akurasi, presisi, Limit of Detection (LOD), dan Limit of Quantitation (LOQ). Selain itu, peneliti ingin mengetahui apakah kadar natrium siklamat dalam minuman ringan yang beredar di pasaran memenuhi syarat yang ditetapkan oleh BPOM (2004) yaitu tidak lebih dari 1000 mg/kg.

1.2 Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka yang menjadi perumusan masalah dalam penelitian ini adalah:

 Apakah metode penetapan kadar natrium siklamat dalam minuman ringan dapat ditentukan dengan KCKT menggunakan fase gerak dapar fosfat pH 4,5 : methanol (70:30)

 Apakah kadar natrium siklamat dalam minuman ringan yang beredar di pasaran yang ditetapkan dengan metode KCKT memenuhi persyaratan menurut BPOM (2004), yaitu tidak lebih dari 1000 mg/kg

1.3Hipotesis

Berdasarkan perumusan masalah di atas, maka yang menjadi hipotesis dalam penelitian ini adalah:

 Penetapan kadar natrium siklamat dalam minuman ringan tidak dapat ditentukan dengan metode KCKT menggunakan fase gerak dapar fosfat pH 4,5 : methanol (70:30)

 Kadar natrium siklamat dalam minuman ringan yang beredar di pasaran yang ditetapkan secara KCKT memenuhi persyaratan yang ditetapkan BPOM (2004), yaitu 1000 mg/kg

1.4Tujuan Penelitian

Berdasarkan hipotesis di atas, maka yang menjadi tujuan dalam penelitian ini adalah :

 Melakukan optimasi dan validasi metode KCKT pada penetapan kadar natrium siklamat dalam minuman ringan menggunakan fase gerak dapar fosfat : methanol

 Untuk mengetahui kesesuaian kadar natrium siklamat dalam minuman ringan yang beredar di pasaran yang ditetapkan secara KCKT dengan persyaratan yang ditetapkan BPOM (2004)

1.5 Manfaat Penelitian

Adapun manfaat penelitian ini adalah sebagai metode alternatif bagi industri dan BPOM pada penetapan kadar natrium siklamat dalam minuman ringan dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi

1.6 Kerangka Pikir Penelitian

Penelitian dimulai dengan pembuatan fase gerak, preparasi sampel, dan penyuntikan sampel.

Secara skematis kerangka pikir penelitian ini ditunjukkan pada Gambar 1.1. sebagai berikut:

Variabel Bebas Variabel Terikat Parameter

Gambar 1.1 Kerangka Pikir Penelitian Sampel minuman ringan:

- Vitacool - Nutrijeruk - Segar Sari - Sisri - Teajus - X - Teh

- Theoritical plate

- Tailing factor

- Waktu Retensi - Akurasi - Presisi - LOD - LOQ Perbandingan fase gerak

dapar fosfat : methanol: ‐ 70:30

‐ 75:25 ‐ 80:20

Kadar Na Siklamat

pH dapar fosfat:

‐ 4,5

‐ 5,5

‐ 6,0

‐ 6,5

‐ 7,0

2.1 Natriu 2.1.1 Sifat Men berikut: R Nama Kim Rum Bera Pem Kela kloroform 2.1.2 Peng Pe buah, siru berbahan g 2.1.3 Ef Hasi adalah m um Siklam t Fisikokim

nurut Windh Rumus struk mia mus Moleku at Molekul merian arutan m, dan benze

ggunaan

nggunaan u up, buah y

gelatin (Hun

fek Sampin

il penelitian erupakan k

TI

at mia

holz, dkk. (

ktur :

: Sodium N ul : C

: 2 : K

: ene.

utama dari s yang telah

nt., et al, 20

g

n yang tela karsinogen

BAB INJAUAN

(1983), sifa

N - Cyclohe C6H12NNaO

201,22 g/mo Kristal putih Larut dala

siklamat ter diproses, p 011)

ah dilakuka kandung k

B II

PUSTAKA

at fisikokimi

exylsulfama O3S

ol

h tidak berb am air, tida

rmasuk min permen kar

an mengim kemih pada

A

ia natrium s

ate

bau. Berasa ak larut dal

numan ringa ret, jeli, se

mplikasikan a tikus, seh

siklamat se

sangat man lam etanol,

an, minuma elai dan top

bahwa sik ehingga sik ebagai nis eter, an jus pping klamat klamat

dihilangkan dari daftar “Aman Secara Umum”, dan akhirnya dilarang untuk digunakan pada makanan dan minuman di Amerika Serikat (Hunt et al. 2011).

2.2 Minuman Ringan

Minuman ringan adalah minuman yang tidak mengandung alkohol, merupakan minuman olahan dalam bentuk bubuk atau cair yang mengandung bahan makanan atau bahan tambahan lainnya baik alami maupun sintetik yang dikemas dalam kemasan siap untuk dikonsumsi (Cahyadi, 2005).

2.3 Kromatografi

Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh ahli botani Rusia pada tahun 1903 yang bernama Michael Tswett untuk memisahkan pigmen warna dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat. Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melalukan analisis, baik analisis kualitatif, analisis kuantitatif, atau preparatif dalam bidang farmasi dan industri. Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase) (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.3.1 Penggunaan Kromatografi

Menurut Gritter dkk (1985), penggunaan kromatografi adalah sebagai berikut:

1. Pemakaian untuk tujuan kualitatif mengungkapkan ada atau tidak adanya

senyawa tertentu dalam cuplikan

2. Pemakaian untuk tujuan kuantitatif menunjukkan banyaknya masing-masing

komponen campuran

3. Pemakaian untuk tujuan preparatif untuk memperoleh komponen campuran

dalam jumlah memadai dalam keadaan murni.

2.3.2 Puncak Asimetris

Puncak asimetris yakni membentuk pucak yang berekor (tailing) dan adanya puncak pendahulu (fronting) jika ada perubahan rasio distribusi solut yang lebih besar (Johnson dan Stevenson, 1991).

Baik tinggi puncak maupun luasnya dapat dihubungkan dengan konsentrasi. Tinggi puncak mudah diukur, akan tetapi sangat dipengaruhi perubahan waktu retensi yang disebabkan oleh variasi suhu dan komposisi pelarut. Oleh karena itu, luas puncak dianggap merupakan parameter yang lebih akurat untuk pengukuran kuantitatif (Ditjen POM, 1995).

2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Ditjen POM, 1995).

KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain: farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan (Munson, 1991).

Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil). KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain (Munson, 1991).

Menurut Munson (1991), kelebihan KCKT antara lain:

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

Resolusinya baik

Mudah melaksanakannya

Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi

Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis

Dapat digunakan bermacam-macam detektor

Kolom dapat digunakan kembali

Tekniknya tidak begitu tergantung pada keahlian operator dan reprodusibilitasnya lebih baik

Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan kuantitatif

Waktu analisis umumnya singkat

2.4.1 Cara

Krom terpisah o suatu kolo fase gera penggabun kolom, fa kolom, da 2.4.2 Kom 2.4.3 Wad labu labor dapat men digunakan gerak, seb

a Kerja KC

matografi m oleh perbed om kromato ak dan fa

ngan secara se gerak, p an ukuran sa

mponen KC

Wadah F

dah fase ge ratorium dap nampung fa n harus dila

bab adany CKT merupakan daan kecepa ografi. Pem ase diam.

a tepat dari anjang dan ampel (Gand

CKT

Gamba ase Gerak

erak harus b pat digunak ase gerak an akukan deg

a gas akan

teknik ya atan elusi, misahan solu

Penggunaa berbagai m n diameter k djar dan Ro

ar 2 Instrum

bersih dan kan sebagai ntara 1 samp

gassing (pe n berkump

ang mana dikarenaka ut-solut ini d

an kromato macam kond

kolom, kece ohman, 2007

ment Dasar K

inert. Wad wadah fase pai 2 liter p enghilangan pul dengan solut atau an solut-sol diatur oleh ografi cair disi operasio

epatan alir f 7).

KCKT

dah pelarut e gerak. Wa pelarut. Fas n gas) yang

komponen

zat-zat te lut ini mel distribusi d r membutu onal seperti

fase gerak,

kosong ata adah ini bia se gerak seb

g ada pada n lain teru

erlarut lewati dalam uhkan jenis suhu aupun sanya belum a fase utama

dipompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.4.4 Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni : pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 6000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 0,1-10 ml/menit. Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.4.5 Injektor

Ada 3 jenis injektor, yakni syringe injector, loop valve dan automatic injector (autosampler). Syringe injector merupakan bentuk injektor yang paling sederhana (Meyer, 2004).

Pada waktu sampel diinjeksikan ke dalam kolom, diharapkan agar aliran pelarut tidak mengganggu masuknya keseluruhan sampel ke dalam kolom. Sampel dapat langsung diinjeksikan ke dalam kolom (on column injection) atau digunakan katup injeksi (Meyer, 2004).

Katup putaran (loop valve), tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar daripada 10 µl dan sekarang digunakan dengan cara otomatis (dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Bila katup difungsikan, maka cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom (Meyer, 2004).

Automatic injector atau disebut juga autosampler memiliki prinsip yang mirip, hanya saja sistem penyuntikannya bekerja secara otomatis (Meyer, 2004).

2.4.6 Kolom

Kolom kinerja tinggi yang dapat meminimalkan pelebaran puncak sampel adalah jantung dari sistem kromatografi cair modern. Efisiensi kolom tertinggi dapat dicapai dengan menggunakan kolom yang dipak dengan padat dan seragam dan berdiameter 5-10 μm.

Kolom dengan diameter 2 – 5 mm biasanya digunakan untuk analisis. Kolom yang lebih lebar dengan diameter antara 10 mm sampai 1 inchi (25,4 mm) dapat digunakan untuk pekerjaan preparatif. Beberapa perusahaan bahkan memasarkan kolom preparatif dengan diameter 30 cm ke atas. Kolom dengan panjang 5, 10, 15, atau 25 cm adalah umum jika digunakan fase diam mikropartikel berukuran 10 μm ke bawah. Jika diinginkan jumlah plate yang lebih tinggi maka akan lebih baik jika meggunakan packing dengan partikel yang lebih kecil daripada menggunakan kolom yang lebih panjang. Kolom yang lebih panjang meningkatkan volume retensi, sehingga mengurangi konsentrasi puncak pada zat yang terelusi.

Kolom umumnya dibuat dari stainless steel, tahan terhadap tekanan KCKT normal dan relatif inert terhadap korosi kimiawi. (Meyer, 2004).

2.4.7 Detektor

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen cuplikan dalam aliran yang keluar dari kolom. Detektor-detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi tanggapan/respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan

yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh (Johnson dan Stevenson, 1991).

Detektor yang paling banyak digunakan dalam kromatografi cair modern kecepatan tinggi adalah detektor spektrofotometer UV 201 nm. Bermacam-macam detektor dengan variasi panjang gelombang UV-Vis sekarang menjadi populer karena mereka dapat digunakan untuk mendeteksi senyawa-senyawa dalam rentang yang luas. Detektor lainnya, antara lain: detektor fluometer, detektor ionisasi nyala, detektor elektrokimia dan lain-lain juga telah digunakan (Johnson dan Stevenson, 1991).

2.4.8 Pengolahan Data

Komponen yang terelusi mengalir ke detektor dan dicatat sebagai puncak-puncak yang secara keseluruhan disebut sebagai kromatogram (Johnson dan Stevenson, 1991).

Guna kromatogram:

Menurut Johnson dan Stevenson (1991), guna kromatogram adalah sebagai berikut:

1. Kualitatif : Waktu retensi selalu konstan dalam setiap kondisi kromatografi yang sama dapat digunakan untuk identifikasi.

2. Kuantitatif : Luas puncak proporsional dengan jumlah sampel yang diinjeksikan dan dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi

2.4.9 Fase Gerak

Fase gerak harus dipilih berdasarkan sifat-sifat kromatografinya: yaitu harus berinterksi dengan fase diam yang sesuai untuk memisahkan campuran secepat

dan seefisien mungkin. Sebagai aturan umum, beberapa pelarut berpotensi dapat menyelesaikan masalah tertentu, sehingga pemilihan harus didasari oleh kriteria yang berbeda:

 Viskositas: pelarut dengan viskositas rendah menghasilkan perubahan tekanan yang rendah daripada pelarut dengan viskositas tingga pada laju alir spesifik. Hal ini juga dapat mnegakibatkan proses kromatografi yang lebih cepat.

 Transparansi UV: jika digunakan detektor UV, fase gerak harus benar-benar transparan pada panjang gelombang yang dibutuhkan.

 Indeks refraktif: hanya penting jika menggunakan detektor indeks refraktif

 Titik didih: titik didih fase gerak yang rendah dibutuhkan jika zat yang terelusi ingin diperoleh kembali dan diproses lebih lanjut.

 Kemurnian: kriteria ini mempunyai arti yang berbeda tergantung penggunaan yang diinginkan

 Inert dengan senyawa-senyawa di dalam sampel.

 Ketahanan terhadap korosi: baja bahkan bisa terkorosi dengan methanol atau asetonitril, sehingga mungkin diperlukan perawatan dengan asam nitrat atau perubahan desain instrumen.

 Harga

2.4.10Dapar

Dapar diperlukan dalam kromatografi pertukaran ion dan sering juga digunakan dalam kromatografi fase balik. Jika senyawa ionik maupun senyawa yang dapat terion perlu dipisahkan, sering, walaupun tidak selalu, merupakan kebutuhan penting untuk menjalankan kromatografi pada pH tertentu. Analit

dapat dibuat menjadi sepenuhnya tidak terion maupun sepenuhnya terion, tergantung dari mode pemisahan.

Larutan dapar sering dibuat dari konsentrat yang tersedia di pasaran; jika pengenceran dilakukan dengan benar, pH yang diinginkan tidak perlu diperiksa lagi. Jika tidak tersedia konsentrat di pasaran, sebaiknya senyawa kimia yang dibutuhkan ditimbang dan diencerkan dengan volume yang sesuai (Meyer, 2004).

2.4.11 Jenis Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Berdasarkan jenis fase gerak dan fase diamnya, jenis pemisahan KCKT dibedakan atas:

a.Kromatografi Fase Normal

Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat polar, misalnya silika gel, alumina, sedangkan fase geraknya bersifat non polar seperti heksan.

b.Kromatografi Fase Terbalik

Pada kromatografi fase terbalik, fase diamnya bersifat non polar, yang banyak dipakai adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan oktilsilan (C8).

Sedangkan fase geraknya bersifat polar, seperti air, metanol dan asetonitril (Meyer, 2004).

2.5 Validasi metode

Validasi merupakan persyaratan mendasar yang diperlukan untuk menjamin kualitas dan hasil dari semua aplikasi analitik (Ermer, 2005).

Adapun karakteristik dalam validasi metode menurut USP (United States Pharmacopeia) yaitu akurasi (ketepatan), presisi, spesifisitas/selektifitas, batas

deteksi, batas kuantitasi, linieritas, rentang/kisaran dan kekuatan/ketahanan dan kekasaran/ketangguhan.

2.5.1 Akurasi (Kecermatan)

Akurasi merupakan ketlitian metode analisis atau kedekatan antara nilai terukur dengan nilai sebenarnya. Akurasi dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery) (Harmita, 2004).

2.5.2 Presisi (Keseksamaan)

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran pada sampel yang sama dan biasanya diekspresikan sebagai relatif standar deviasi (RSD) (Gandjar dan Rohman, 2007).

2.5.3 Spesifisitas (Selektifitas)

Spesifisitas/selektifitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradatif dan komponen lain dari sampel (Ermer, 2005).

2.5.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Batas deteksi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan batas kuantitasi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi metode yang digunakan (USP, 2007).

2.5.5 Linearitas

Linieritas adalah kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji yang secara langsung proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang

diberikan. Linieritas dapat ditentukan secara langsung dengan pengukuran sampel (analit) yang ditambahkan baku pada sekurang-kurangnya lima titik konsentrasi yang mencakup seluruh rentang konsentrasi kerja (Ermer, 2005).

2.5.6 Rentang (Kisaran)

Rentang/kisaran adalah konsentrasi terendah dan tertinggi yang mana suatu metode analitik menunjukkan akurasi, presisi dan linieritas yang dapat digunakan untuk menganalisis sampel (Ermer, 2005).

2.5.7 Kekuatan (Ketahanan)

Kekuatan/ketahanan merupakan pengujian kemampuan dari suatu metode untuk tidak terpengaruh oleh adanya perubahan parameter dalam melakukan metode analitik seperti persentase kandungan pelarut organik dalam fase gerak, pH larutan dapar, waktu pengekstraksian analit, komposisi pengekstraksi dan perbandingan konsentrasi fase gerak (Épshtein, 2004).

2.5.8 Kekasaran (Ketangguhan)

Kekasaran/ketangguhan merupakan tingkat reprodusibilitas hasil yang diperoleh dengan kondisi yang bervariasi dan dinyatakan sebagai simpangan baku relative relative standard deviation (RSD). Kondisi ini meliputi laboratorium, analis, reagen dan waktu percobaan yang berbeda (Gandjar dan Rohman, 2007).

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan pada bulan Juni sampai Desember 2013.

3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat

Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat instrumen KCKT lengkap (Agilent) dengan pompa, degasser, penyuntik

autosampler (20µl), kolom Agilent C18 (150 x 4,6 mm), detektor UV-Vis, wadah

fase gerak, vial, Sonifikator (Branson 1510), pompa vakum (Gast DOA – P604 – BN), neraca analitik (Mettler Toledo), membrane filter PTFE 0,5 µm dan 0,2 µm,

cellulose nitrate membran filter 0,45 µm.

3.2.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah Methanol untuk HPLC (E.Merck), Akuabides (Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi USU), Kalium dihidrogen fosfat (E.Merck), Kalium Hidroksida (E.Merck), Na Siklamat BPFI (Badan POM RI), Nutrijeruk (Union Pasifik Indonesia), Vitacool (PT Makmur Artha Sejahtera), Segar Sari (PT Kinosentra Industrindo), Sisri (PT Forisa Nusapersada), Teajus (Wings Indonesia), X-Teh (Union Pasifik Indonesia).

3.3 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel dilakukan secara random sampling (Sugiono, 2013) yaitu tanpa membandingkan satu tempat dengan tempat yang lain karena semua sampel dianggap homogen dan sampel diambil sebanyak √ .

3.4 Prosedur Kerja 3.4.1 Pembuatan fase gerak

Methanol 500 ml disaring dengan menggunakan membran filter PTFE 0,5 μm. Sebanyak 125 ml kalium dihidrogen fosfat 0,2 M ditambahkan dengan 72,75 ml KOH 0,2 M kemudian dicukupkan dengan akuabides dalam labu tentukur 500 ml, kocok. Kemudian diukur pH. Kemudian disaring dengan menggunakan

cellulosa nitrat membran filter 0,45 μm. Masing-masing diawaudarakan selama 30 menit.

3.4.2 Pembuatan pelarut

Dicampur 200 ml methanol dan 300 ml aquabides. Kemudian pelarut disaring menggunakan membrane filter PTFE 0,5 μm dan diawaudarakan selama 20 menit.

3.4.3 Prosedur analisis menggunakan KCKT 3.4.3.1Penyiapan kromatografi cair kinerja tinggi

Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan Agilent C18 (150 x 4,6

mm), detektor UV-Vis dan dideteksi pada panjang gelombang 201 nm. Setelah alat KCKT difungsikan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan

mengalir selama 30 menit dengan laju alir 1 ml/menit sampai diperoleh garis alas yang datar, menandakan sistem tersebut telah stabil.

3.4.3.2Penentuan perbandingan fase gerak yang optimum

Pada kondisi kromatografi komposisi fase gerak divariasikan untuk mendap at-kan hasil analisis yang optimum. Perbandingan fase gerak dapar fosfat:methanol yang divariasikan adalah 75:25, 70:30, 80:20 dengan laju alir 1 ml/menit. Kondisi kromatografi yang memberikan data yang terbaik yang akan dipilih dan digunakan dalam penelitian ini.

3.4.4 Analisis kualitatif

3.4.4.1 Uji identifikasi Na Siklamat

Sampel Na Siklamat dengan konsentrasi 100 ppm diinjeksikan sebanyak 20 µl, dianalisis pada kondisi KCKT dengan perbandingan fase gerak dapar fosfat:methanol yang terpilih dengan laju alir 1 ml/menit pada panjang gelombang 201 nm. Selanjutnya untuk mempertegas identifikasi, pada larutan sampel tersebut ditambahkan sedikit larutan Na Siklamat BPFI (50 ppm) kemudian diinjeksikan dan dianalisis kembali pada kondisi KCKT yang sama. Bila waktu retensi tetap dan luas area yang diperoleh bertambah. Sampel dinyatakan mengandung Na Siklamat.

3.4.5 Analisis kuantitatif

3.4.5.1 Pembuatan larutan induk baku Na Siklamat BPFI

Ditimbang seksama sejumlah 25,0 mg Na Siklamat BPFI, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan dengan pelarut sampai garis tanda, disonikasi selama 15 menit dan diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 250 ppm (LIB I).

3.4.5.2 Pembuatan kurva kalibrasi Na Siklamat BPFI

Dipipet LIB I sebanyak 2,0 ml; 4,0 ml; 6,0 ml; 8,0 ml; dan 10,0 ml; dan, dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda. Dikocok sehingga diperoleh konsentrasi 50,0 ppm, 100,0 ppm, 150,0 ppm, 200,0 ppm, dan 250,0 ppm. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm, dan diinjeksikan ke sistem KCKT sebanyak 20 µl dan dideteksi pada panjang gelombang 201 nm. Dari luas area yang diperoleh pada kromatogram dibuat kurva kalibrasi kemudian dihitung persamaan garis regresi dan faktor korelasinya.

3.4.5.3 Penetapan kadar sampel

Ditimbang seksama 1 g sampel yang mengandung Na Siklamat (sebanyak 6 kali pengulangan). Masing-masing dimasukkan ke dalam labu tentukur 10 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, dikocok, kemudian disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm dan disonikasi selama 15 menit. Diinjeksikan sebanyak 20 µl menggunakan autosampler ke sistem KCKT dan dideteksi pada panjang gelombang 201 nm dengan perbandingan fase gerak dapar fosfat pH 7,0:methanol (70:30), laju alir 1 ml/menit. Dilakukan sebanyak 6 kali perlakuan untuk setiap sampel.

Konsentrasi dapat dihitung dengan mensubstitusikan luas area sampel pada Y dari persamaan regresi : Y = ax + b.

3.4.5.4 Analisis data penetapan kadar secara statistik

Data perhitungan kadar dianalisis secara statistik menggunakan uji T.

Menurut Rubin (2012), rumus yang digunakan untuk menghitung Standar Deviasi (SD) adalah :

1 ) ( 2   



n X X SD

Kadar dapat dihitung menggunakan rumus:

K =

Dan untuk menentukan data diterima atau ditolak digunakan rumus:

t hitung n SD X X /  

Dengan dasar penolakan data apabila t hitung ≥ t tabel, pada taraf kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1.

Keterangan :

SD = Standar deviasi

X = Kadar dalam satu perlakuan

X = Kadar rata-rata dalam satu sampel n = Jumlah pengulangan

Untuk mencari kadar sebenarnya dapat digunakan rumus:

n SD x t

X _(11/2)dk

  _

Keterangan:

μ = Kadar sebenarnya X = Kadar sampel n = Jumlah pengulangan

t = Harga ttabel sesuai dengan derajat kepercayaan

dk = Derajat kebebasan

3.4.6 Validasi metode

3.4.6.1 Akurasi (kecermatan)

Ditimbang seksama 1g sampel Vitacool lalu dilakukan prosedur yang sama seperti pada penetapan kadar sampel. Ditimbang lagi sampel Vitacool sebanyak 1 g dan ditambahkan 1 ml baku siklamat (200 ppm) lalu dilakukan prosedur yang

sama seperti pada penetapan kadar sampel. Dilakukan 6 kali replikasi. Menurut Harmita (2004), hasil dinyatakan dalam persen perolehan kembali (% recovery). Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan rumus:

% Perolehan kembali =

A A F C

C C

* 

x 100 %

Keterangan :

CF = konsentrasi sampel dengan penambahan baku siklamat (ppm)

CA = konsentrasi sampel tanpa penambahan baku siklamat (ppm)

C*A = konsentrasi baku siklamat yang ditambahkan (ppm)

3.4.6.2 Presisi (keseksamaan)

Untuk menguji data presisi (RSD), diambil rata-rata dari data % perolehan kembali (6 kali replikasi) kemudian dihitung standar deviasi. Setelah itu, dihitung % RSD dengan cara standar deviasi dibagi rata-rata dari % perolehan kembali kemudian dikali 100%.

Menurut Gandjar dan Rohman (2007), nilai RSD dirumuskan dengan:

% 100

x X SD RSD

Keterangan:

RSD = Standar Deviasi Relatif (%) SD = Standar deviasi

X = Kadar rata-rata sampel

Sementara itu, nilai SD dihitung dengan :

∑ ²

Dimana :

X = nilai dari masing-masing pengukuran

X = rata-rata (mean) dari pengukuran N = banyaknya data

3.4.6.3 Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)

Nilai batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) dihitung dari persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi. Menurut Ephstein (2004), Batas Deteksi (Limit Of Detection/ LOD) dan Batas Kuantitasi (Limit Of Quantitation/ LOQ) dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

2 ) ( /

2

 





n Yi Y x

Sy

Slope x Sy x LOD3 /

Slope x Sy x LOQ10 /

Keterangan:

Sy/x = Standar Deviasi Slope = Derajat Kemiringan

   

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penentuan pH Dapar Fosfat

Pada penelitian ini ditentukan pH dapar fosfat yang optimal untuk digunakan sebagai fase gerak yang digunakan dalam penentuan kadar Na Siklamat dengan metode KCKT menggunakan kolom Agilent C18 (150 x 4,6

mm), detektor UV-Vis. Panjang gelombang yang dipilih adalah 201 nm.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa pH dapar fosfat yang optimal untuk penetapan kadar Na Siklamat dalam minuman ringan adalah pH 7,0. Hal ini sesuai dengan kestabilan Na Siklamat pada pH 5,5-7,5 (Windholz dkk, 1983) sehingga Na Siklamat tidak terionisasi dan menghasilkan retensi yang lebih baik karena tetap berada dalam bentuk nonionik karena dengan penambahan dapar fosfat pH 7,0 senyawa yang dapat terion tidak menghasilkan puncak dengan tailing yang lebar dan reproduksibilitas retensinya baik (Heyrman dan Henry, 2006). Hubungan antara pengaruh pH dapar fosfat terhadap parameter kromatogram dapat dilihat pada Tabel 4.1 dibawah ini. Kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 1

Tabel 4.1 Pengaruh pH dapar fosfat terhadap parameter kromatogram

4.2 Penentuan Komposisi Fase Gerak

Pada penelitian ini sampel yang ditentukan merupakan sediaan minuman ringan yang mengandung Na Siklamat dengan metode KCKT menggunakan kolom Agilent C18 (150 x 4,6 mm), detektor UV-Vis dengan fase gerak dapar

fosfat : methanol. Panjang gelombang yang dipilih adalah 201 nm.

Dari hasil orientasi pada penentuan kondisi kromatografi yang terbaik untuk Na Siklamat diperoleh komposisi fase gerak larutan dapar fosfat pH 7,0 dan methanol 70 : 30, laju alir 1 ml/menit. Pemilihan fase gerak yang terbaik ini didasarkan pada theoritical plate yang paling baik. Pada ketiga sampel dengan rasa teh (Sisri, Teajus, X-Teh), tidak didapatkan bentuk kromatogram yang baik pada perbandingan komposisi fase gerak manapun, sehingga tidak dilakukan analisis lebih lanjut. Hal ini dikarenakan perbedaan komposisi bahan tambahan dalam minuman ringan rasa teh yang memiliki senyawa yang memiliki waktu retensi yang berhimpitan dengan waktu retensi Na Siklamat sehingga diperlukan kondisi kromatografi yang berbeda. Hubungan antara pengaruh komposisi fase

pH Waktu Retensi

(menit) Area

Theoritical plate

Tailing factor

4,5 3,322 280,67 561 1,99

5,5 3,131 92,01 1503 2,08

6,0 3,128 79,30 1611 2,48

6,5 3,163 69,45 1743 1,31

7,0 3,323 116,25 2100 1,04

gerak terhadap parameter kromatogram dapat dilihat pada Tabel 4.2 dibawah ini. Kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 2

Tabel 4.2 Pengaruh komposisi fase gerak terhadap parameter kromatogram

4.3 Analisis Kualitatif

Pemisahan Na Siklamat dengan menggunakan kromatografi fase balik terjadi karena Na Siklamat bersifat polar. Untuk mengetahui bahwa sampel yang dianalisis mengandung Na Siklamat dilakukan spiking yaitu menambahkan bahan baku ke dalam sampel pada kondisi kromatografi yang sama. Hal ini dilakukan dengan cara : Pertama, dilakukan proses kromatografi sampel tanpa penambahan baku. Kedua, sampel dengan penambahan bahan baku dilakukan proses kromatografi. Hasil kromatogram dapat dilihat pada Gambar 1 dan Gambar 2 di bawah ini :

Perbandingan Fase Gerak Dapar Fosfat:methanol

Waktu Retensi

(menit) Area

Theoritical plate

Tailing factor

70:30 3,317 67,22 2068 0,986

75:25 4,095 140,40 1568 1,692

Gambar

Gambar 4

4.1 Kroma Agilent fosfat : penyunt

4.2 Krom Agilen fosfat penyun

atogram Na C18 (150 x

methanol tikan 20 µl d

matogram h nt C18 (150

: methano ntikan 20 µl

a Siklamat x 4,6 mm) d

(70 : 30 dan deteksi

hasil spike

x 4,6 mm) ol (70 : 30

l dan deteks

secara KCK dengan perb 0) dan laju

pada panja

secara KC dengan per 0) dan laju

si pada panj

KT meng bandingan f u alir 1 m ang gelomba

CKT meng rbandingan u alir 1 m jang gelomb

ggunakan k fase gerak ml/menit, vo

ang 201 nm

ggunakan k fase gerak ml/menit, vo

bang 201 nm kolom dapar olume m. kolom dapar olume m

Dari kromatogram diatas dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan luas area dan tinggi puncak pada kromatogram setelah penambahan baku dibandingkan dengan sebelum penambahan bahan baku maka dapat diidentifikasi bahwa sampel mengandung Na Siklamat (Johnson dan Stevenson, 1991).

4.4 Analisis Kuantitatif

4.4.1 Penentuan kurva kalibrasi

Penentuan kurva kalibrasi Na Siklamat BPFI ditentukan berdasarkan luas area pada konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 150 ppm, 200 ppm, dan 250 ppm, diperoleh hubungan yang linier dengan koefisien korelasi, r = 0,9996 dan persamaan regresi Y = 0,5998 X + 1,69. Nilai r ≥ 0,995 menunjukkan adanya korelasi linier yang menyatakan adanya hubungan antara luas area dan konsentrasi (Moffat, dkk., 2005). Hasil penentuan kalibrasi dapat dilihat pada Gambar 3 di bawah ini.

Gambar 4.4.2 Pene Hasi pada Tabe Tabel 4.3 No 1 2 3

4.3 Kurva kolom gerak volum 201 nm etapan kad il penetapan el 4.3 di baw Hasil pen

Nutrijeruk Vitacool Segar Sari

a kalibrasi N Agilent C dapar fosf e penyuntik m.

dar analit d

n kadar natr wah ini. netapan kada Nama Sed k i Na Siklama C18 (150 x

fat:methano kan 20 µl d

dalam samp

rium siklam

ar Na Siklam

diaan

at BPFI sec x 4,6 mm) l (70:30) dan deteks

pel yang dia

mat dalam m

mat dalam m

cara KCKT dengan pe

dan laju a si pada pan

analisis minuman rin minuman rin Kadar Na 1085 1075 602,6

T menggun erbandingan

alir 1 ml/m njang gelom

ngan dapat d

ngan

a Siklamat ( 5,444± 33,52

5,39 ± 92,98 62 ± 112,1

nakan n fase menit, mbang dilihat (ppm) 2 8 6

Dari sediaan Na Siklamat dalam minuman ringan yang ditentukan kadarnya berdasarkan luas area hanya Segar Sari yang memenuhi persyaratan kadar umum untuk Na Siklamat dalam minuman ringan menurut BPOM (2004) dimana persyaratan maksimal Na Siklamat dalam minuman ringan non karbonasi adalah 1000 ppm, sementara Nutrijeruk dan Vitacool melebihi batas yang ditentukan. Hal ini dapat dikaitkan juga dengan tidak dicantumkannya kadar siklamat dalam label minuman ringan Nutrijeruk dan Vitacool sehingga dapat membahayakan konsumen yang kurang teliti melihat label kemasan.

4.5 Hasil Uji Validasi

Pada penelitian ini dilakukan uji validasi metode dengan metode standar adisi terhadap sampel tablet Vitacool yang meliputi uji akurasi dengan parameter

% recovery dan uji presisi dengan parameter RSD (Relative Standard Deviasi),

LOD (Limit of Detection) dan LOQ (Limit of Quantitation).

Uji akurasi dengan parameter % recovery dilakukan dengan membuat enam kali replikasi (Harmita, 2004).

Data hasil ujivalidasi, dengan parameter akurasi dan presisi dengan metode adisi standar dapat dilihat padaTabel 4.4.

Tabel 4.4 Hasil Pengujian Validasi, dengan parameter akurasi, presisi, batas deteksi (LOD), batas kuantitasi (LOQ) Na Siklamat Vitacool dengan menggunakan metode adisi standar

Dari tabel di atas diperoleh hasil pengujian akurasi dengan kadar rata-rata

% recovery 101,98%, % recovery ini dapat diterima karena memenuhi syarat akurasi, bahwa rentang rata-rata % recovery ialah 97-103%. Maka dapat disimpulkan bahwa metode ini mempunyai akurasi yang baik (Epshtein, 2004). Hasil uji presisi dengan parameter RSD (Relative Standard Deviasi) diperoleh 0,15%, persyaratan nilai RSD yang ditentukan adalah < 2%. Maka dapat disimpulkan bahwa metode analisis mempunyai presisi yang baik (Harmita, 2004).

Batas deteksi dan batas kuantitasi dihitung dari persamaan regresi yang diperoleh dalam kurva kalibrasi. Dari hasil perhitungan diperoleh nilai LOD

9,3756 ppm dan nilai LOQ 31,2521 ppm. No Baku yang ditambahkan

( ppm )

Luas Area Kadar ( ppm ) Sebelum

Penambahan

Sesudah Penambahan

Sebelum Penambahan

Setelah Penambahan

1 20,71 76,1 78,4 1245,33 1283,68

2 20,71  75,3 75,4 1231,99 1233,66 3 20,71  76,6 80,0 1253,67 1310,35 4 20,71  76,3 77,4 1248,67 1267,00 5 20,71  75,7 75,8 1238,66 1240,33 6 20,71  76,5 77,1 1252,00 1262,00 Kadar rata – rata (%) Recovery = 101,98

Standar Deviasi = 1,8745 Relative Standar Deviasi (%) = 0,15 Batas Deteksi (LOD) (ppm) = 9,3756 Batas Kuantitasi (LOQ) (ppm) = 31,2521

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Natrium siklamat dalam minuman ringan dapat ditentukan kadarnya secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan kondisi kromatografi yang optimal menggunakan kolom Agilent C18 (150 x 4,6 mm), detektor

UV-Vis dengan perbandingan fase gerak dapar fosfat pH 7,0:methanol (70:30), laju alir 1 ml/menit pada panjang gelombang 201 nm. Metode ini memberikan hasil akurasi dan presisi yang baik dengan % recovery = 101,98%, relatif standar deviasi (RSD) = 0,15%; batas deteksi (LOD) = 9,3756 ppm dan batas kuantitasi (LOQ) = 31,2521 ppm.

2. Dari enam minuman ringan yang dianalisis, tiga di antaranya, yaitu Nutrijeruk, Vitacool, dan Segar Sari dapat ditentukan kadarnya secara KCKT, dimana kadar Nutrijeruk dan Vitacool yang diperoleh melebihi batas yang ditentukan oleh BPOM sementara Segar Sari memenuhi persyaratan yaitu mengandung Na Siklamat tidak lebih dari 1000 ppm. Sedangkan untuk jenis minuman Teajus, Sisri, dan X-Teh tidak dapat dianalisis dengan kondisi kromatografi yang dilakukan.

5.2 Saran

Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk melakukan penetapan kadar Na Siklamat dalam bentuk minuman ringan dengan rasa teh dan bentuk sediaan lain yang beredar dipasaran secara KCKT dengan kondisi kromatografi lain.

DAFTAR PUSTAKA

BPOM. (2004). Keputusan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor : HK.00.05.5.1.4547TentangPersyaratan Penggunaan Bahan Tamnbahan PanganPemanis Buatan dalam Produk Pangan.

Jakarta: BPOM RI. Hal. 36.

_____. (2006). Metode Analisa BPOM RI. Medan: BPOM RI. Hal. 31.

Cahyadi, W. (2005). Analisis dan Aspek Kesehatan Bahan Tambahan Pangan.

Jakarta: PT. Bumi Aksara. Hal. 67-74.

Ditjen POM. (1995). Farmakope Indonesia.Edisi ke IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Hal.288-289, 293.

Épshtein, N.A. (2004). Validation of HPLC Techniques for Pharmaceutical Analysis. Pharmaceutical Chemistry Journal 38(4): 212 – 228. Ermer, J. (2005). Analytical Validation within the Pharmaceutical

Environment.In: J. Ermer and J.H. McB. Miller (eds).Method Validation in Pharmaceutical Analysis. Weinhein: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA. Hal. 54, 63-70,80,101.

FAO. (1996). Sodium Cyclamate.FNP 52. (4): 2.

Gandjar, I.G., dan Rohman, A. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Hal. 323-349.

Gritter, R.J, Bobbit, J.M, dan Schwarting, A.E. (1985). Introduction Chromatography.Edisi Ketiga. Penerjemah Kosasih

Padmawinata.Pengantar Kromatografi. Bandung: Penerbit ITB. Hal. 186. Harmita. (2004). Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara

Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian. (3): 117-135.

Heyrman, A.N., dan Henry, R.A. Importance of Controlling Mobile Phase pH in Reversed Phase HPLC.Keystone Technical Bulletin. Tanggal akses 13 Mei 2014. http://www.4uchem.cn/LiteratureChinese/HPLC-buffer.pdf

Hunt, F., Bopp, B.A., dan Price P. (2011). Cyclamate. Editor Lyn O’Brien-Nabors. Alternative Sweeteners. Edisi keempat. Boca Raton: CRC Press. Hal. 94-95.

Ibrahim, S., (2006). Penentuan Kadar Beberapa Pemanis Sintetis dalam Makanan Jajanan dengan Metode KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).

Johnson, E.L., dan Stevenson, R. (1978). Principle Liquid Chromatography.. Penerjemah Padmawinata, K. (1991). Dasar Kromatografi Cair.

Bandung: Penerbit ITB. Hal. 1-40.

Meyer, V.R. (2004). Practical High-Performance Liquid Chromatography. Edisi keempat. Chichester: John Wiley and Sons Inc. Hal. 4.

Moffat, A.C., Osselton, M.D., dan Widdop, B. (2005). Clarke’s Analysis Of Drug And Poisons. Edisi ketiga. London: Pharmaceutical Press. Electronic Version. Hal. 153.

Munson, J.W. (1984).Pharmaceutical Analysis Modern Methods. Part B.

Penerjemah Harjana. (1991). Analisis farmasi Metode Modern. Parwa B., Surabaya: Penerbit Air langga University Press. Hal. 14-46.

Rubin, A. (2013). Statistics for Evidence-Based Practice and Evaluation.Edisi ketiga. Belmont: Brooks/Cole. Hal. 71

Saparinto, C., dan Hidayati, D. (2006). Bahan Tambahan Pangan. Yogyakarta: Kanisius. Hal. 35, 78.

Sjöberg, A.M., dan Alanko T.A. (1987). Spectrophotometric Determination of Cyclamate in Foods:NMKL Collaborative Study.J Assoc Off Anal Chem..

70(3): 588-590.

Sugiono. (2011). Metode Penelitian Kuantitatif, Kualitatif, dan R&D. Bandung: Alfabeta. Hal. 82

USPNF. (2007). The United States Pharmacopeia. Edisi ke-30. New York: Penerbit Electronic Version. Hal. 1895.

Wibowotomo, B. (2008). Pengembangan Metode Penetapan Kadar Siklamat Berbasis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Guna Diimplementasikan Dalam Kajian Paparan. Bogor: IPB. Hal. 27-28.

Windholz, M., Budavari, S., Blumetti, R.F., dan Otterbein, E.S. (1983). The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals.

Edisi kesepuluh. Rahway: Merck & Co., Inc. Hal: 2692.

Lampiran

Dap (70:30) da

Dap (70:30) da

n 1. Kroma pH dap

par fosfat pH an laju alir 1

par fosfat pH an laju alir 1

atogram pe par fosfat ya

H 4,5 denga 1 ml/menit

H 5,5 denga 1 ml/menit

enyuntikan ang optimu

an perbandin

an perbandin

larutan Na m pada ana

ngan fase ge

ngan fase ge

a Siklamat alisis

erak dapar f

erak dapar f

untuk me

fosfat : met

fosfat : met encari

hanol

Lampiran

Dap (70:30) da

Dap (70:30) da

n 1. (Lanju

par fosfat pH an laju alir 1

par fosfat pH an laju alir 1

utan)

H 6,0 denga 1 ml/menit

H 6,5 dengan 1 ml/menit

an perbandin

an perbandin

ngan fase ge

ngan fase ge

erak dapar f

erak dapar f

fosfat : met

fosfat : meth hanol

Lampiran

Dap (70:30) da

Dap (70:30) da

n 1. (Lanju

par fosfat pH an laju alir 1

par fosfat pH an laju alir 1

utan)

H 7,0 dengan 1 ml/menit

H 7,5 dengan 1 ml/menit

an perbandin

an perbandin

ngan fase ge

ngan fase ge

erak dapar f

erak dapar f

fosfat : meth

fosfat : meth hanol

Lampiran

n 2. Kroma kompo analisi

atogram pe osisi fase ge is

enyuntikan erak dapar

A

B

larutan Na fosfat : me

a Siklamat ethanol yang

untuk me g optimum

encari pada

Lampirann 2. (Lanjuutan)

C

Lampirann 2. (Lanjuutan)

E

Lampiran

Pe Alir 1 ml/ (Sisri), F (

n 2. (Lanju

rbandingan /menit dari (Teajus), da

utan)

n Fase Gera A (BPFI), an G (X-Teh

G ak dapar fos

, B (Vitaco h)

A

sfat : metha ool), C (Nut

anol (70 : 3 trijeruk), D

30) dengan D (Segar Sa

n Laju ari), E

Lampirann 2. (Lanjuutan)

B

Lampirann 2. (Lanjuutan)

D

Lampiran

Pe Alir 1 ml/ (Sisri), F (

n 2. (Lanju

rbandingan /menit dari (Teajus), da

utan)

n Fase Gera A (BPFI), an G (X-Teh

F

G ak Dapar fo

, B (Vitaco h)

osfat : meth ool), C (Nut

anol (75 : 2 trijeruk), D

25) dengan D (Segar Sa

n Laju ari), E

Lampirann 2. (Lanjuutan)

A

Lampirann 2. (Lanjuutan)

C

D

Lampiran

Perb Alir 1 ml/ (Sisri), F (

n 2. (Lanju

bandingan F /menit dari (Teajus), da

utan)

Fase Gerak A (BPFI), an G (X-Teh

F

G k Dapar fos

, B (Vitaco h)

sfat : metha ool), C (Nut

anol (80 : 2 trijeruk), D

20) dengan D (Segar Sa

Laju ari), E

Lampiran

Pe Alir 1 ml/m

Pe Alir 1 ml/m

n 3. Kroma kalibra

rbandingan menit konse

rbandingan menit konse

atogram lar asi

n Fase Gera entrasi 50 p

n Fase Gera entrasi 100

rutan Na S

A ak Dapar fo ppm.

B ak Dapar fo

ppm.

iklamat BP

osfat : meth

osfat : meth

PFI pada p

anol (70 : 3

anol (70 : 3

pembuatan k

30) dengan

30) dengan kurva

n Laju

Lampiran

Per Alir 1 ml/m

Per Alir 1 ml/m

n 3. (Lanju

rbandingan menit, kons

rbandingan menit, kons

utan)

Fase Gerak sentrasi 150

Fase Gera sentrasi 200

C ak Dapar fo 0 ppm.

D ak Dapar fo 0 ppm.

sfat : meth

osfat : meth

anol (70:3

hanol (70:3

30) dengan

30) dengan n Laju

Lampiran

Per Alir 1 ml/m

A, Siklamat B 250 ppm. mm), per penyuntik panjang ge

n 3. (Lanju

rbandingan menit, kons

B, C, D, d BPFI denga

Dengan m rbandingan kan 20 µl d

elombang 2

utan)

Fase Gera sentrasi 250

dan E merup an konsentr menggunaka fase gera dengan auto

201 nm.

E ak Dapar fo 0 ppm.

pakan krom rasi 50 ppm an KCKT d

ak dapar

osampler, la

osfat : meth

matogram ha m, 100 ppm

dengan kolo fosfat : m aju alir 1 m

hanol (70:3

asil penyun m, 150 ppm, om Agilent methanol ( ml/menit, de

30) dengan

ntikan laruta , 200 ppm t C18 (150

(70:30), vo etektor UV Laju an Na m, dan x 4,6 olume pada

Lampiran 4. Perhitungan persamaan regresi dari kurva kalibrasi Na Siklamat BPFI yang diperoleh secara KCKT pada panjang gelombang 201 nm konsenterasi (X) vc luas area (Y) untuk Na Siklamat

Y = ax + b

       

      ,  

= 0,5998 b = Y a

= (76,38) – (0,5998) (125) = 1,405

Sehingga diperoleh persamaan regresi Y = 0,5998 X + 1,405

Untuk mencari hubungan konsentrasi (X) dengan luas area (Y) digunakan pengujian koefisien korelasi (r)

r ∑XY ∑X ∑Y /n

∑X ∑X /n ∑Y ∑Y /n

, /

/ , , /

No.

Konsentrasi

(ppm) Luas Area

XY X2 Y2

X Y

1 0 0 0 0 0,0000

2 50 31,53 1575 2500 992,25

3 100 64,2 6420 10000 4121,64

4 150 90,8 13620 27500 8244,64

5 200 120,7 24140 40000 14568,49

6 250 151,1 37775 62500 22831,21

∑ 750 458,3 83530 137500 50758,23 Rata2 125 76,38

= 26242,5 x , ,

, = 0,9996

Lampiran 5. Perhitungan recovery dengan metode adisi standar

Ditimbang seksama 1,003 g sampel Vitacool dan ditambahkan baku Na Siklamat sebanyak 1 ml (mengandung 200 ppm Na Siklamat) dan dimasukkan kedalam labu tentukur 10 ml, dilarutkan dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan kadar baku siklamat 20,71 ppm, dikocok, kemudian disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm. Diinjeksikan sebanyak 20 µl menggunakan autosampler ke sistem KCKT dan dideteksi pada panjang gelombang 201 nm dengan perbandingan fase gerak dapar fosfat : methanol (70:30), laju alir 1 ml/menit. Dilakukan sebanyak 6 kali perlakuan.

Lampiran

n 6. Kromaatogram haasil recovery

A

B

Lampirann 6.(Lanjuutan)

C

Lampiran

A, penambah dengan me fase gerak

n 6.(Lanju

B, C, D, han bahan b enggunakan k dapar fos

utan)

E, dan F baku larutan n kolom Ag sfat : metha

E

F

merupakan n sampel V gilent C18 (1

anol (70:30

n kromatogr Vitacool , ya 50 x 4,6 mm 0), volume

ram hasil ang dianalis m), perband penyuntika

Recovery

sa secara K dingan an 20 µl de

tanpa KCKT

Lampirann 6.(Lanjuutan)

A

Lampirann 6.(Lanjuutan)

C

Lampiran

A, B, C, penambah dengan m gerak Da

autosampl

n 6.(Lanju

, D, E, d han bahan b menggunaka

apar fosfat

ler, laju alir

utan)

dan F meru baku larutan an kolom A : methano r 1 ml/menit

E

F

upakan kro n sampel V Agilent C18

ol (70:30), t, detektor U

omatogram Vitacool , ya (150 x 4, volume p UV pada pa

hasil R

ang dianalis 6 mm), pe penyuntikan anjang gelom

Recovery de sa secara K erbandingan n 20 µl de

mbang 201 engan KCKT n fase engan nm.

Lampiran 7. Hasil pengujian validasi, dengan parameter akurasi, presisi, batas deteksi (LOD), batas kuantitasi (LOQ) Na Siklamat pada Vitacool dengan menggunakan metode adisi standar

No Baku yang ditambahkan ( ppm )

Luas Area Kadar ( ppm )

Sebelum Penambahan

Sesudah Penambahan

Sebelum Penambahan

Setelah Penambahan

1 20,71 76,1 78,4 1245,33 1283,68

2 20,71  75,3 75,4 1231,99 1233,66

3 20,71  76,6 0,0 1253,67 1310,35

4 20,71  76,3 77,4 1248,67 1267,00 5 20,71  75,7 75,8 1238,66 1240,33 6 20,71  76,5 77,1 1252,00 1262,00 Kadar rata – rata (%) Recovery = 101,98

Standar Deviasi = 1,8745 Relative Standar Deviasi (%) = 0,15 Batas Deteksi (LOD) (ppm) = 9,3756 Batas Kuantitasi (LOQ) (ppm) = 31,2521

Lampiran 8. Contoh perhitungan % recovery dengan metode adisi standar

% Recovery = A-B

Baku yang ditambahkanx 100%

Keterangan :

A = Konsentrasi sampel setelah penambahan baku siklamat B = Konsentrasi sampel sebelum penambahan baku siklamat % Recovery = 1266,17 – 1245,05 x100%

20,71

Lampiran 9. Perhitungan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)

Persamaan Regresi : Y = ax + b Y = 0,5998X + 1,69

No Konsentrasi X

Luas Area Y

Yi Y – Yi ( Y – Yi )2

1 50 31,53 31,68 _{-0,15 0,0225} 2 100 64,2 61,67 _{2,93 8,5849} 3 150 90,8 91,66 _{-0,86 0,7398} 4 200 120,7 121,65 _{0,95 0,9025} 5 250 151,1 151,64 -0,54 0,2915

∑ 10,541

2 ) ( ) / ( Deviasi Standar 2   



n Yi Y x Sy





2 5 10,541 /   x Sy

Sy/x = 1,8745

Slope x Sy x

LOD) 3 /

( Deteksi

Batas 

0,5998 1,8745 3x

LOD

LOD = 9,3756 µg/ ml

Slope x Sy x

LOQ) 10 /

( Kuantitasi

Batas 

LOQ = 31,2521 µg/ ml 5998 , 0 1,8745 10x LOQ

Lampirann 10. Krommatogram daari Nutrijeru

A

B uk

Lampirann 10.(Lanjutan)

C

Lampiran

A, B, C, Nutrijeruk (150 x 4,6 penyuntik panjang ge

n 10.(Lanj

D ,E dan F k yang dian 6 mm), perb kan 20 µl d

elombang 2

utan)

F merupaka nalisa secara bandingan fa dengan auto

201 nm.

E

F

an kromato a KCKT de fase gerak d

osampler, la

ogram peny engan meng dapar fosfat aju alir 1 m

yuntikan 6 k gunakan ko : methanol ml/menit, de

kali dari la olom Agilen

(70:30), vo etektor UV

arutan nt C18

olume pada

Lampiran 11. Contoh perhitungan untuk mencari kadar Na siklamat dalam sampel

Y = 0,5998X + 1,405 Luas area = 57,97 Berat Sampel = 1,0307 g

X = 57,97 – 1,405 0,5998

= 94,3064 ppm

Rumus perhitungan kadar Na Siklamat =

Dimana K = Kadar total Na Siklamat dalam sampel (ppm)

X = Konsentrasi Na Siklamat Sesudah pengenceran (ppm) V = Volume sampel (ml)

Fp = Faktor pengenceran Bs = Berat sampel

Kadar total Na Siklamat = 9 , ppm /

1,002 g

= 188,82 mg/200 g = 943,06 mg/kg

Kadar Na Siklamat ke-6 pengulangan pada sampel Nutrijeruk dan kadar Na siklamat pada % perolehan kembali dapat dihitung dengan cara yang sama seperti contoh di atas

Lampiran 12. Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya dari penyuntikkan larutan nutrijeruk

No

Kadar (mg/kg)

( X - ) ( X - )2 X

1 1091,95 30,24 914,46

2 1106,45 44,74 2001,67

3 943,06 -118,65 14077,82

4 1074,94 13,23 175,03

5 1064,27 2,56 6,55

6 1089,61 27,9 778,41

∑ X=6370,28 ∑ (X - )2 = 17953,94 =1061,71 1 ) ( 2   



n X X SD 5 17953,94

 = 59,92

Pada tingkat kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1 = 6 – 1 = 5 Diperoleh t tabel = 4,0321

Dasar penolakan data apabila t hitung≥ t tabel

t hitung =

n SD X X / 

t hitung data 1 =

6 / 59.92 | 30,24 | = 1,24

t hitung data 2 =

6 / 59,92 | 44,74 | = 1,83

t hitung data 3 =

6 / 59,92 | 65 , 118 | = 4,85

t hitung data 4 =

6 / 59,92 | 23 , 13 | = 0,54

t hitung data 5 =

6 / 59,92 | 56 , 2 | = 0,10

t hitung data 6 =

6 / 59,92 | 27,9 | = 1,14

Lampiran 12.(Lanjutan)

No

Kadar (ppm)

( X - ) ( X - )2 X

1 1091,95 6,506 42,33

2 1106,45 21,006 441,25

3 1074,94 -10,504 110,33

4 1064,27 -21,174 448,34

5 1089,61 4,166 17,36

∑ X=5427,22 ∑ (X - )2 = 1059,61 =1085,444 1 ) ( 2   



n X X SD 4 1059,61

 = 16,28

Pada tingkat kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1 = 5 – 1 = 4 Diperoleh t tabel = 4,6041

Dasar penolakan data apabila t hitung≥ t tabel

t hitung =

n SD X X / 

t hitung data 1 =

5 / 16,28 | 506 , 6 | = 0,89

t hitung data 2 =

5 / 16,28 | 21,006 | = 2,89

t hitung data 3 =

5 / 16,28 | -10,504 | = 1,44

t hitung data 4 =

5 / 16,28 | 21,174 | = 2,91

t hitung data 5 =

5 / 16,28 | 166 , 4 | = 0,57

Jadi kadar sebenarnya terletak antara : µ = X ± t(1-1/2α)dk x

n SD

= 1085,444± 4,6041 x

5 16,28

Lampiran 13. Tabel hasil analisa kadar Na siklamat dalam Nutrijeruk

No

Berat Sampel

(g)

Volume

(ml) Fp Kadar (ppm)

Theoritical Plate

Tailing Factor

Luas Area 1 1,0307 200 10/1 1091,95 2525 1,01 66,9 2 1,0351 200  10/1 1106,45 2703 1,20 67,8 3 1,0402 200  10/1 943,06 2946 1,14 58,0 4 1,0415 200  10/1 1074,94 2530 1,16 65,9 5 1,0430 200  10/1 1064,27 2759 1,07 65,2 6 1,0358 200  10/1 1089,61 2703 1,16 66,8

Lampirann 14. Kromaatogram darri larutan V

A

B

Lampiran

n 14. (Lanjuutan)

C

Lampiran

A, B, C, Vitacool (150 x 4,6 penyuntik panjang ge

n 14. (Lanju

D ,E dan F yang diana 6 mm), perb kan 20 µl d

elombang 2 utan)

F merupaka alisa secara bandingan fa dengan auto

201 nm.

E

F

an kromato KCKT den fase gerak d

osampler, la

ogram peny ngan mengg dapar fosfat

aju alir 1 m

yuntikan 6 k gunakan ko

: methanol ml/menit, de

kali dari la olom Agilen (70:30), vo etektor UV

arutan nt C18

olume pada

Lampiran 15. Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya dari penyuntikkan larutan Vitacool

No Kadar (mg/kg) ( X - ) ( X - )2 X

1 1077,11 1,72 2,96

2 1041,93 -33,46 1119,57

3 1114,29 38,9 1513,21

4 1074,44 -0,95 0,9025

5 1153,80 78,41 6148,13

6 990,75 -84,64 7163,93

∑ X = 6452,32

∑ (X - )2 =15948,70 = 1075,39 1 ) ( 2   



n X X SD 1 6 15948,70 

 = 56,48

Pada tingkat kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1 = 6 – 1 = 5 Diperoleh t tabel = 4,0321

Dasar penolakan data apabila t hitung≥ t tabel

t hitung =

n SD X X / 

t hitung data 1 =

6 / 56,48 72 , 1 = 0,07

t hitung data 2 =

6 / 56,48 46 , 33  = 1,45

t hitung data 3 =

6 / 56,48 9 , 38 = 1,69

t hitung data 4 =

6 / 56,48 95 , 0  = 0,04

t hitung data 5 =

6 / 56,48 41 , 78 = 3,40

Lampiran 15. (Lanjutan) t hitung data 6 =

6 / 56,48

64 , 86 

= 3,67 Semua data diterima

Jadi kadar sebenarnya terletak antara : µ = X ± t(1-1/2α)dk x

n SD

= 1075,39 ± 4,0321 x

6 48 , 56

Lampiran 16. Tabel hasil analisa kadar Na siklamat dalam Vitacool

No

Berat Sampel

(g)

Volume

(ml) Fp Kadar (ppm)

Theoritical Plate

Tailing Factor

Luas Area 1 1,0052 10 _{10/1 1153,80} 2782 1,51 70,6 2 1,0038 10 10/1 _1077,11 2149 1,92 66,0 3 1,0047 10 10/1 _1114,29 2988 1,54 68,2 4 1,0035 10 10/1 _1041,93 2239 1,78 63,9 5 1,0038 10 10/1 _1074,44 3053 1,42 65,9 6 1,0021 10 10/1 _990,75 2982 1,14 60,8

Lampirann 17. Kromaatogram darri larutan Se

A

B

Lampirann 17. (Lanjuutan)

C

Lampiran

A, larutan Se Agilent C (70:30), v detektor U

n 17. (Lanju

B, C, D , egar Sari C18 (150 x 4

volume pen UV pada pan

utan)

,E dan F m yang diana 4,6 mm), p nyuntikan 2 njang gelom E F merupakan alisa secara perbandinga 20 µl denga mbang 201 n

kromatogra a KCKT de an fase ger an autosam

nm.

am penyunt engan meng

ak dapar fo

mpler, laju

tikan 6 kali ggunakan k osfat : met

alir 1 ml/m i dari kolom

hanol menit,

Lampiran 18. Analisis data statistik untuk mencari kadar sebenarnya dari penyuntikkan larutan Segar Sari

No Kadar (mg/kg) ( X - ) ( X - )2 X

1 627.13 6,92 47,89

2 565,77 -54,44 2963,71

3 596,95 -23,26 541,03

4 708,15 87,94 7733,44

5 622,12 1,91 3,65

6 601,12 -19,09 364,43

∑ X = 3721,24 ∑ (X - )2 = 11654,15 = 620,21 1 ) ( 2   



n X X SD 1 6 11654,15 

 = 48,28

Pada tingkat kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1 = 6 – 1 = 5 Diperoleh t tabel = 4,0321

Dasar penolakan data apabila t hitung≥ t tabel

t hitung =

n SD X X / 

t hitung data 1 =

6 / 48,28 92 , 6 = 0,35

t hitung data 2 =

6 / 48,28 44 , 54  = 2,76

t hitung data 3 =

6 / 48,28 26 , 23  = 1,18

t hitung data 4 =

6 / 48,28 94 , 87 = 4,46

t hitung data 5 =

6 / 48,28 91 , 1 = 0,09

t hitung data 6 =

6 / 48,28 09 , 19  = 0,97

Lampiran 18. (Lanjutan)

Untuk itu dihitung kembali dengan cara yang sama tanpa mengikutsertakan data ke-4

No Kadar (mg/kg) ( X - ) ( X - )2 X

1 627,13 24,51 600,74

2 565,77 -36,85 1357,92

3 596,95 -5,67 32,15

4 622,12 19,5 380,25

5 601,12 -1,5 2,25

∑ X = 3013,09 ∑ (X - )2 = 2373,31 = 602,62 1 ) ( 2   



n X X SD 1 5 2373,31 

 = 24,36

Pada tingkat kepercayaan 99% dengan nilai α = 0,01, dk = n – 1 = 5 – 1 = 4 Diperoleh t tabel = 4,6041

Dasar penolakan data apabila t hitung≥ t tabel

t hitung =

n SD X X / 

t hitung data 1 =

5 / 24,36 51 , 24 = 2,25

t hitung data 2 =

5 / 24,36 85 , 36  = 3,38

t hitung data 3 =

5 / 24,36 67 , 5  = 0,52

t hitung data 4 =

5 / 24,36 5 , 19 = 1,79

t hitung data 5 =

5 / 24,36 5 , 1 = 0,14

Semua data diterima. Jadi kadar sebenarnya terletak antara : µ = X ± t(1-1/2α)dk x

n SD

= 602,62 ± 4,6041 x

5 24,36

Lampiran 19. Tabel hasil analisa kadar Na siklamat dalam Segar Sari

No

Berat Sampel

(g)

Volume

(ml) Fp Kadar (ppm)

Theoritical Plate

Tailing Factor

Luas Area 1 1,0082 10 10/1 596,95 2782 0,79 37,2 2 1,0084 10 10/1 622,12 2149 0,77 38,7 3 1,0058 10 10/1 565,77 2988 0,83 35,3 4 1,0082 10 10/1 601,12 2239 1,22 37,5 5 1,0085 10 10/1 627,13 3053 1,21 39,0 6 1,0163 10 10/1 708,15 2982 1,35 43,9

Lampiran 20. Daftar Spesifikasi Sampel 1. Nutrijeruk

Komposisi : Air, gula pasir, asam sitrat, aroma orange, Na siklamat, Na benzoat, CI 19140, FCF 15985, Vitamin C

No Batch : 0CAFE

Produsen : Union Pasifik Indonesia No. Pendaftaran : MD 213127501535 Tgl. Kadaluwarsa : 31 Desember 2014 2. Vitacool

Komposisi : Air, gula pasir, perisa stroberi, Na siklamat, Na benzoat, pewarna merah

No. Batch : -

Produsen : PT Makmur Artha Sejahtera No. Pendaftaran : MD 250010003826

Tgl. Kadaluwarsa : 20 April 2014 3. Segar Sari

Komposisi : Mengandung 0,194 g/sachet Na Siklamat No. Batch : 004A13

Produsen : PT. Kinosentra Industrindo No. Pendaftaran : MD 249911155354

Lampiran 20. Daftar Spesifikasi Sampel 1. Nutrijeruk

Komposisi : Air, gula pasir, asam sitrat, aroma orange, Na siklamat, Na benzoat, CI 19140, FCF 15985, Vitamin C

No Batch : 0CAFE

Produsen : Union Pasifik Indonesia No. Pendaftaran : MD 213127501535 Tgl. Kadaluwarsa : 31 Desember 2014 2. Vitacool

Komposisi : Air, gula pasir, perisa stroberi, Na siklamat, Na benzoat, pewarna merah

No. Batch : -

Produsen : PT Makmur Artha Sejahtera No. Pendaftaran : MD 250010003826

Tgl. Kadaluwarsa : 20 April 2014 3. Segar Sari

Komposisi : Mengandung 0,194 g/sachet Na Siklamat

No. Batch : 004A13

Produsen : PT. Kinosentra Industrindo No. Pendaftaran : MD 249911155354

4. X-Teh

Komposisi : Air, gula pasir, ekstrak teh alami, aroma, siklamat, K. Sorbat

No. Batch : -

Produsen : Union Pasifik Indonesia No. Pendaftaran : -

Tgl. Kadaluwarsa : Desember 2014 5. Teajus

Komposisi : Gula, ekstrak teh, pemanis buatan Na Siklamat (0,11g/sachet), aspartam (0,07g/sachet), mengandung fenilalanin

No. Batch : 13122

Produsen : Wings Indonesia No. Pendaftaran : MD 550113018390 Tgl. Kadaluwarsa : Agustus 2014 6. Sisri

Komposisi : Gula, ekstrak teh, pemanis buatan Na Siklamat

No. Batch : C2413

Produsen : PT. Forisa Nusapersada No. Pendaftaran : MD 649910328304 Tgl. Kadaluwarsa : April 2015

Lampiran 23. Gambar alat – alat yang digunakan

Alat KCKT (Agilent)

Gambar 5 Sonifikator (Branson 1510)

Gambar 5 Sonifikator (Branson 1510)

Sonifikator (Branson 1510)

Lampiran 23. (Lanjutan)

Gambar 7 Sonifikator Kudos

Sonifikator Kudos