Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) terhadap Sel Vero yang Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida (H2O2)
TESIS
EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (Coleus
amboinicus Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI
DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
OLEH:
RENY HARYANI
NIM 147014021
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
Universitas Sumatera Utara
EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (Coleus
amboinicus Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI
DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh
gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
RENY HARYANI
NIM 147014021
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
Universitas Sumatera Utara
LEMBAR PERSETUJUANTESIS
EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (Coleus
amboinicus Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI
DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
OLEH:
RENY HARYANI
NIM 147014021
Medan, Februari 2017
Menyetujui:
KomisiPembimbing,
KomisiPenguji,
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
NIP 195301011983031004
Prof. Dr. Rosidah, M.Si.,Apt.
NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP 195707231986012001
Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt.
NIP 197506102005012003
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
NIP 195301011983031004
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP 195707231986012001
Mengetahui:
Sekretaris Program Studi,
Disahkan Oleh:
Dekan,
Prof. Dr. Rosidah, M.Si.,Apt.
NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP 195707231986012001
iii
Universitas Sumatera Utara
LEMBAR PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa
: Reny Haryani
Nomor Induk Mahasiswa : 147014021
Program Studi
: Magister Farmasi
Judul Tesis
: Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus
amboinicus Lour) terhadap Sel Vero yang
Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida (H2O2)
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan TIM Penguji pada hari Selasa
tanggal Tujuh bulan Februari tahun dua ribu tujuh belas.
Mengesahkan:
Tim Penguji Tesis
Ketua Tim Penguji Tesis
: Prof. Dr. Rosidah, M.Si.,Apt.
Anggota Tim Penguji Tesis : Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt.
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
iv
Universitas Sumatera Utara
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama Mahasiswa
: Reny Haryani
Nomor Induk Mahasiswa
: 147014021
Program Studi
: Magister Farmasi
Judul Tesis
: Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus
amboinicus Lour) terhadap Sel Vero yang
Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida (H2O2)
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah asli karya saya sendiri,
bukan plagiat dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat
karena kesalahan saya sendiri maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh
Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan
menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dan
dalam keadaan sehat
Medan, Februari 2017
Yang membuat pernyataan,
Materai
6000
Reny Haryani
NIM 147014021
v
Universitas Sumatera Utara
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan
rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
penuliisan tesis dengan judul “Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus
amboinicus Lour) terhadap Sel Vero yang Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida
(H2O2) yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak
mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun
materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang
tiada terhingga kepada:
1. Bapak Prof. Dr. Runtung Sitepu, S.H., M.Hum., selaku Rektor Universitas
Sumatera Utara, Medan, yang telah memberikan kesempatan dan fasilitas
kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.
2. Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas
Sumatera Utara, Medan, yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan bagi
penulis menjadi mahasiswa dan menyelesaikan Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku Sekertaris Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan, yang
telah memberikan arahan dan bantuan bagi penulis untuk menyelesaikan
Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.
vi
Universitas Sumatera Utara
4. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., dan Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.,
sebagai Komisi Pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan,
arahan, masukan, saran, dan dorongan dengan penuh kesabaran tulus dan
ikhlas bagi penulis dalam menjalani pendidikan, penelitian dan penyelesaian
tesis ini.
5. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., dan Ibu Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, S.Si,
M.Si., Apt sebagai Komisi Penguji yang telah banyak memberikan saran dan
masukan bagi penulis dalam penyelesaian tesis ini, sehingga tesis ini semakin
baik.
6. Ayahanda H. Hafifuddin, Ibunda Hj. Yusni Ely, S.Ag dan Adinda Rizki
Yuwidarma sebagai keluarga penulis yang banyak memberikan bantuan baik
dalam bentuk moril dan materil bagi penulis selama menjalani pendidikan,
penelitian dan penyelesaian tesis ini.
7. Teman-teman seperjuangan di angkatan 2009 Irma Fitri Hasibuan, S.Farm.,
Apt., Yusda Meindra, S.Farm., Apt., Emmy Hartaty, S.Farm., Apt., Jesaya
Afrianta, S.Farm., Apt., Elisya Fitri Siregar, S.Farm., serta teman-teman
seperjuangan mahasiswa Magister Farmasi Diah Ramadhani, M.Si., Apt.,
Safriana, M.Si., Apt., Rialita Lifiani, M.Si., Apt., Yanna Rotua Sihombing,
M.Si., Apt., Saru Noliqo Rangkuti, M.Si., Apt., Koko Prananda Tarigan, M.Si.,
Apt., Eva Diansari Marbun, M.Si., Apt., Dara Fahria Nopa, M.Si., Apt.,Asyrun
Alkhairi Lubis, M.Si., Apt., Denny Satria, M.Si., Apt., Nevi Hayati Utami,
S.Farm., dan Hendra Gunawan, S.Farm., serta semua pihak yang tidak dapat
penulis sebutkan satu per satu yang selalu mendukung penulis.Serta buat
semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah banyak
vii
Universitas Sumatera Utara
membantu dalam penelitian tesis ini. Kiranya Tuhan Yang Maha Esa
memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan yang telah
diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan sehingga
penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dan semua
pihak. Akhir kata semoga tulisan ini dapat menjadi sumbangan yang berarti bagi
ilmu pengetahuan khususnya bagi bidang farmasi.
Medan,
Penulis,
Februari 2017
Reny Haryani
NIM 147014021
viii
Universitas Sumatera Utara
EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (Coleus
amboinicus Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI
DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
ABSTRAK
Penyakit degeneratif telah menjadi segmentasi permasalahan tersendiri
seiring dengan semakin tingginya angka prevalensi di masyarakat. Penyebab
penyakit degeneratif salah satunya adalah timbulnya radikal hidroksil dalam
dalam tubuh. Stres oksidatif timbul karena terjadi ketidakseimbangan antara
produksi radikal bebas atau Reactive oxygen species (ROS) dengan antioksidan,
karena kadar radikal bebas lebih tinggi dibandingkan antioksidan. Senyawa yang
dapat melindungi sel dari stress oksidatif adalah senyawa yang memiliki aktivitas
sitoprotektif. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji efek sitoprotektif
tanaman daun Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) pada sel Vero diinduksi
dengan hidrogen peroksida (H2O2).
Daun bangun- bangun yang digunakan diperoleh dari Desa Kubuan,
Tanjung Pura, Langkat, Sumatera Utara. Daun Bangun-bangun kemudian
diekstrak dengan maserasi bertingkat menggunakan pelarut n-heksana, etilasetat,
dan etanol. Pengujian sitoprotektif secara in vitro dengan metode MTT terhadap
ekstrak n-heksan daun bangun-bangun (ENDBB), ekstrak etil asetat daun bangunbangun (EEADBB), dan ekstrak etanol daun bangun-bangun EEDBB dilakukan
pada sel Vero dengan konsentrasi 12,5-200 µg/mL yang diinduksi H2O2 0,8 mM.
Data hasil pengujian dianalisis secara statistik menggunakan ANOVA,
dilanjutkan dengan uji Post Hoc Duncan dengan program SPSS versi 17. Ekstrak
yang paling aktif dilanjutkan dengan uji apoptosis dengan metode flow sitometri
serta ekspresi ROS dengan metode imunositokimia terhadap sel Vero yang
diinduksi dengan 0,8 mM H2O2.
Hasil analisis viabilitas sel menunjukkan bahwa nilai viabilitas meningkat
dibandingkan dengan nilai viabilitas sel Vero yang diberi H2O2. EEADBB dan
EEDBB pada uji MTT menunjukkan persen viabilitas masing-masing sebesar
74,42±0,28% dan 76,08±0,91 % dengan konsentrasi 50 µg/mL untuk EEADBB
dan 100 µg/mL EEDBB. ENDBB tidak menunjukkan hasil yang baik
dibandingkan dengan EEADBB dan EEDBB. EEADBB dan EEDBB menurunkan
apoptosis pada sel Vero, yang terlihat pada uji apoptosis dengan flow sitometri.
Peningkatan jumlah sel hidup terjadi setelah perlakuan dengan EEADBB dan
EEDBB sebesar 32,14% dan 49,59% dibandingkan dengan H2O2 sebesar
10,32%. EEADBB dan EEDBB juga mereduksi ROS pada sel Vero yang
diinduksi dengan H2O2, yang ditunjukkan pada uji imunositokimia, yaitu
berkurangnya warna coklat pada sel perlakuan dengan EEADBB dan EEDBB
dibandingkan dengan sel yang diberi H2O2. Berdasarkan uraian diatas dapat
disimpulkan bahwa EEADBB dan EEDBB mampu sebagai sitoprotektif terhadap
sel Vero yang diinduksi 0,8 mM H2O2.
Kata kunci: Sitoprotektif, Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour), Sel Vero,
0,8 mM H2O2, MTT, Flow sitometri, Imunositokimia.
ix
Universitas Sumatera Utara
CYTOPROTECTIVE EFFECTS OF BANGUN-BANGUN
(Coleus amboinicus Lour) LEAF ON THE VERO CELL
INDUCED WITH HYDROGEN PEROXIDES (H2O2)
ABSTRACT
Degenerative disease has become its own problems segmentation along
with the high prevalence in the community. One cause of the degenerative disease
is the emergence of hydroxyl radicals in the body. Oxidative stress arises due to
an imbalance between the production of free radicals or reactive oxygen species
(ROS) and antioxidants, because the levels of free radicals is higher than
antioxidant. Substances that protect cells from oxidative stress is a compound
having cytoprotective activity. The aim of this study was to test the cytoprotective
effects of plant leaves Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) In Vero cells
induced by hydrogen peroxide (H2O2).
Leaves of Bangun-bangun used were obtained from Kubuan Village,
Tanjung Pura, Langkat, North Sumatra. Bangun-bangun leaf then extracted with
terraced maceration using n-hexane, ethyl acetate, and ethanol. Cytoprotective
Testing in vitro by MTT method to extract n-hexane leaf shapes (ENDBB), ethyl
acetate extract of leaf shapes (EEADBB), and ethanol extract of leaves wake
EEDBB performed on Vero cells at concentrations 12,5-200 µg/mL induced
H+O2 0.8 mM. The test data were statistically analyzed using ANOVA, followed
by Duncan Post Hoc test with SPSS version 17. The extract was the most active
followed by a test of apoptosis by flow cytometry of the method as well as the
expression of ROS by the method of immunocytochemistry against Vero cells
were induced with 0.8 mM H2O2.
The results of cell viability analysis shows that the viability increased
compared to the value of Vero cell viability by H2O2. EEADBB and EEDBB the
MTT test shows the percent viability respectively by 74.42 ± 0.28% and 76.08 ±
0.91% with a concentration of 50 ug / mL for EEADBB and 100 ug / mL EEDBB.
ENDBB not show good results compared with EEADBB and EEDBB. EEADBB
and EEDBB decrease apoptosis in Vero cells, seen in tests of apoptosis by flow
cytometry. Increasing the number of living cells occurs after treatment with
EEADBB and EEDBB amounted to 32.14% and 49.59% compared with 10.32%
for H2O2. EEADBB and EEDBB also reduces ROS in Vero cells induced by
H2O2, shown in immunocytochemistry test, namely the reduction of brown color
in cells treated with EEADBB and EEDBB compared to cells by H2O2. Based on
the description above can be concluded that EEADBB and EEDBB capable as
cytoprotective against Vero cells induced by 0.8 mM H2O2.
Keywords: Cytoprotective, Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) Vero cells,
0.8 mM H2O2, MTT, Flow cytometry, Immunocytochemistry.
x
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR ISI
`
Halaman
JUDUL ........................................................................................................
i
HALAMAN JUDUL ...................................................................................
ii
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS ............................................................
iii
LEMBAR PENGESAHAN TESIS ..............................................................
iv
SURAT PERNYATAAN ............................................................................
v
KATA PENGANTAR ................................................................................
vi
ABSTRAK ..................................................................................................
ix
ABSTRACT ................................................................................................
x
DAFTAR ISI ...............................................................................................
xi
DAFTAR TABEL ................................................................ .......................
xv
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xvi
DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................
BAB I
xvii
PENDAHULUAN .......................................................................
1
1.1 Latar Belakang .......................................................................
1
1.2 Perumusan Masalah ...............................................................
5
1.3 Kerangka Pikir Penelitian ......................................................
5
1.4 Hipotesis ................................................................................
6
1.5 Tujuan Penelitian ...................................................................
7
1.6 Manfaat Penelitian ..................................................................
7
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..............................................................
8
2.1 Penyakit Degeneratif ..............................................................
8
2.2 Stress Oksidatif ......................................................................
9
xi
Universitas Sumatera Utara
2.3 Radikal Bebas ........................................................................
11
2.3.1 Reactive Oxygen Species (ROS) ....................................
12
2.3.2 Hidrogen peroksida (H2O2)............................................
15
2.4 Antioksidan ............................................................................
17
2.5 Peran Antioksidan dalam Menangkal Radikal Bebas ............
19
2.6 Sel Vero .................................................................................
22
2.7 Tanaman yang Bersifat Sitoprotektif .....................................
23
2.7.1 Bangun-bangun .............................................................
26
2.8 Metode Ekstraksi ....................................................................
28
2.9 Metode Pengujian Aktivitas Sitoprotektif ..............................
29
2.9.1 Metode MTT .................................................................
30
2.9.2 Flow sitometri ...............................................................
30
2.9.3 Imunositokimia .............................................................
31
BAB III METODE PENELITIAN .............................................................
33
3.1 Alat dan Bahan .......................................................................
33
3.1.1 Alat ................................................................................
33
3.1.2 Bahan ............................................................................
33
3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel ..................................
34
3.2.1 Pengambilan sampel ......................................................
34
3.2.2 Identifikasi tanaman daun Bangun-bangun ...................
34
3.2.3 Pembuatan simplisia ......................................................
34
3.3 Pemeriksaan Pemeriksaan Karakteristik Simplisia ................
35
3.3.1 Pemeriksaan makroskopik .............................................
35
3.3.2 Pemeriksaan mikroskopik ..............................................
35
xii
Universitas Sumatera Utara
3.3.3 Penetapan kadar air .......................................................
35
3.3.4 Penetapan kadar sari larut dalam air ..............................
36
3.3.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol ........................
37
3.3.6 Penetapan kadar abu total ..............................................
37
3.3.7 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam .................
37
3.4 Pembuatan Ekstrak ................................................................
37
3.5 Pembuatan Pereaksi ...............................................................
38
3.6 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak .............................
39
3.6.1 Pemeriksaan alkaloid ....................................................
39
3.6.2 Pemeriksaan flavonoid ..................................................
40
3.6.3 Pemeriksaan glikosida ...................................................
40
3.6.4 Pemeriksaan saponin......................................................
41
3.6.5 Pemeriksaan tanin ..........................................................
41
3.6.6 Pemeriksaan triterpenoid/steroid ...................................
41
3.7 Sterilisasi Alat dan Bahan .......................................................
41
3.8 Pembuatan Media ....................................................................
42
3.8.1 Pembuatan media M199 ................................................
42
3.8.2 Pembuatan media MK-M199.........................................
42
3.9 Penumbuhan Sel Vero .............................................................
43
3.9.1 Subkultur sel Vero .........................................................
43
3.9.2 Panen sel Vero ...............................................................
43
3.9.3 Penghitungan sel Vero ...................................................
44
3.10 Pembuatan Larutan Uji ........................................................
45
3.11 Analisis Viabilitas Sel dengan Metode MTT .......................
45
xiii
Universitas Sumatera Utara
3.12 Pengujian Apoptosis dengan Flow Sitometri .......................
46
3.13 Analisis Ekspresi ROS dengan Imunositokimia ..................
47
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................
49
4.1 Identifikasi Tumbuhan ..........................................................
49
4.2 Karakteristik Simplisia .........................................................
49
4.2.1 Pemeriksaan makroskopik ...........................................
49
4.2.2 Pemeriksaan mikroskopik ............................................
49
4.2.3 Karakterisasi Simplisia ................................................
50
4.3 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak Daun
Bangun-Bangun ....................................................................
51
4.4 Aktifitas Sitoprotektif ...........................................................
53
4.4.1 Analisis viabilitas sel dengan metode MTT ................
53
4.4.2 Pengujian apoptosis dengan flow sitometri .................
56
4.4.3 Analisis ekspresi ROS dengan imunositokimia ...........
63
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................
67
5.1 Kesimpulan ...........................................................................
67
5.2 Saran .....................................................................................
68
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................
69
LAMPIRAN ………. ...................................................................................
79
xiv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
2.1 Metabolit oksigen radikal dan nonradikal ...........................................
12
2.2 Tanaman yang bersifat sitoprotektif....................................................
23
4.1 Hasil karakteristik simplisia daun Bangun-bangun ............................
50
4.2 Hasil skrining fitokimia simplisia dan ekstrak ...................................
51
4.3 Hasil pengujian apoptosis EEDBB dan EEADBB .............................
60
xv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR GAMBAR
Gambar
1.1
Halaman
Diagram kerangka pikir penelitian ................................................
6
2.1 Kerusakan Akibat Reaktif Oksigen Spesies ..................................
13
2.2
Produksi ROS selama respirasi sel normal .....................................
16
2.3 Efek sinergisCAT,GSHPx,danSOD dalamscavenging
dari O2•- ...........................................................................................
19
2.4 Skema representasi interaksi flavonoid dengan jalur sinyal sel ....
21
2.5
Reduksi MTT menjadi Formazan ...................................................
30
3.1 Hemositometer................................................................................
44
4.1 Hasil analisis viabilitas sel pada masing-masing perlakuan ..........
54
4.2
a. Apoptosis sel vero kontrol .........................................................
57
b. Apoptosis sel vero +H2O2 ..........................................................
58
c. Apoptosis EEADBB ..................................................................
58
d. Apoptosis EEDBB .....................................................................
59
4.3 Imunositokimia ekstrak daun Bangun-bangun ...............................
64
4.4
65
Tapak ikat pengkhelat logam ..........................................................
xvi
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
Halaman
1
Surat Hasil Identifikasi Daun Bangun-bangun .............................
79
2
Surat Rekomendasi Persetujuan Etik Penelitian Kesehatan .........
80
3
Gambar Makroskopik Daun Bangun-bangun ..............................
81
4
Gambar Mikroskopik Serbuk Simplisia Daun Bangun-bangun ..
82
5
Bagan Pembuatan Ekstrak Daun Bangun-bangun .......................
83
6
Bagan Alur Penelitian ..................................................................
84
7
Perhitungan Karakterisasi Simplisia Daun Bangun-bangun ........
85
8
Perhitungan Konsentrasi Larutan Uji ...........................................
89
9
Perhitungan Pengenceran H2O2.....................................................
90
10
Hasil Analisis SPSS Viabilitas Sel ...............................................
91
11
Laminar Air Flow Class II, ELISA Reader ..................................
95
12
Sel Vero ........................................................................................
96
xvii
Universitas Sumatera Utara
EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (Coleus
amboinicus Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI
DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
OLEH:
RENY HARYANI
NIM 147014021
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
Universitas Sumatera Utara
EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (Coleus
amboinicus Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI
DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh
gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
RENY HARYANI
NIM 147014021
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2017
Universitas Sumatera Utara
LEMBAR PERSETUJUANTESIS
EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (Coleus
amboinicus Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI
DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
OLEH:
RENY HARYANI
NIM 147014021
Medan, Februari 2017
Menyetujui:
KomisiPembimbing,
KomisiPenguji,
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
NIP 195301011983031004
Prof. Dr. Rosidah, M.Si.,Apt.
NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP 195707231986012001
Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt.
NIP 197506102005012003
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
NIP 195301011983031004
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP 195707231986012001
Mengetahui:
Sekretaris Program Studi,
Disahkan Oleh:
Dekan,
Prof. Dr. Rosidah, M.Si.,Apt.
NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
NIP 195707231986012001
iii
Universitas Sumatera Utara
LEMBAR PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa
: Reny Haryani
Nomor Induk Mahasiswa : 147014021
Program Studi
: Magister Farmasi
Judul Tesis
: Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus
amboinicus Lour) terhadap Sel Vero yang
Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida (H2O2)
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan TIM Penguji pada hari Selasa
tanggal Tujuh bulan Februari tahun dua ribu tujuh belas.
Mengesahkan:
Tim Penguji Tesis
Ketua Tim Penguji Tesis
: Prof. Dr. Rosidah, M.Si.,Apt.
Anggota Tim Penguji Tesis : Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb., M.Si., Apt.
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.
iv
Universitas Sumatera Utara
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan dibawah ini:
Nama Mahasiswa
: Reny Haryani
Nomor Induk Mahasiswa
: 147014021
Program Studi
: Magister Farmasi
Judul Tesis
: Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus
amboinicus Lour) terhadap Sel Vero yang
Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida (H2O2)
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah asli karya saya sendiri,
bukan plagiat dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat
karena kesalahan saya sendiri maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh
Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan
menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dan
dalam keadaan sehat
Medan, Februari 2017
Yang membuat pernyataan,
Materai
6000
Reny Haryani
NIM 147014021
v
Universitas Sumatera Utara
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan
rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan
penuliisan tesis dengan judul “Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus
amboinicus Lour) terhadap Sel Vero yang Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida
(H2O2) yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak
mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun
materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang
tiada terhingga kepada:
1. Bapak Prof. Dr. Runtung Sitepu, S.H., M.Hum., selaku Rektor Universitas
Sumatera Utara, Medan, yang telah memberikan kesempatan dan fasilitas
kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.
2. Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas
Sumatera Utara, Medan, yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan bagi
penulis menjadi mahasiswa dan menyelesaikan Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku Sekertaris Program Studi Magister
Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan, yang
telah memberikan arahan dan bantuan bagi penulis untuk menyelesaikan
Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan.
vi
Universitas Sumatera Utara
4. Bapak Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., dan Ibu Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt.,
sebagai Komisi Pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan,
arahan, masukan, saran, dan dorongan dengan penuh kesabaran tulus dan
ikhlas bagi penulis dalam menjalani pendidikan, penelitian dan penyelesaian
tesis ini.
5. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., dan Ibu Dr. Poppy Anjelisa Z. Hsb, S.Si,
M.Si., Apt sebagai Komisi Penguji yang telah banyak memberikan saran dan
masukan bagi penulis dalam penyelesaian tesis ini, sehingga tesis ini semakin
baik.
6. Ayahanda H. Hafifuddin, Ibunda Hj. Yusni Ely, S.Ag dan Adinda Rizki
Yuwidarma sebagai keluarga penulis yang banyak memberikan bantuan baik
dalam bentuk moril dan materil bagi penulis selama menjalani pendidikan,
penelitian dan penyelesaian tesis ini.
7. Teman-teman seperjuangan di angkatan 2009 Irma Fitri Hasibuan, S.Farm.,
Apt., Yusda Meindra, S.Farm., Apt., Emmy Hartaty, S.Farm., Apt., Jesaya
Afrianta, S.Farm., Apt., Elisya Fitri Siregar, S.Farm., serta teman-teman
seperjuangan mahasiswa Magister Farmasi Diah Ramadhani, M.Si., Apt.,
Safriana, M.Si., Apt., Rialita Lifiani, M.Si., Apt., Yanna Rotua Sihombing,
M.Si., Apt., Saru Noliqo Rangkuti, M.Si., Apt., Koko Prananda Tarigan, M.Si.,
Apt., Eva Diansari Marbun, M.Si., Apt., Dara Fahria Nopa, M.Si., Apt.,Asyrun
Alkhairi Lubis, M.Si., Apt., Denny Satria, M.Si., Apt., Nevi Hayati Utami,
S.Farm., dan Hendra Gunawan, S.Farm., serta semua pihak yang tidak dapat
penulis sebutkan satu per satu yang selalu mendukung penulis.Serta buat
semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah banyak
vii
Universitas Sumatera Utara
membantu dalam penelitian tesis ini. Kiranya Tuhan Yang Maha Esa
memberikan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan yang telah
diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan sehingga
penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dan semua
pihak. Akhir kata semoga tulisan ini dapat menjadi sumbangan yang berarti bagi
ilmu pengetahuan khususnya bagi bidang farmasi.
Medan,
Penulis,
Februari 2017
Reny Haryani
NIM 147014021
viii
Universitas Sumatera Utara
EFEK SITOPROTEKTIF DAUN BANGUN-BANGUN (Coleus
amboinicus Lour) TERHADAP SEL VERO YANG DIINDUKSI
DENGAN HIDROGEN PEROKSIDA (H2O2)
ABSTRAK
Penyakit degeneratif telah menjadi segmentasi permasalahan tersendiri
seiring dengan semakin tingginya angka prevalensi di masyarakat. Penyebab
penyakit degeneratif salah satunya adalah timbulnya radikal hidroksil dalam
dalam tubuh. Stres oksidatif timbul karena terjadi ketidakseimbangan antara
produksi radikal bebas atau Reactive oxygen species (ROS) dengan antioksidan,
karena kadar radikal bebas lebih tinggi dibandingkan antioksidan. Senyawa yang
dapat melindungi sel dari stress oksidatif adalah senyawa yang memiliki aktivitas
sitoprotektif. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji efek sitoprotektif
tanaman daun Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) pada sel Vero diinduksi
dengan hidrogen peroksida (H2O2).
Daun bangun- bangun yang digunakan diperoleh dari Desa Kubuan,
Tanjung Pura, Langkat, Sumatera Utara. Daun Bangun-bangun kemudian
diekstrak dengan maserasi bertingkat menggunakan pelarut n-heksana, etilasetat,
dan etanol. Pengujian sitoprotektif secara in vitro dengan metode MTT terhadap
ekstrak n-heksan daun bangun-bangun (ENDBB), ekstrak etil asetat daun bangunbangun (EEADBB), dan ekstrak etanol daun bangun-bangun EEDBB dilakukan
pada sel Vero dengan konsentrasi 12,5-200 µg/mL yang diinduksi H2O2 0,8 mM.
Data hasil pengujian dianalisis secara statistik menggunakan ANOVA,
dilanjutkan dengan uji Post Hoc Duncan dengan program SPSS versi 17. Ekstrak
yang paling aktif dilanjutkan dengan uji apoptosis dengan metode flow sitometri
serta ekspresi ROS dengan metode imunositokimia terhadap sel Vero yang
diinduksi dengan 0,8 mM H2O2.
Hasil analisis viabilitas sel menunjukkan bahwa nilai viabilitas meningkat
dibandingkan dengan nilai viabilitas sel Vero yang diberi H2O2. EEADBB dan
EEDBB pada uji MTT menunjukkan persen viabilitas masing-masing sebesar
74,42±0,28% dan 76,08±0,91 % dengan konsentrasi 50 µg/mL untuk EEADBB
dan 100 µg/mL EEDBB. ENDBB tidak menunjukkan hasil yang baik
dibandingkan dengan EEADBB dan EEDBB. EEADBB dan EEDBB menurunkan
apoptosis pada sel Vero, yang terlihat pada uji apoptosis dengan flow sitometri.
Peningkatan jumlah sel hidup terjadi setelah perlakuan dengan EEADBB dan
EEDBB sebesar 32,14% dan 49,59% dibandingkan dengan H2O2 sebesar
10,32%. EEADBB dan EEDBB juga mereduksi ROS pada sel Vero yang
diinduksi dengan H2O2, yang ditunjukkan pada uji imunositokimia, yaitu
berkurangnya warna coklat pada sel perlakuan dengan EEADBB dan EEDBB
dibandingkan dengan sel yang diberi H2O2. Berdasarkan uraian diatas dapat
disimpulkan bahwa EEADBB dan EEDBB mampu sebagai sitoprotektif terhadap
sel Vero yang diinduksi 0,8 mM H2O2.
Kata kunci: Sitoprotektif, Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour), Sel Vero,
0,8 mM H2O2, MTT, Flow sitometri, Imunositokimia.
ix
Universitas Sumatera Utara
CYTOPROTECTIVE EFFECTS OF BANGUN-BANGUN
(Coleus amboinicus Lour) LEAF ON THE VERO CELL
INDUCED WITH HYDROGEN PEROXIDES (H2O2)
ABSTRACT
Degenerative disease has become its own problems segmentation along
with the high prevalence in the community. One cause of the degenerative disease
is the emergence of hydroxyl radicals in the body. Oxidative stress arises due to
an imbalance between the production of free radicals or reactive oxygen species
(ROS) and antioxidants, because the levels of free radicals is higher than
antioxidant. Substances that protect cells from oxidative stress is a compound
having cytoprotective activity. The aim of this study was to test the cytoprotective
effects of plant leaves Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) In Vero cells
induced by hydrogen peroxide (H2O2).
Leaves of Bangun-bangun used were obtained from Kubuan Village,
Tanjung Pura, Langkat, North Sumatra. Bangun-bangun leaf then extracted with
terraced maceration using n-hexane, ethyl acetate, and ethanol. Cytoprotective
Testing in vitro by MTT method to extract n-hexane leaf shapes (ENDBB), ethyl
acetate extract of leaf shapes (EEADBB), and ethanol extract of leaves wake
EEDBB performed on Vero cells at concentrations 12,5-200 µg/mL induced
H+O2 0.8 mM. The test data were statistically analyzed using ANOVA, followed
by Duncan Post Hoc test with SPSS version 17. The extract was the most active
followed by a test of apoptosis by flow cytometry of the method as well as the
expression of ROS by the method of immunocytochemistry against Vero cells
were induced with 0.8 mM H2O2.
The results of cell viability analysis shows that the viability increased
compared to the value of Vero cell viability by H2O2. EEADBB and EEDBB the
MTT test shows the percent viability respectively by 74.42 ± 0.28% and 76.08 ±
0.91% with a concentration of 50 ug / mL for EEADBB and 100 ug / mL EEDBB.
ENDBB not show good results compared with EEADBB and EEDBB. EEADBB
and EEDBB decrease apoptosis in Vero cells, seen in tests of apoptosis by flow
cytometry. Increasing the number of living cells occurs after treatment with
EEADBB and EEDBB amounted to 32.14% and 49.59% compared with 10.32%
for H2O2. EEADBB and EEDBB also reduces ROS in Vero cells induced by
H2O2, shown in immunocytochemistry test, namely the reduction of brown color
in cells treated with EEADBB and EEDBB compared to cells by H2O2. Based on
the description above can be concluded that EEADBB and EEDBB capable as
cytoprotective against Vero cells induced by 0.8 mM H2O2.
Keywords: Cytoprotective, Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) Vero cells,
0.8 mM H2O2, MTT, Flow cytometry, Immunocytochemistry.
x
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR ISI
`
Halaman
JUDUL ........................................................................................................
i
HALAMAN JUDUL ...................................................................................
ii
LEMBAR PERSETUJUAN TESIS ............................................................
iii
LEMBAR PENGESAHAN TESIS ..............................................................
iv
SURAT PERNYATAAN ............................................................................
v
KATA PENGANTAR ................................................................................
vi
ABSTRAK ..................................................................................................
ix
ABSTRACT ................................................................................................
x
DAFTAR ISI ...............................................................................................
xi
DAFTAR TABEL ................................................................ .......................
xv
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xvi
DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................
BAB I
xvii
PENDAHULUAN .......................................................................
1
1.1 Latar Belakang .......................................................................
1
1.2 Perumusan Masalah ...............................................................
5
1.3 Kerangka Pikir Penelitian ......................................................
5
1.4 Hipotesis ................................................................................
6
1.5 Tujuan Penelitian ...................................................................
7
1.6 Manfaat Penelitian ..................................................................
7
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..............................................................
8
2.1 Penyakit Degeneratif ..............................................................
8
2.2 Stress Oksidatif ......................................................................
9
xi
Universitas Sumatera Utara
2.3 Radikal Bebas ........................................................................
11
2.3.1 Reactive Oxygen Species (ROS) ....................................
12
2.3.2 Hidrogen peroksida (H2O2)............................................
15
2.4 Antioksidan ............................................................................
17
2.5 Peran Antioksidan dalam Menangkal Radikal Bebas ............
19
2.6 Sel Vero .................................................................................
22
2.7 Tanaman yang Bersifat Sitoprotektif .....................................
23
2.7.1 Bangun-bangun .............................................................
26
2.8 Metode Ekstraksi ....................................................................
28
2.9 Metode Pengujian Aktivitas Sitoprotektif ..............................
29
2.9.1 Metode MTT .................................................................
30
2.9.2 Flow sitometri ...............................................................
30
2.9.3 Imunositokimia .............................................................
31
BAB III METODE PENELITIAN .............................................................
33
3.1 Alat dan Bahan .......................................................................
33
3.1.1 Alat ................................................................................
33
3.1.2 Bahan ............................................................................
33
3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel ..................................
34
3.2.1 Pengambilan sampel ......................................................
34
3.2.2 Identifikasi tanaman daun Bangun-bangun ...................
34
3.2.3 Pembuatan simplisia ......................................................
34
3.3 Pemeriksaan Pemeriksaan Karakteristik Simplisia ................
35
3.3.1 Pemeriksaan makroskopik .............................................
35
3.3.2 Pemeriksaan mikroskopik ..............................................
35
xii
Universitas Sumatera Utara
3.3.3 Penetapan kadar air .......................................................
35
3.3.4 Penetapan kadar sari larut dalam air ..............................
36
3.3.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol ........................
37
3.3.6 Penetapan kadar abu total ..............................................
37
3.3.7 Penetapan kadar abu tidak larut dalam asam .................
37
3.4 Pembuatan Ekstrak ................................................................
37
3.5 Pembuatan Pereaksi ...............................................................
38
3.6 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak .............................
39
3.6.1 Pemeriksaan alkaloid ....................................................
39
3.6.2 Pemeriksaan flavonoid ..................................................
40
3.6.3 Pemeriksaan glikosida ...................................................
40
3.6.4 Pemeriksaan saponin......................................................
41
3.6.5 Pemeriksaan tanin ..........................................................
41
3.6.6 Pemeriksaan triterpenoid/steroid ...................................
41
3.7 Sterilisasi Alat dan Bahan .......................................................
41
3.8 Pembuatan Media ....................................................................
42
3.8.1 Pembuatan media M199 ................................................
42
3.8.2 Pembuatan media MK-M199.........................................
42
3.9 Penumbuhan Sel Vero .............................................................
43
3.9.1 Subkultur sel Vero .........................................................
43
3.9.2 Panen sel Vero ...............................................................
43
3.9.3 Penghitungan sel Vero ...................................................
44
3.10 Pembuatan Larutan Uji ........................................................
45
3.11 Analisis Viabilitas Sel dengan Metode MTT .......................
45
xiii
Universitas Sumatera Utara
3.12 Pengujian Apoptosis dengan Flow Sitometri .......................
46
3.13 Analisis Ekspresi ROS dengan Imunositokimia ..................
47
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................
49
4.1 Identifikasi Tumbuhan ..........................................................
49
4.2 Karakteristik Simplisia .........................................................
49
4.2.1 Pemeriksaan makroskopik ...........................................
49
4.2.2 Pemeriksaan mikroskopik ............................................
49
4.2.3 Karakterisasi Simplisia ................................................
50
4.3 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak Daun
Bangun-Bangun ....................................................................
51
4.4 Aktifitas Sitoprotektif ...........................................................
53
4.4.1 Analisis viabilitas sel dengan metode MTT ................
53
4.4.2 Pengujian apoptosis dengan flow sitometri .................
56
4.4.3 Analisis ekspresi ROS dengan imunositokimia ...........
63
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................
67
5.1 Kesimpulan ...........................................................................
67
5.2 Saran .....................................................................................
68
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................
69
LAMPIRAN ………. ...................................................................................
79
xiv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
2.1 Metabolit oksigen radikal dan nonradikal ...........................................
12
2.2 Tanaman yang bersifat sitoprotektif....................................................
23
4.1 Hasil karakteristik simplisia daun Bangun-bangun ............................
50
4.2 Hasil skrining fitokimia simplisia dan ekstrak ...................................
51
4.3 Hasil pengujian apoptosis EEDBB dan EEADBB .............................
60
xv
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR GAMBAR
Gambar
1.1
Halaman
Diagram kerangka pikir penelitian ................................................
6
2.1 Kerusakan Akibat Reaktif Oksigen Spesies ..................................
13
2.2
Produksi ROS selama respirasi sel normal .....................................
16
2.3 Efek sinergisCAT,GSHPx,danSOD dalamscavenging
dari O2•- ...........................................................................................
19
2.4 Skema representasi interaksi flavonoid dengan jalur sinyal sel ....
21
2.5
Reduksi MTT menjadi Formazan ...................................................
30
3.1 Hemositometer................................................................................
44
4.1 Hasil analisis viabilitas sel pada masing-masing perlakuan ..........
54
4.2
a. Apoptosis sel vero kontrol .........................................................
57
b. Apoptosis sel vero +H2O2 ..........................................................
58
c. Apoptosis EEADBB ..................................................................
58
d. Apoptosis EEDBB .....................................................................
59
4.3 Imunositokimia ekstrak daun Bangun-bangun ...............................
64
4.4
65
Tapak ikat pengkhelat logam ..........................................................
xvi
Universitas Sumatera Utara
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
Halaman
1
Surat Hasil Identifikasi Daun Bangun-bangun .............................
79
2
Surat Rekomendasi Persetujuan Etik Penelitian Kesehatan .........
80
3
Gambar Makroskopik Daun Bangun-bangun ..............................
81
4
Gambar Mikroskopik Serbuk Simplisia Daun Bangun-bangun ..
82
5
Bagan Pembuatan Ekstrak Daun Bangun-bangun .......................
83
6
Bagan Alur Penelitian ..................................................................
84
7
Perhitungan Karakterisasi Simplisia Daun Bangun-bangun ........
85
8
Perhitungan Konsentrasi Larutan Uji ...........................................
89
9
Perhitungan Pengenceran H2O2.....................................................
90
10
Hasil Analisis SPSS Viabilitas Sel ...............................................
91
11
Laminar Air Flow Class II, ELISA Reader ..................................
95
12
Sel Vero ........................................................................................
96
xvii
Universitas Sumatera Utara