Efek Sitoprotektif Daun Bangun-bangun (Coleus amboinicus Lour) terhadap Sel Vero yang Diinduksi dengan Hidrogen Peroksida (H2O2)
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Istilah penyakit degeneratif digunakan secara medis ditujukan untuk
menerangkan proses kemunduran fungsi sel tanpa sebab yang jelas diketahui
(Japardi, 2002). Penyakit degeneratif telah menjadi permasalahan tersendiri
seiring dengan semakin tingginya angka prevalensi di masyarakat. Peningkatan
prevalensi erat kaitannya dengan beberapa faktor resiko seperti peningkatan usia,
gaya hidup tidak sehat, makanan berlemak, dan paparan radikal bebas seperti sinar
UV, asap rokok dan asap kendaraan (Sembodo, 2015). Umumnya penyakit
degeneratif terjadi akibat kerusakan sel, jaringan lemak, protein, sistem kekebalan
dan DNA yang disebabkan oleh berbagai faktor
baik secara alami, paparan
radiasi atau zat-zat kimia yang bersifat karsinogenik. Salah satu penyebab
penyakit degeneratif adalah timbulnya radikal hidroksil melalui mekanisme
biokimia di dalam tubuh (Atun, 2006). Penyakit degeneratif dapat juga
disebabkan aktivitas oksidasi seperti kardiovaskuler, diabetes melitus tipe II,
penuaan dini sampai penyakit tumor dan kanker (Susantiningsih, 2015).
Stres oksidatif timbul karena ketidakseimbangan antara produksi radikal
bebas atau Reactive oxygen species (ROS) dengan antioksidan, sehingga kadar
radikal bebas lebih tinggi dibandingkan antioksidan (Kurkcu, et al., 2010).
Kondisi ini pada akhirnya berdampak luas pada tubuh seperti terjadinya kanker
dan penyakit-penyakit kronis lain (Waris dan Ahsan, 2006).Stres oksidatif
diakibatkan oleh adanya reaksi metabolik yang menggunakan oksigen dan
menunjukkan gangguan keseimbangan status reaksi oksidan dan antioksidan pada
1
Universitas Sumatera Utara
makhluk hidup. ROS yang berlebihan akan merusak lipid seluler, protein maupun
DNA dan menghambat fungsi normal sel (Kovacic dan Jacintho, 2001).
Radikal bebas oksigen dibentuk sebagai hasil samping metabolisme seluler
aerobik dan diproduksi dalam kondisi stress oksidatif. Kadar ROS yang tinggi
dapat merusak sel. ROS meliputi radikal superoksida, hidroksil, peroksil dan
molekul hidrogen peroksida yang dapat memodifikasi protein seluler, lipid, DNA
dan mengubah fungsi sel. Telah dilaporkan dalam beberapa penelitian bahwa
kadar ROS yang tinggi adalah kunci utama mekanisme inisiasi dan progresi
penyakit degeneratif serta proses terjadinya kanker (Susantiningsih, 2015).
Radikal bebas yang mengambil elektron dari DNA dapat menyebabkan perubahan
struktur DNA sehingga menginduksi sel-sel mutan. Bila mutasi terjadi dalam
waktu yang lama dapat menjadi sel-sel kanker (Werdhasari, 2014).
Antioksidan adalah molekul yang dapat mereduksi efek radikal bebas
dengan menstabilkan molekul berbahaya, menetralkan radikal bebas dengan
menerima atau mendonasikan elektron tersebut dengan mengeliminasi kondisi
elektron yang tidak berpasangan pada radikal (Lu, et al., 2010). Penggunaan
antioksidan yang bekerja sebagai scavenger radikal bebas merupakan suatu
strategi untuk mencegah proses inisiasi sel kanker yang dipicu oleh ROS, dan
merupakan tahap awal karsinogenesis sehingga dengan demikian dapat
menurunkan insiden terjadinya kanker (Wolfe, et al., 2008). Antioksidan
menyebabkan resistensi terhadap stres oksidatif dengan meredam radikal bebas,
menghambat peroksidasi lipid, dan mekanisme lain sehingga dapat mencegah
penyakit (Ahalya, et al., 2013).
2
Universitas Sumatera Utara
Senyawa yang dapat melindungi sel dari bahaya seperti stres oksidatif
maka senyawa tersebut memiliki aktivitas sitoprotektif. Aktivitas sitoprotektif
suatu senyawa tersebut dalam proteksi sel diperoleh dengan cara homeostasis
redoks ROS dan RNS oleh senyawa antioksidan (Alezandro, et al., 2013). Kedua
spesies tersebut mengakibatkan disfungsi mitokondrial, gangguan produksi
protein, dan aggregasi protein yang menyebabkan modulasi aktivasi apoptosis,
nekrosis, dan autophagis sel (Navarro-Yepes, et al., 2014). Pengujian sitoprotektif
dilakukan dengan menggunakan pereaksi MTT pada sel hidup. Metode ini dapat
digunakan untuk mengukur jumlah sel, sitotoksisitas, proliferasi, dan aktivasi sel.
Hasil dari pengujian dapat dibaca pada multi-well scanning spektrofotometer
(ELISA reader) dan menunjukkan tingkat presisi yang tinggi (Montagnon, et al.,
1981). Sel Vero merupakan sel epitel bukan kanker (normal) yang berasal dari
organ ginjal monyet hijau Afrika. Pengujian sel Vero dilakukan untuk
mempelajari pertumbuhan sel, diferensiasi sel, sitotoksisitas, dan transformasi sel
yang diinduksi berbagai senyawa kimia (Goncalves, et al., 2006).
Coleus amboinicus Lour. (Daun bangun-bangun) dengan sinonim
Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng. merupakan tanaman etnobotani
Indonesia yang telah dimanfatkan secara turun-temurun oleh masyarakat
Sumatera Utara, terutama ibu-ibu yang baru melahirkan, untuk meningkatkan
kualitas dan kuantitas air susu ibu (ASI) (Santosa dan Hertiani, 2005). Tanaman
ini mengandung senyawa fitokimia seperti senyawa fenolik dan flavonoid,
saponin, glikosida flavonol dan minyak atsiri yang memiliki potensi sebagai
aktivitas antibakteri, antifungal, antiseptik, antiviral, dan antioksidan (Hole, et al.,
2009; Santosa dan Hertiani, 2005). Beberapa penelitian tentang tumbuhan ini di
3
Universitas Sumatera Utara
antaranya oleh Hasibuan, et al., (2013) telah melakukan penelitian tentang
aktivitas antioksidan dan sitotoksis ekstrak daun bangun-bangun. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa ekstrak etilasetat dan ekstrak etanol memiliki aktivitas
antoksidan dengan nilai IC50 masing-masing 350,74 µg/mL dan 281,26 µg/mL
dengan metode DPPH. Ekstrak etanol dan etilasetat menunjukkan aktivitas
antioksidan yang tinggi dengan metode β-Carotene-Linoleic Acid. Ekstrak nheksan dan etilasetat menunjukkan potensi sitotoksik pada sel MCF-7 dengan IC50
63,644 µg/mL; dan 7,647 µg/mL. Ekstrak etanol daun Bangun-bangun juga
berpotensi sebagai anticlastogenic dan ternyata ekstrak etanol daun Bangunbangun mampu melindungi kerusakan kromosom yanng diinduksi dengan
siklofosfamid dan mitomycin pada sel (Shyama, et al., 2002). Uji sitotoksik
ekstrak n-heksana daun Bangun-bangun (ENDBB), etil asetat daun Bangunbangun (EEADBB) dan etanol daun Bangun-bangun (EEDBB) pada sel Hela
menunjukkan nilai IC50 76,322 µg/mL; 143,291 µg/mL; dan 88,997 µg/mL.
Penurunan nilai IC50 berkorelasi dengan peningkatan sitotoksisitas. Potensi
aktivitas sitotoksis ekstrak kurang dari 100 µg/mL. Hasil yang berbeda pada sel
Vero, ekstrak etanol daun Bangun-bangun praktis tidak toksis pada sel Vero.
Ekstrak n-heksan memiliki nilai sitotoksik lebih kecil pada sel Vero dengan IC50
414,467 µg/mL; ekstrak etil asetat memiliki nilai sitotoksik moderat pada sel
Vero dengan IC50 55,972 µg/mL (Rosidah dan Hasibuan, 2014).
Beberapa penelitian sebelumnya tentang uji sitoprotektif yaitu, Ginting,
2015 telah menguji aktivitas antioksidan ekstrak etanol umbi wortel (Daucus
carota L.) serta aktivitas sitoprotektif pada sel Vero. Waris, 2015 telah melakukan
penelitian tentang efek sitoprotektif dan antioksidan ekstrak etanolik buah jambu
4
Universitas Sumatera Utara
biji merah (Psidium guajava L.) dan tomat (Lycopersicon lycopersicum
L.Karsten).
Penelitian ini bertujuan untuk menguji efek sitoprotektif daun bangunbangun (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.) pada sel Vero. Agen yang
digunakan sebagai penginduksi radikal bebas pada uji sitoprotektif adalah H2O2..
1.2 Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang maka perumusan masalah penelitian ini adalah:
a. apakah ENDBB, EEADBB, dan EEDBB dapat meningkatkan viabilitas
terhadap sel Vero yang diinduksi H2O2?
b. manakah ekstrak yang dapat menurunkan apoptosis sel Vero yang
diinduksi H2O2?
c. manakah ekstrak yang dapat mereduksi ROS (Reactive Oxigen Species)
pada sel Vero yang diinduksi H2O2?
1.3 Kerangka Pikir Penelitian
Sel Vero yang diinduksi H2O2 mengakibatkan stres oksidatif sehingga
merusak sel Vero. Dengan pemberian ENDBB, EEADBB dan EEDBB yang
mengandung flavonoid menunjukkan aktivitas sitoprotektif. Hubungan variabelvariabel tersebut dapat dilihat pada kerangka pikir penelitian (Gambar 1.1).
5
Universitas Sumatera Utara
ENDBB
ENDBB
Ekstrak dengan % sel
hidup tertinggi
ENDBB
Sel Vero
Sel Vero
H2O2 0,8 mM
H2O2 0,8 mM
Uji MTT
Apoptosis
Viabilitas sel
Sel apoptosis
% sel hidup
% sel hidup
Ekspresi protein ROS
Perubahan warna sel
Warna
coklat
Warna
biru
% sel hidup ENDBB
% sel hidup EEADBB
% sel hidup EEDBB
Keterangan:
= Variabel terikat
= Parameter
Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian
6
Universitas Sumatera Utara
1.4 Hipotesis
Berdasarkan rumusan masalah di atas, maka hipotesis penelitian ini adalah
sebagai berikut:
a. ENDBB, EEADBB, dan EEDBB dapat meningkatkan viabilitas sel Vero
yang diinduksi H2O2.
b. ekstrak yang dapat menurunkan apoptosis sel Vero yang diinduksi H2O2
adalah EEADBB dan EEDBB.
c. ekstrak yang dapat mereduksi ROS pada sel Vero yang diinduksi H2O2
adalah EEADBB dan EEDBB.
1.5 Tujuan Penelitian
Berdasarkan hipotesis di atas maka tujuan penelitian adalah untuk:
a. mengetahui efek peningkatan viabilitas ENDBB, EEADBB, dan EEDBB
terhadap sel Vero yang diinduksi H2O2.
b. mengetahui ekstrak EEADBB dan EEDBB dapat menurunkan apoptosis
sel Vero yang diinduksi H2O2.
c. mengetahui ekstrak EEADBB dan EEDBB dapat mereduksi ROS pada sel
Vero yang diinduksi H2O2.
1.6 Manfaat Penelitian
Berdasarkan tujuan penelitian diatas, penelitian ini diharapkan memberi
informasi ilmiah kepada tenaga kesehatan, khususnya farmasis, bahwa daun
Bangun-bangun dapat dimanfaatkan sebagai salah satu obat tradisional yang
bersifat sitoprotektif, karena telah terbukti dapat melindungi tubuh dari serangan
oksidan dalam hal ini H2O2.
7
Universitas Sumatera Utara
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Istilah penyakit degeneratif digunakan secara medis ditujukan untuk
menerangkan proses kemunduran fungsi sel tanpa sebab yang jelas diketahui
(Japardi, 2002). Penyakit degeneratif telah menjadi permasalahan tersendiri
seiring dengan semakin tingginya angka prevalensi di masyarakat. Peningkatan
prevalensi erat kaitannya dengan beberapa faktor resiko seperti peningkatan usia,
gaya hidup tidak sehat, makanan berlemak, dan paparan radikal bebas seperti sinar
UV, asap rokok dan asap kendaraan (Sembodo, 2015). Umumnya penyakit
degeneratif terjadi akibat kerusakan sel, jaringan lemak, protein, sistem kekebalan
dan DNA yang disebabkan oleh berbagai faktor
baik secara alami, paparan
radiasi atau zat-zat kimia yang bersifat karsinogenik. Salah satu penyebab
penyakit degeneratif adalah timbulnya radikal hidroksil melalui mekanisme
biokimia di dalam tubuh (Atun, 2006). Penyakit degeneratif dapat juga
disebabkan aktivitas oksidasi seperti kardiovaskuler, diabetes melitus tipe II,
penuaan dini sampai penyakit tumor dan kanker (Susantiningsih, 2015).
Stres oksidatif timbul karena ketidakseimbangan antara produksi radikal
bebas atau Reactive oxygen species (ROS) dengan antioksidan, sehingga kadar
radikal bebas lebih tinggi dibandingkan antioksidan (Kurkcu, et al., 2010).
Kondisi ini pada akhirnya berdampak luas pada tubuh seperti terjadinya kanker
dan penyakit-penyakit kronis lain (Waris dan Ahsan, 2006).Stres oksidatif
diakibatkan oleh adanya reaksi metabolik yang menggunakan oksigen dan
menunjukkan gangguan keseimbangan status reaksi oksidan dan antioksidan pada
1
Universitas Sumatera Utara
makhluk hidup. ROS yang berlebihan akan merusak lipid seluler, protein maupun
DNA dan menghambat fungsi normal sel (Kovacic dan Jacintho, 2001).
Radikal bebas oksigen dibentuk sebagai hasil samping metabolisme seluler
aerobik dan diproduksi dalam kondisi stress oksidatif. Kadar ROS yang tinggi
dapat merusak sel. ROS meliputi radikal superoksida, hidroksil, peroksil dan
molekul hidrogen peroksida yang dapat memodifikasi protein seluler, lipid, DNA
dan mengubah fungsi sel. Telah dilaporkan dalam beberapa penelitian bahwa
kadar ROS yang tinggi adalah kunci utama mekanisme inisiasi dan progresi
penyakit degeneratif serta proses terjadinya kanker (Susantiningsih, 2015).
Radikal bebas yang mengambil elektron dari DNA dapat menyebabkan perubahan
struktur DNA sehingga menginduksi sel-sel mutan. Bila mutasi terjadi dalam
waktu yang lama dapat menjadi sel-sel kanker (Werdhasari, 2014).
Antioksidan adalah molekul yang dapat mereduksi efek radikal bebas
dengan menstabilkan molekul berbahaya, menetralkan radikal bebas dengan
menerima atau mendonasikan elektron tersebut dengan mengeliminasi kondisi
elektron yang tidak berpasangan pada radikal (Lu, et al., 2010). Penggunaan
antioksidan yang bekerja sebagai scavenger radikal bebas merupakan suatu
strategi untuk mencegah proses inisiasi sel kanker yang dipicu oleh ROS, dan
merupakan tahap awal karsinogenesis sehingga dengan demikian dapat
menurunkan insiden terjadinya kanker (Wolfe, et al., 2008). Antioksidan
menyebabkan resistensi terhadap stres oksidatif dengan meredam radikal bebas,
menghambat peroksidasi lipid, dan mekanisme lain sehingga dapat mencegah
penyakit (Ahalya, et al., 2013).
2
Universitas Sumatera Utara
Senyawa yang dapat melindungi sel dari bahaya seperti stres oksidatif
maka senyawa tersebut memiliki aktivitas sitoprotektif. Aktivitas sitoprotektif
suatu senyawa tersebut dalam proteksi sel diperoleh dengan cara homeostasis
redoks ROS dan RNS oleh senyawa antioksidan (Alezandro, et al., 2013). Kedua
spesies tersebut mengakibatkan disfungsi mitokondrial, gangguan produksi
protein, dan aggregasi protein yang menyebabkan modulasi aktivasi apoptosis,
nekrosis, dan autophagis sel (Navarro-Yepes, et al., 2014). Pengujian sitoprotektif
dilakukan dengan menggunakan pereaksi MTT pada sel hidup. Metode ini dapat
digunakan untuk mengukur jumlah sel, sitotoksisitas, proliferasi, dan aktivasi sel.
Hasil dari pengujian dapat dibaca pada multi-well scanning spektrofotometer
(ELISA reader) dan menunjukkan tingkat presisi yang tinggi (Montagnon, et al.,
1981). Sel Vero merupakan sel epitel bukan kanker (normal) yang berasal dari
organ ginjal monyet hijau Afrika. Pengujian sel Vero dilakukan untuk
mempelajari pertumbuhan sel, diferensiasi sel, sitotoksisitas, dan transformasi sel
yang diinduksi berbagai senyawa kimia (Goncalves, et al., 2006).
Coleus amboinicus Lour. (Daun bangun-bangun) dengan sinonim
Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng. merupakan tanaman etnobotani
Indonesia yang telah dimanfatkan secara turun-temurun oleh masyarakat
Sumatera Utara, terutama ibu-ibu yang baru melahirkan, untuk meningkatkan
kualitas dan kuantitas air susu ibu (ASI) (Santosa dan Hertiani, 2005). Tanaman
ini mengandung senyawa fitokimia seperti senyawa fenolik dan flavonoid,
saponin, glikosida flavonol dan minyak atsiri yang memiliki potensi sebagai
aktivitas antibakteri, antifungal, antiseptik, antiviral, dan antioksidan (Hole, et al.,
2009; Santosa dan Hertiani, 2005). Beberapa penelitian tentang tumbuhan ini di
3
Universitas Sumatera Utara
antaranya oleh Hasibuan, et al., (2013) telah melakukan penelitian tentang
aktivitas antioksidan dan sitotoksis ekstrak daun bangun-bangun. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa ekstrak etilasetat dan ekstrak etanol memiliki aktivitas
antoksidan dengan nilai IC50 masing-masing 350,74 µg/mL dan 281,26 µg/mL
dengan metode DPPH. Ekstrak etanol dan etilasetat menunjukkan aktivitas
antioksidan yang tinggi dengan metode β-Carotene-Linoleic Acid. Ekstrak nheksan dan etilasetat menunjukkan potensi sitotoksik pada sel MCF-7 dengan IC50
63,644 µg/mL; dan 7,647 µg/mL. Ekstrak etanol daun Bangun-bangun juga
berpotensi sebagai anticlastogenic dan ternyata ekstrak etanol daun Bangunbangun mampu melindungi kerusakan kromosom yanng diinduksi dengan
siklofosfamid dan mitomycin pada sel (Shyama, et al., 2002). Uji sitotoksik
ekstrak n-heksana daun Bangun-bangun (ENDBB), etil asetat daun Bangunbangun (EEADBB) dan etanol daun Bangun-bangun (EEDBB) pada sel Hela
menunjukkan nilai IC50 76,322 µg/mL; 143,291 µg/mL; dan 88,997 µg/mL.
Penurunan nilai IC50 berkorelasi dengan peningkatan sitotoksisitas. Potensi
aktivitas sitotoksis ekstrak kurang dari 100 µg/mL. Hasil yang berbeda pada sel
Vero, ekstrak etanol daun Bangun-bangun praktis tidak toksis pada sel Vero.
Ekstrak n-heksan memiliki nilai sitotoksik lebih kecil pada sel Vero dengan IC50
414,467 µg/mL; ekstrak etil asetat memiliki nilai sitotoksik moderat pada sel
Vero dengan IC50 55,972 µg/mL (Rosidah dan Hasibuan, 2014).
Beberapa penelitian sebelumnya tentang uji sitoprotektif yaitu, Ginting,
2015 telah menguji aktivitas antioksidan ekstrak etanol umbi wortel (Daucus
carota L.) serta aktivitas sitoprotektif pada sel Vero. Waris, 2015 telah melakukan
penelitian tentang efek sitoprotektif dan antioksidan ekstrak etanolik buah jambu
4
Universitas Sumatera Utara
biji merah (Psidium guajava L.) dan tomat (Lycopersicon lycopersicum
L.Karsten).
Penelitian ini bertujuan untuk menguji efek sitoprotektif daun bangunbangun (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.) pada sel Vero. Agen yang
digunakan sebagai penginduksi radikal bebas pada uji sitoprotektif adalah H2O2..
1.2 Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang maka perumusan masalah penelitian ini adalah:
a. apakah ENDBB, EEADBB, dan EEDBB dapat meningkatkan viabilitas
terhadap sel Vero yang diinduksi H2O2?
b. manakah ekstrak yang dapat menurunkan apoptosis sel Vero yang
diinduksi H2O2?
c. manakah ekstrak yang dapat mereduksi ROS (Reactive Oxigen Species)
pada sel Vero yang diinduksi H2O2?
1.3 Kerangka Pikir Penelitian
Sel Vero yang diinduksi H2O2 mengakibatkan stres oksidatif sehingga
merusak sel Vero. Dengan pemberian ENDBB, EEADBB dan EEDBB yang
mengandung flavonoid menunjukkan aktivitas sitoprotektif. Hubungan variabelvariabel tersebut dapat dilihat pada kerangka pikir penelitian (Gambar 1.1).
5
Universitas Sumatera Utara
ENDBB
ENDBB
Ekstrak dengan % sel
hidup tertinggi
ENDBB
Sel Vero
Sel Vero
H2O2 0,8 mM
H2O2 0,8 mM
Uji MTT
Apoptosis
Viabilitas sel
Sel apoptosis
% sel hidup
% sel hidup
Ekspresi protein ROS
Perubahan warna sel
Warna
coklat
Warna
biru
% sel hidup ENDBB
% sel hidup EEADBB
% sel hidup EEDBB
Keterangan:
= Variabel terikat
= Parameter
Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian
6
Universitas Sumatera Utara
1.4 Hipotesis
Berdasarkan rumusan masalah di atas, maka hipotesis penelitian ini adalah
sebagai berikut:
a. ENDBB, EEADBB, dan EEDBB dapat meningkatkan viabilitas sel Vero
yang diinduksi H2O2.
b. ekstrak yang dapat menurunkan apoptosis sel Vero yang diinduksi H2O2
adalah EEADBB dan EEDBB.
c. ekstrak yang dapat mereduksi ROS pada sel Vero yang diinduksi H2O2
adalah EEADBB dan EEDBB.
1.5 Tujuan Penelitian
Berdasarkan hipotesis di atas maka tujuan penelitian adalah untuk:
a. mengetahui efek peningkatan viabilitas ENDBB, EEADBB, dan EEDBB
terhadap sel Vero yang diinduksi H2O2.
b. mengetahui ekstrak EEADBB dan EEDBB dapat menurunkan apoptosis
sel Vero yang diinduksi H2O2.
c. mengetahui ekstrak EEADBB dan EEDBB dapat mereduksi ROS pada sel
Vero yang diinduksi H2O2.
1.6 Manfaat Penelitian
Berdasarkan tujuan penelitian diatas, penelitian ini diharapkan memberi
informasi ilmiah kepada tenaga kesehatan, khususnya farmasis, bahwa daun
Bangun-bangun dapat dimanfaatkan sebagai salah satu obat tradisional yang
bersifat sitoprotektif, karena telah terbukti dapat melindungi tubuh dari serangan
oksidan dalam hal ini H2O2.
7
Universitas Sumatera Utara