24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
9.1. Hasil
9.1.1. Penentuan Metode Analisis Lansoprazol
9.1.1.1.Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Penentuan panjang
gelombang maksimum
dilakukan dengan
menggunakan spektrofotometer
ultraviolet-visibel, diperoleh
serapan maksimum Lansoprazol pada panjang gelombang 283 nm. Spektrum serapan
Lansoprazol dapat dilihat pada lampiran 1 gambar 6.1.
9.1.1.2.Penetapan Komposisi Fase Gerak
Penetapan kadar Lansoprazol dalam darah in vitro dilakukan pada kondisi optimum dengan kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom
Acclaim
®
C18 dengan kecepatan alir 0,8 mLmenit, panjang gelombang 283 nm, dan volume penyuntikan 10 L Komposisi fase gerak semula terdiri dari
metanol:dapar fosfat pH 7 70:30. Pada komposisi ini, waktu retensi Lansoprazol yaitu 2,95 menit. Kemudian dilakukan modifikasi fase gerak
yaitu komposisi kedua metanol-dapar fosfat pH 7 65:35 dan komposisi ketiga metanol-dapar fosfat pH 7 60:40. Pada komposisi metanol-dapar
fosfat pH 7 65:35 waktu retensi Lansoprazol yaitu 3,67 menit. Sedangkan pada komposisi metanol-dapar fosfat pH 7 60:40 waktu retensi Lansoprazol
yaitu 5,04 menit. Laju alir yang digunakan adalah 0,8 mlmenit. Namun hasil optimasi ini memberikan data kromatogram dengan puncak yang lebar dan
pada komposisi 60:40 dihasilkan double peak. Kemudian dilakukan modifikasi lagi dengan penambahan TEA
Trietilamin dengan komposisi metanol:dapar fosfat 65:35 dengan penambahan TEA hingga pH 7,4. Dengan komposisi fase gerak ini,
didapatkan waktu retensi sekitar 3,77 menit. Metode ini dipilih karena menghasilkan plat teoritis yang lebih banyak daripada komposisi fase gerak
yang lain, HETP Height Equivalent Theoritical Plate yang lebih kecil,
25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
faktor kapasitas yang memenuhi persyaratan 1-10 serta asimetrisitas yang baik 2,5 sebagaimana tercantum tercantum pada tabel 4.1.
Tabel 4.1. Hasil penetapan komposisi fase gerak pada konsentrasi 10 µgmL, kecepatan alir 0,8 mLmenit, panjang gelombang 283 nm, dan volume
penyuntikan 10 L.
Keterangan: TR
= Time Retention waktu retensi N
= Plat Teoritis HETP = Height Equivalent Theoritical Plate
9.1.1.3.Uji Kesesuaian Sistem
Pada uji kesesuaian sistem terdapat parameter-parameter untuk menetapkan kesesuaian sistem sebelum analisis, yaitu meliputi plat teoritis
N, resolusi atau daya pisah, dan nilai koefisien variasi dari luas area dari serangkaian injeksi minimal 6 kali injeksi. Syarat utama adalah RSD
Relative Standard Deviation dari luas area, yaitu ≤ 2. Uji kesesuaian
sistem yang dilakukan telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan, kecuali parameter plat teoritis N. Data mengenai uji kesesuaian sistem terdapat pada
tabel 4.2 dan data selengkapnya tercantum dalam lampiran 4 tabel 6.1.
Tabel 4.2. Hasil uji rata-rata kesesuaian sistem sampel Lansoprazol pada konsentrasi 10 gmL dengan komposisi fase gerak metanol:dapar fosfat 65:35
dengan penambahan TEA hingga pH 7,4 pada kecepatan alir 0,8 mLmenit, panjang gelombang 283 nm dan volume penyuntikan 10
L.
Parameter Uji Persyaratan
Hasil Uji Rata-rata
Plat Teoritis 2500
1091,67 Asimetris
2,5 0,88
Faktor Kapasitas 1-10
1,22 RSD Relative Standard Deviation
≤2 0,576
Fase Gerak
vv TR
menit Luas
Puncak µAU
N HETP
Faktor Kapasitas
Asimetri
65:35 +TEA
3,773 3592,9
1130 0,0133
1,22 0,86
3,767 3576,1
1084 0,0138
1,22 0,85
70:30 2,950
7162,2 351
0,0427 0,73
1,62 65:35
3,890 7691,9
303 0,0495
1,24 1,66
60:40 4,997
8172,3 251
0,598 1,92
1,71
26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
9.1.1.4.Penetapan Metode Ekstraksi
Penetapan metode ekstraksi pada awalnya dilakukan penambahan EDTA 10 pada darah untuk memperoleh plasma. Kemudian dilakukan modifikasi
metode ekstraksi dengan mengendapkan protein darah sekaligus menarik Lansoprazol, dari hasil percobaan didapatkan bahwa pelarut yang baik
digunakan adalah metanol dengan perbandingan 1 bagian supernatan plasma dan 4 bagian metanol dalam 1,5 mL, dikarenakan pada
perbandingan tersebut tidak terdapat interferen pada waktu retensi Lansoprazol. Kemudian dilakukan pengukuran untuk darah yang telah
mengandung Lansoprazol dengan konsentrasi 5 µgml, 3 µgml, dan 1 µgml. Data mengenai penetapan pelarut pengendap protein plasma pelarut
ekstraksi terdapat pada tabel 4.3. Tabel 4.3. Hasil penetapan pelarut pengendap protein plasma
Pengendap Protein
Kosentrasi µgml
Waktu Retensi menit
Luas Puncak µAU
Faktor kapasitas
Metanol 5
3,833 1626,4
1,22 3
3,826 714,1
1,23 1
- -
- 9.1.2.
Validasi Metode Analisis dalam Darah secara In Vitro 9.1.2.1.Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas dalam Darah in vitro
Uji ini dilakukan pada seri larutan standar Lansoprazol dalam darah dengan konsentrasi 2-6
gmL, dari uji ini akan didapat persamaan regresi linier dan koefisien korelasi r. Hasil uji diperoleh persamaan garis y =
477,35x - 776,42, dan koefisien korelasi r 0,9875, kurva kalibrasi dari persamaan garis tersebut terdapat dalam gambar 4.1. Data hasil percobaan
selengkapnya tercantum pada lampiran 5 dalam tabel 6.2.
27
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4.1. Kurva kalibrasi Lansoprazol dalam darah
9.1.2.2.Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi dalam Darah in vitro
Uji batas deteksi dan batas kuantitasi dilakukan untuk mengetahui batas deteksi dan batas kuantitasi terendah dari sampel yang masih dapat
menghasilkan data dengan akurasi dan presisi yang baik. Batas deteksi yang diperoleh dari hasil pengujian sebesar 0,619 gmL dan batas kuantitasi 2,05
gmL. Data mengenai uji batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dilihat pada tabel 4.4 dan data hasil percobaan selengkapnya tercantum pada
lampiran 6 dalam tabel 6.3.
Tabel 4.4. Hasil uji batas deteksi, batas kuantitasi dan koefisien fungsi
Parameter Nilai
Simpangan Baku Residual S yx 98,17
Limit Deteksi LOD 0,619
gmL Limit Kuantitasi LOQ
2,05 gmL
9.1.2.3.Uji Selektivitas
Uji selektivitas dilakukan terhadap sampel konsentrasi 5 gmL dilakukan sebanyak 6 kali untuk mengetahui spesifitas metode tersebut. Syarat untuk uji
selektivitas adalah RSD Relative Standard Deviation dengan nilai ≤ 15
dan akurasinya diff dengan nilai ± 15. Data hasil uji rata-rata terdapat pada tabel 4.5 dan Data hasil percobaan tercantum pada lampiran 7 dalam
tabel 6.4.
500 1000
1500 2000
2500
1 2
3 4
5 6
7
L uas A
re a
µ A
U
Konsentrasi μgmL
Kurva Kalibrasi Lansoprazol dalam Darah
28
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 4.5. Hasil uji rata-rata selektivitas
C μgmL
Rata-rata Luas Puncak µAU
SD RSD
diff rata-rata
5 1630,92
13,26 0,813 -0,793
Keterangan: C
= Konsentrasi SD = Simpangan Baku
KV = Koefisien Variasi
9.1.2.4.Uji Akurasi
Uji akurasi dilakukan pada 3 konsentrasi sampel, yaitu pada 3 gmL, 4
gmL dan 5 gmL dilakukan sebanyak 3 kali untuk masing-masing konsentrasi. Syarat hasil uji akurasi adalah diff
dengan nilai ≤ 15. Kemudian dihitung pula nilai perolehan kembali recovery, nilai ini
disyaratkan pada ≤ 15 dalam sediaan biologis. Hasil uji rata-rata dapat dilihat pada tabel 4.6 dan data hasil percobaan selengkapnya tercantum pada
lampiran 8 dalam tabel 6.6. Tabel 4.6. Hasil uji rata-rata akurasi
9.1.2.5.Uji Presisi
Uji dilakukan pada 3 konsentrasi sampel, yaitu pada 3 gmL, 4 gmL
dan 5 gmL diulangi sebanyak 3 kali untuk masing-masing konsentrasi,
dilakukan pada pengujian intra-hari dalam 1 hari dan inter-hari selama 2 hari berturut-turut. Syarat hasil uji presisi adalah simpangan baku relatif atau
RSD Relative Standard Deviation dari masing-masing konsentrasi dengan nilai ≤ 15. Hasil uji rata-rata presisi dapat dilihat pada tabel 4.7 dan 4.8
serta data hasil percobaan selengkapnya tercantum pada lampiran 9 dalam tabel 6.7.
C μgmL
Rata-rata Luas Puncak
µAU Rata-rata
Perolehan Kembali
SD RSD
diff rata-rata
3 714,3
104,09 8,57
1,2 4,09
4 1231,5
105,16 2,89
0,24 5,16
5 1636,27
101,09 18,1
1,11 1,09
29
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 4.7. Hasil uji rata-rata presisi H-1 intra day
C μgmL
Rata-rata Luas Puncak µAU
SD RSD
diff rata-rata
3 714,3
8,57 1,2
4,09 4
1231,5 2,89
0,24 5,16
5 1636,27
18,1 1,11
1,09 Tabel 4.8. Hasil uji rata-rata presisi H-2 inter day
C μgmL
Rata-rata Luas Puncak µAU
SD RSD
diff rata-rata
3 710,83
9,35 1,31
3,85 4
1205,47 5,8
0,48 3,79
5 1612,73
12,45 0,77
0,1
9.2. Pembahasan
Kategori