Persiapan PrebiotikEkstraksi Oligosakarida Persiapan Probiotik Prosedur Uji Tantang

3

II. BAHAN DAN METODE

2.1 Persiapan PrebiotikEkstraksi Oligosakarida

Proses ekstraksi oligosakaridaprebiotik mengacu pada metode Muchtadi 1989. Sebanyak 500 g tepung ubi jalar varietas sukuh Ipomoea batatas L. dicampur air dengan perbandingan 1:1 wv dan dikukus pada suhu 100 o C selama 30 menit. Kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 55 o C selama 18 jam. Selanjutnya, digiling dan disaring dengan ayakan hingga tepung kukus ubi jalar varietas sukuh dapat terkumpul. Pada proses ekstraksi, sebanyak 10 g tepung kukus ubi jalar varietas sukuh disuspensikan ke dalam 100 mL etanol 70 dan diinkubasi dalam thermoshaker selama 15 jam dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang. Kemudian dilakukan penyaringan menggunakan kertas saring steril. Filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan evaporator vakum pada suhu 40 o C. Setelah itu hasil ekstraksi di frezee dry hingga diperoleh padatan ekstrak oligosakarida. Hasil ekstraksi ini diencerkan dengan akuades dengan perbandingan 1:1 wv.

2.2 Persiapan Probiotik

Pertama dilakukan kultur bakteri probiotik SKT-b pada media Sea Water Complete SWC-agar miring 5 g bactopeptone, 1 g yeast extract, 3 ml gliserol, 15 g agar, 750 ml air laut, dan 250 ml akuades dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Kemudian bakteri probiotik SKT-b tersebut diinokulasikan ke dalam media SWC cair dan diinkubasi dalam waterbath shaker pada suhu 29-30 o C dengan kecepatan 140 rpm selama 16 jam. Setelah itu, suspensi bakteri dipindahkan ke dalam eppendorf untuk masing-masing perlakuan kemudian disentrifuse selama 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm untuk memisahkan padatan sel bakteri dengan supernatan. Supernatan dibuang dan diperoleh padatan sel bakteri probiotik yang akan dicampurkan dengan prebiotik dan pakan.

2.3 Pengujian Sinbiotik secara In Vivo

2.3.1 Persiapan Wadah

Wadah yang digunakan dalam penelitian ini adalah 20 akuarium berukuran 60 cm x 30 cm x 40 cm. Sebelum digunakan, akuarium dicuci terlebih dahulu 4 dengan deterjen dan dikeringkan. Kemudian didesinfeksi dengan klorin 100 ppm dan dibiarkan selama 24 jam. Setelah itu akuarium dibilas dengan air tawar hingga bersih, kemudian sebanyak 45 L air laut dimasukkan pada setiap akuarium. Media pemeliharaan menggunakan air laut yang berasal dari Ancol. Air laut terlebih dahulu ditampung dalam tandon dan didesinfeksi dengan klorin 30 ppm dan dinetralkan dengan Na-Thiosulfat 15 ppm. Setiap akuarium dilengkapi dengan aerasi dan shelter sebagai tempat udang berlindung saat molting. Pada semua ulangan setiap perlakuan dirangkai dalam satu sistem resirkulasi Lampiran 1. Bagian tepi setiap akuarium ditutup dengan plastik hitam untuk menghindari pengaruh luar yang dapat mengakibatkan udang stress, serta bagian atas akuarium ditutup dengan waring untuk menghindari udang lompat keluar akuarium.

2.3.2 Persiapan Hewan Uji

Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah benur udang vaname stadia PL 41 yang berasal dari Labuan, Banten. Sebelum diberi perlakuan, benur dipelihara selama 12 hari dalam tandon 1 m 3 . Selama pemeliharaan udang diberi pakan komersil 5 kali sehari pukul 06.00, 10.00, 14.00, 18.00, dan 22.00 WIB. Pemeliharaan dilakukan dengan sistem resirkulasi menggunakan top filter, dilakukan penyiponan terhadap sisa pakan dan feses pada pagi dan sore hari.

2.3.3 Persiapan Pakan Uji

Pembuatan sinbiotik dilakukan dengan mengkombinasikan probiotik dan prebiotik pada pakan yang akan diberikan. Dosis probiotik yang digunakan sebesar 1 ww dari jumlah pakan yang akan diberikan Wang 2007. Dosis prebiotik yang digunakan dalam penelitian ini sebesar 1, 2, dan 3 vw dari jumlah pakan yang akan diberikan. Pencampuran dilakukan dengan menambahkan gelatin sebanyak 3 Pearce et al. 2002 dari total pakan yang berfungsi sebagai perekat, termasuk pada perlakuan kontrol. Setelah selesai dilakukan pencampuran dan sebelum diberikan ke udang, pakan dikeringanginkan terlebih dahulu selama 15 menit untuk mengurangi kelembaban.

2.3.4 Perlakuan Pakan Uji pada Udang Vaname

Pakan uji yang digunakan dalam penelitian ini berupa pelet komersil dengan kandungan protein sebesar 40. Penelitian ini terdiri dari 5 perlakuan dengan 4 kali ulangan seperti disajikan pada Tabel 1. 5 Tabel 1. Perlakuan pemberian pakan sinbiotik dengan dosis prebiotik berbeda pada pakan udang vaname L. vannamei dan infeksi dengan IMNV. Perlakuan Keterangan Perlakuan 1 Pemberian pakan komersil tanpa penambahan sinbiotik dan tanpa infeksi IMNV kontrol - Perlakuan 2 Pemberian pakan komersil tanpa penambahan sinbiotik kemudian diinfeksi IMNV kontrol + Perlakuan 3 Pemberian pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 1 kemudian diinfeksi IMNV P1 Perlakuan 4 Pemberian pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 2 kemudian diinfeksi IMNV P2 Perlakuan 5 Pemberian pakan komersil dengan penambahan probiotik dan prebiotik 3 kemudian diinfeksi IMNV P3 Pemeliharaan udang dengan pemberian perlakuan sinbiotik dilakukan selama 30 hari. Udang uji sebanyak 40 ekor dengan bobot rata-rata 0,647±0,049 gekor dipelihara dalam akuarium dengan volume air laut 45 L. Pemberian pakan dilakukan lima kali dalam sehari pada pukul 06.00, 10.00, 14.00, 18.00, dan 22.00 WIB. Pemberian pakan sinbiotik diberikan satu kali pada pukul 10.00 dan pada waktu pemberian pakan yang lain diberikan pelet komersil secara at-satiation serta dilakukan penyiponan terhadap sisa pakan dan feses.

2.4 Prosedur Uji Tantang

Uji tantang yang dilakukan adalah infeksi IMNV melalui injeksi. Udang vaname positif IMNV didapatkan dari Balai Pengembangan Budidaya Air Payau BPBAP Situbondo, Jawa Timur yang diekstrak berdasarkan prosedur yang dilakukan Escobedo et al. 2006 untuk didapatkan stok virus IMNV. Sebanyak 5 ekor udang positif IMNV bobot rata-rata 10 g dibersihkan dan dibuang bagian hepatopankreas, usus, dan karapasnya. Setelah itu daging udang dicacah hingga halus dan diperoleh hasil cacahan udang positif IMNV dengan volume 10 mL kemudian dilarutkan dalam PBS 100 mL 10 kali volume daging. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 6.500 rpm 4 o C selama 20 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan dalam mikrotube baru, kemudian disentrifuse dengan kecepatan 13.000 rpm 4 o C selama 20 menit. Selanjutnya supernatan diambil dan difilter dengan syringe filter berukuran 0,45 µ m. Hasil 6 filter yang diperoleh merupakan stok ekstrak virus IMNV dan disimpan pada suhu -70 o C. Injeksi dengan IMNV dilakukan pada bagian punggung antara segmen 3 dan 4 sebanyak 100 µLekor Tang et al. 2005. Setelah pemeliharaan dilakukan uji tantang selama 12 hari dengan padat tebar 15 ekorakuarium, dilakukan pengamatan terhadap sintasan dan gejala klinis. Udang uji kontrol negatif diinjeksi dengan PBS Phosphate Buffer Saline sebanyak 100 µLekor.

2.5 Parameter Pengamatan