aureus prediksi Prediction of the Growth of Staphylococcus aureus in Chicken Sausage

pertumbuhan S. aureus menggunakan program DMFit sehingga diperoleh nilai laju pertumbuhan dan lama waktu lag Gambar 2. Tahapan selanjutnya ialah pembuatan model berdasarkan data laju pertumbuhan dan lama waktu lag menggunakan RSM MODDE 5. Validasi model RSM dilakukan dengan memasukan nilai suhu dan waktu pada rentang percobaan untuk memperoleh nilai laju pertumbuhan dan lama waktu lag dari model RSM yang kemudian dibandingkan dengan nilai sebenarnya dari percobaan. Setelah didapatkan model tervalidasi, dilakukan pembuatan kurva pertumbuhan dengan menggunakan persamaan Baranyi. Gambar 2. Diagram alir penelitian. Uji Konfirmasi BAM 2001 Pewarnaan Gram Kultur terduga S.aureus dipindahkan dengan ose ke atas gelas obyek. Gelas obyek tersebut kemudian dilewatkan di atas api, diberi pewarna primer ungu Kristal dan didiamkan selama 1 menit kemudian dibilas dengan air. Kultur yang telah dibilas itu diberi iodium didiamkan selama 2 menit, kemudian dibilas dengan air dan dilanjutkan dengan alkohol hingga warnanya menjadi pucat Uji Konfirmasi S. aureus Persiapan inokulum Innokulasi kultur S. aureus 0, 20, dan 100 cfug pada sosis ayam Persiapan sampel sosis ayam Jumlah S. aureus Nilai laju pertumbuhan dan lama waktu lag dari DMFit Kurva pertumbuhan Disimpan pada -5, 2.5, dan 10 °C Permodelan dengan RSM VALIDASI Kurva Pertumbuhan

S. aureus prediksi

menggunakan persamaan Baranyi sekitar 30 detik. Kemudian kultur diatas gelas obyek tersebut diwarnai dengan safranin dan dibiarkan selama 30 detik lalu dibilas dengan air dan dikeringkan. Setelah itu kultur dapat diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. Uji Katalase Untuk uji katalase, 1 ose kultur terduga S.aureus dari biakan agar miring TSA diletakan di atas gelas obyek, kemudian diteteskan cairan peroksida 0.3 dan diamati reaksi yang terjadi. Bila terbentuk gelembung gas pada kultur, maka kultur yang diuji merupakan katalase positif. Uji Koagulase Koloni terduga S.aureus diinokulasikan kedalam tabung yang berisi 0.2 - 0.3ml BHIB lalu dikocok. Sebanyak satu loop suspensi kultur BHIB diinokulasikan pada agar miring TSA kemudian inkubasi miring selama 18-24 jam pada 25 C. Kultur pada agar miring ini dipertahankan pada suhu ruang untuk uji tambahan atau uji ulangan jika hasil uji koagualase diragukan. Sebanyak 0.5 ml reconstituted coagulase plasma rabit dengan EDTA ditambahkan kedalam kultur BHIB dicampurkan merata. Kemudian suspensei tersebut diinkubasi pada 35 C dan diperiksa adanya gumpalan yang terbentuk setelah 6 jam. S.aureus pada penelitian ini dianggap koagulase positif jika menunjukan reaksi 3+ dan 4+ Gambar 3. Hasil koagulase yang direkomendasikan dianggap positif adalah yang menunjukan reaksi 3+ dan 4+. Strain yang menunjukan 1+ dan 2+ disarankan untuk diuji lanjut dengan uji termonuklease TNase Tattini dan Bennett 1999. Negatif Positif Keterangan: Negatif : tidak terlihat fibrin yang terbentuk 1+ positif : gumpalan kecil yang tidak beraturan 2+ positif : gumpalan kecil yang beraturan 3+ positif : gumpalan besar yang beraturan 4+ positif : seluruh isi tabung menggumpal dan tetap berada di dasar tabung dibalikkan Gambar 3. Interpretasi hasil uji koagulase. Persiapan sampel Sosis ayam dibuka dari kemasannya kemudian dikukus selama 10 menit dan ditiriskan dalam plastik steril. Sosis ayam yang telah dingin kemudian diinokulasi S. aureus yang telah ditumbuhkan pada media BHI selama 24 jam dengan cara dicelupkan pada larutan pengencer 150 ml KH 2 PO 4 yang mengandung S. aureus sebanyak 20 dan 100 cfug selama 10 menit dan disimpan pada -5, 2.5, dan 10°C pada wadah steril yang tertutup sesuai dengan kombinasi pada Tabel 4. Tabel 4. Kombinasi faktor konsentrasi S. aureus awal dan waktu penyimpanan. Pembuatan Kurva Pertumbuhan S. aureus Tahap awal pembuatan kurva pertumbuhan S. aureus ialah dengan menumbuhkan bakteri ini pada media BHI pada suhu optimum 35-37 °C. Setiap jam selama 24 jam pada pengamatan diambil sampel dari media BHI tersebut dan ditumbuhkan pada media TSA. Tahap selanjutnya ialah menumbuhkan S. aureus pada sosis dan disimpan pada suhu optimum, pada suhu ruang 30 °C, suhu 25 °C, suhu 10 °C, suhu 2.5 °C, dan suhu -5 °C. Masing-masing suhu pengamatan ini ditumbuhkan pada media TSA. Koloni terduga S. aureus yang berwarna kuning dihitung dan selanjutnya dibuat kurva pertumbuhannya. Digunakan pula data pembanding dari penelitian Dwintasari 2010 pada S. aureus ATCC 25923 yang ditumbuhkan pada ayam suwir dengan konsentrasi awal 10 dan 10 3 cfu gram -1 dan data pertumbuhan S. aureus pada nasi uduk dengan penyimpanan pada suhu optimum 35-37 °C dengan jumlah mikroba awal 10 3 cfu g -1 dan 10 5 cfu g -1 Rawendra 2008. Tahap selanjutnya ialah menumbuhkan S. aureus pada sosis dan dianalisa dengan media BPA + eggyolk tellurite. Pengamatan dilakukan pada rentang waktu tertentu dengan kombinasi konsentrasi awal S. aureus yang ditumbuhkan dan suhu penyimpanan sesuai dengan rancangan percobaan dari software RSM. Masing-masing kombinasi konsentrasi awal S. aureus dan suhu penyimpanan sosis dibuatlah kurva pertumbuhan dan dari kurva ini akan didapatkan nilai laju pertumbuhan dan lama waktu lag. Kedua parameter ini selanjutnya diinput kedalam software RSM sebagai respon sehingga akan didapatkan model. Penghitungan jumlah S. aureus dengan Metode Sebar BAM 2001 Setiap waktu tertentu selama interval penyimpanan, sosis ayam yang telah diinokulasi S. aureus diambil sebanyak 25 gram. Sampel diencerkan dengan 225 ml larutan pengencer buffer fosfat. Kemudian sampel di homogenisasi dengan stomacher selama 2 menit. Selanjutnya dibuat seri pengeceran. Sebanyak 1 ml suspensi sampel dari setiap tingkat pengenceran di pindahkan ke dalam tiga cawan BPA + egg yolk tellurite. Distribusi inokulum tersebut dilakukan dalam jumlah yang sama di setiap cawan yaitu 0.4 ml, 0.3 ml, dan 0.3 ml. Inokulum disebar pada permukaan agar menggunakan stik hoki steril kemudian dibiarkan selama 10 menit agar inokulum diserap oleh agar. Jika inokulum belum diserap, cawan diletakkan didalam inkubator selama 1 jam. Setelah itu cawan dibalik dan diinkubasi pada suhu 35 º C selama 24-48 jam. Koloni S. aureus berbentuk bulat, licin, dan halus, cembung, lembab, berdiameter 2-3 mm, berwarna abu-abu hingga hitam pekat, dikelilingi batas berwarna terang, serta dikelilingi zona keruh dengan batas luar berupa zona jernih. Konsistensi koloni seperti mentega jika disentuh dengan ose. Cawan yang mengandung 20-200 koloni dipilih untuk perhitungan dengan rumus sebagai berikut: N = Keterangan: N = jumlah bakteri CFUg, n 1 = jumlah cawan pada pengenceran pertama, n 2 = jumlah cawan pada pengenceran kedua, dan d = pengenceran pada cawan pertama. Pembuatan Kurva Pertumbuhan dan Pembuatan model Kurva pertumbuhan dibuat dengan cara menghubungkan jumlah S. aureus dengan waktu pengamatan selama penyimpanan. Kurva ini dibuat pada suhu -5, 2.5, dan 10°C. Setelah dibuat kurva pertumbuhan menggunakan DMFit maka akan didapatkan nilai laju pertumbuhan dan lama waktu lag. Model dibuat dengan mem-plot faktor suhu dan konsentrasi awal S. aureus dengan respon laju pertumbuhan dan lama waktu lag dengan software MODDE sesuai kombinasi pada Tabel 5. Tabel 5. Kombinasi respon laju pertumbuhan dan lama waktu lag S. aureus pada sosis ayam dengan kombinasi faktor-faktor konsentrasi awal 0, 20, dan 100 cfu gram -1 dan suhu penyimpanan dari -5 sampai 10 °C dengan MODDE 5. Nama Percobaan Suhu °C Konsentrasi Awal cfu gram -1 N1 -5 0 N2 -5 20 N3 -5 100 N4 2.5 0 N5 2.5 20 N6 2.5 100 N7 N8 N9 N10 N11 N12 10 10 10 2.5 2.5 2.5 20 100 Validasi Model Model divalidasi dengan membandingkan nilai laju pertumbuhan dan lama waktu lag pada suhu dan konsentrasi awal S. aureus tertentu antara model dengan pengamatan kembali di laboratorium. Berdasarkan nilai prediksi pada kondisi konsentrasi awal dan suhu tertentu dibuatlah kurva pertumbuhan prediksi dengan menggunakan persamaan Baranyi. HASIL DAN PEMBAHASAN Konfirmasi

S. aureus ATCC 25923