9 basa yang bervariasi disebut sebagai polimorfisme serta daerah yang
teramplifikasi oleh primer dinyatakan sebagai lokus dengan variasi panjang produk PCR sebagai alel Chaerani dkk., 2009.
Penanda molekuler dapat digunakan sebagai alat bantu seleksi pada generasi awal dengan tingkat ketelitian yang lebih tinggi yaitu dengan menentukan
penanda yang terpaut dengan suatu sifat yang diinginkan. Identifikasi fragmen spesifik dapat dilakukan dengan analisa dan pemetaan Quantitative Trait Loci
QTL Roberdi dkk., 2010. Penelitian lain yang menggunakan DNA mikrosatelit adalah variasi genetik masyarakat Bali Mula di Desa Sembiran Buleleng dengan
penanda DNA mikrosatelit menggunakan empat lokus yaitu D2S1338, D3S1358, D5S818 dan D13S317 yang menunjukkan bahwa ditemukannya 19 ragam alel
pada lokus D13S317 sebanyak enam alel pada lokus D2S1338, pada lokus D3S1358 sebanyak lima alel dan sebanyak tiga alel pada lokus D5S818 Dwitiari,
2012. Masing-masing lokus DNA mikrosatelit memberikan ragam alel yang akan
mempengaruhi tinggi rendahnya nilai heterozigositas dan nilai kekuatan pembeda Power of Discrimination. Penentuan dalam penggunaan lokus DNA mikrosatelit
yang baik digunakan dalam analisa DNA didasarkan pada tingginya nilai heterozigositas dan Power of Discrimination yang dihasilkan Octavia, 2015;
Rudin and Crim, 2002.
2.5. Ekstraksi DNA
Analisa DNA diawali dengan ekstraksi atau isolasi DNA yang merupakan teknik dasar untuk mempelajari teknik biologi molekuler. Ekstraksi DNA
bertujuan untuk memisahkan asam nukleat dari komponen sel lain yang tidak diperlukan seperti protein, karbohidrat, lemak dan lainnya Davis et al., 1993.
Proses ekstraksi dilakukan secara bertahap meliputi, isolasi dari jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi serta presipitasi atau
pemadatan Wulandari dkk., 2014; Jehuda, 2011. Ekstraksi DNA dapat dilakukan dengan beberapa metode seperti metode
fenol-kloroform, metode membran dialisis, metode chelex dan metode boom.
10 Salah satu metode yang paling umum digunakan adalah metode fenol-kloroform
Toha, 2001. Prinsip utama dari metode fenol-kloroform adalah memisahkan protein dan DNA dari sel oleh fenol-kloroform dilanjutkan dengan presipitasi
DNA menggunakan alkohol. Proses sentrifugasi juga sangat berperan penting dalam isolasi DNA, sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran
berdasarkan berat molekul komponennya dengan memberikan gaya sentrifugal pada kecepatan tertentu. Hasil sentrifugasi akan menunjukan dua fraksi terpisah,
yaitu molekul ringan akan berada pada bagian atas dan molekul berat berada di bagian dasar tabung Sambrook and Russel, 2001.
2.6. Polymerase Chain Reaction PCR
Polymerase Chain Reaction PCR atau reaksi berantai polimerase merupakan suatu metode enzimatis untuk memperbanyak sekuen nukleotida
tertentu secara in vitro. Kelebihan metode PCR ini adalah dapat memperbanyak molekul DNA dan memisahkan gen-gen tertentu, juga mampu bekerja dengan
komponen yang jumlahnya sedikit. Teknik PCR ini pertama kali dikembangkan oleh seorang peneliti dari CETUS Corporation yaitu Kary Mullis pada tahun 1985
Novel dkk., 2011. PCR merupakan suatu teknik yang melibatkan beberapa tahapan berulang
siklus dan tiap siklusnya terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Prinsip kerja PCR terbagi menjadi beberapa tahapan utama yaitu; Tahap I Pra-
denaturasi templat yaitu proses penyesuaian suhu mesin. Tahap II Denaturasi DNA templat yang terjadi pada suhu sekitar 94-96
o
C, merupakan proses pemisahan untaian DNA double helix dengan perlakuan suhu yang tinggi. Tahap
III Annealing yaitu proses penempelan primer pada templat dengan suhu sekitar 45-60
o
C. Tahap IV Extension adalah pemanjangan primer dengan bantuan enzim Taq-polimerase pada rentang suhu sekitar 72-76
o
C. Tahap denaturasi, annealing dan extension akan berulang sebanyak 20-30 siklus dan setiap pengulangannya
menghasilkan cetakan DNA baru secara eksponensial. Peningkatan jumlah siklus melebihi 30 siklus tidak akan meningkatkan jumlah amplikon dan memungkinkan
11 peningkatan jumlah produk non-target. Tahapan terakhir adalah Tahap V Post-
extension yaitu pemantapan Danuz, 2014; Handoyo dan Rudiretra, 2000. Pelaksanaan PCR sangat memerlukan beberapa komponen penting, seperti
templat DNA yang berfungsi sebagai cetakan untuk membentuk molekul DNA baru yang sama. Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang
akan diamplifikasi dan sekaligus menyiapkan gugus hidroksi -OH pada ujung 3’
yang diperlukan pada proses extension. dNTPs deoxynucleotide triphosphates merupakan suatu campuran yang terdiri dari dATP deoksiadenosin trifosfat,
dTTP deoksitimidin trifosfat, dCTP deoksisitidin trifosfat, dan dGTP deoksiguanosin trifosfat, dimana dalam proses PCR dNTPs berfungsi sebagai
building block DNA yang diperlukan dalam proses extension. Bufer untuk menjamin pH medium dan MgCl
2
bertindak sebagai kofaktor untuk menstimulasi aktivitas DNA polimerase. Kemudian, enzim polimerase DNA berfungsi sebagai
katalis untuk reaksi polimerasi DNA Handoyo dan Rudiretra, 2000.
2.7. Elektroforesis
