13
III. BAHAN DAN METODE A. BAHAN DAN ALAT
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini sebagai berikut: a.
Tongkol jagung varietas Bisma yang berasal dari Balai Penelitian Bioteknologi, Cimanggu, Bogor.
b. Kultur mikroorganisme Streptomyces sp. isolat 234P-16, isolat SKK1-8 dan
isolat 45I-3 koleksi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
c. Bahan kimia untuk karakterisasi bahan baku yaitu NaOH, HCl, H
2
SO
4
, campuran metil merah dan biru, CuSO
4
, Na
2
SO
4
, etanol, aseton, aquades, larutan detergen netral NDS, dan larutan detergen asam ADS.
d. Bahan kimia untuk ekstraksi xilan yaitu NaOCl, NaOH, HCl dan etanol teknis,
air aquades, air. e.
Bahan kimia untuk memproduksi xilanase dan hidrolisis xilan yaitu agar-agar, xilan oatspelt, xilan tongkol jagung, sukrosa, ekstrak khamir, larutan buffer
sitrat fosfat, asam dinitrosalisilat DNS, aquades, fenol, dan H
2
SO
4
. f.
Bahan kimia untuk Kromatografi Lapis Tipis KLT adalah isopropanol, etil asetat, aquades, anisaldehid, asam asetat dan H
2
SO
4
serta Thin Layer Chromatography
TLC plate dari Merck. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian diantaranya adalah:
Hammer mill , neraca analitik, autoclave, erlenmeyer, gelas piala, gelas ukur, labu
kjedahl dan alat-alat gelas lain, pipet, desikator, oven, tanur, sentrifuse, pH meter, shaker, penyaring vakum, kertas saring, cawan porselin, cawan alumunium, dan
chamber untuk KLT.
B. METODE PENELITIAN Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap yaitu:
1. Penelitian Pendahuluan Perlakuan pendahuluan yang dilaksanakan yaitu pembuatan tepung
tongkol jagung, karakterisasi bahan baku, delignifikasi, ekstraksi xilan dan purifikasi xilan dari tongkol jagung.
14 Ekstraksi xilan dari tongkol jagung dengan menggunakan metode yang
digunakan dalam Anggraini 2003 dan rendemen xilan optimum. 2. Penelitian Utama
Pada tahap ini dilaksanakan penelitian sebagai berikut: a. Produksi xilanase dengan substrat xilan oatspelt sebagai pembanding
dan xilan tongkol jagung. b. Hidrolisis xilan tongkol jagung dan xilan oatspelt sebagai pembanding
menggunakan xilanase dari prosedur a. c. Karakterisasi hasil hidrolisis dari prosedur b meliputi gula pereduksi,
total gula, derajat polimerisasi dan analisis kualitatif dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis.
C. TATA LAKSANA PENELITIAN 1. Penelitian Pendahuluan
Persiapan bahan yang dilakukan dalam penelitian ini yaitu dengan pengeringan tongkol jagung hingga besar kadar air ± 5 dan menggiling
tongkol jagung menggunakan hammer mill sehingga menjadi bubuk dengan ukuran 40 mesh.
Karakterisasi bahan baku bubuk tongkol jagung meliputi kadar air, kadar abu, kadar serat kasar, kadar protein, kadar lignin, kadar selulosa dan
kadar hemiselulosa. Prosedur karakterisasi bahan baku dapat dilihat pada Lampiran 2.
Ekstraksi xilan dari tongkol jagung berdasarkan penelitian Anggraini 2003 dengan menggunakan pelarut NaOH 15. Secara umum tahapan
proses ekstraksi xilan dari tongkol jagung adalah sebagai berikut: a.
Delignifikasi Proses delignifikasi dilakukan terhadap bubuk tongkol jagung
dengan pelarut natrium hipoklorit NaOCl. Pelarut ini mengandung ion- ion hipoklorit yang mampu memecah ikatan karbon dalam struktur
lignin. Proses delignifikasi dilakukan selama 5 jam pada suhu ruang.
15 b.
Ekstraksi Xilan Pada proses ekstraksi xilan, padatan hasil delignifikasi direndam
dalam larutan NaOH 15 selama 24 jam pada 28
o
C. Kemudian dilakukan penyaringan. Filtrat yang dihasilkan diukur pH-nya dan
diasamkan dengan HCl 6 N hingga pH 4.5-5. Setelah itu dilakukan sentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan putaran 4000 rpm untuk
memisahkan endapan yang mengandung xilan dengan supernatan. Xilan dalam endapan dapat dipisahkan dengan disentrifuse pada kecepatan
putar 4000 rpm selama 30 menit. c.
Purifikasi Xilan Proses purifikasi dilakukan dengan merendam xilan ke dalam
NaOH 4 dan disaring. Setelah penyaringan, filtrat diasamkan dengan HCl 6 N hingga pH 4.5-5 selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan
putar 4000 rpm selama 30 menit. Endapan yang dihasilkan dilarutkan ke dalam etanol 95, disentrifugasi kembali dan dikeringkan pada suhu 50
o
C. Diagram alir proses delignifikasi dan ekstraksi xilan dapat dilihat pada
Gambar 1 sedangkan purifikasi xilan dapat dilihat pada Gambar 2.
Perendaman dalam NaOCl 1 10 l selama 5 jam pada suhu 28
o
C Pencucian
Lignin
Penyaringan
Pengeringan pada suhu 50
o
C selama 48 jam
Bubuk tongkol jagung 1000 g
A
16 Gambar 1. Diagram Alir Proses Ekstraksi Xilan
Perendaman dalam NaOH 15 3 l selama 24 jam pada suhu 28
o
C
Filtrat Pengasaman dengan HCl 6 N hingga
pH 4.5-5 Sentrifugasi 4000 rpm
selama 30 menit
Endapan Hemiselulosa A
Sentrifugasi 4000 rpm selama 30 menit
Etanol : endapan
= 1: 3
Filtrat Sentrifugasi
4000 rpm selama 30
menit Supernatan
Etanol
Filtrat
Xilan Hemiselulosa B
Dilarutkan dalam aquades 1:12,5 bv
Sentrifugasi 6000 rpm, 30 menit Supernatan
Crude xylan Filtrasi
A
B
17 Gambar 2. Diagram Alir Proses Purifikasi Xilan
Dilarutkan dalam NaOH 4 hingga terendam
Endapan
Filtrasi
Kotoran
Filtrat Pengasaman dengan HCl 6 N hingga pH
4,5-5
Sentrifugasi 4000 rpm, 30 menit Supernatan
Endapan Etanol
1.5 l Sentrifugasi 4000 rpm, 30 menit
Supernatan
Xilan murni
Pengeringan pada Oven 50
o
C selama 12 Jam
Xilan murni kering B
18 2. Penelitian Utama
a. Produksi Xilanase Produksi Xilanase dilaksanakan dengan tahapan sebagai berikut:
1 Peremajaan Kultur Peremajaan kultur yaitu dengan mengkulturkan tiga isolat
Streptomyces sp. ke dalam media agar xilan oatspelt. Komposisi
media agar yang digunakan sesuai disajikan pada Tabel 4. Pengkulturan ketiga isolat pada media agar-agar minimal selama 5
hari. Karakteristik isolat Streptomyces sp. yang akan digunakan
dalam penelitian disajikan dalam Tabel 5. Tabel 4. Komposisi Media agar
Bahan Jumlah
Agar-agar 1.5 Xilan oatspelt
0.5 Sukrosa 10.3
Ekstrak khamir 1
Sumber : Hendarwin 2005 Tabel 5. Isolat Streptomyces sp. yang telah dikarakterisasi
Kode Isolat
Asal pH Optimum
Xilanase Suhu
Optimum Xilanase
Masa Inkubasi
Isolat
SKK1-8 Sukabumi 6 50
o
C 12 hari
234P-16 Padang 5 90
o
C 10 hari
45I-3 Kalimantan 5 50
o
C 12 hari
Sumber: Hendarwin 2005 2 Penyiapan Media Produksi
Langkah selanjutnya yaitu dengan memproduksi xilanase pada media cair dengan menggunakan xilan oatspelt dan xilan
tongkol jagung untuk menghasilkan xilanase. Pada media cair dengan menggunakan xilan tongkol jagung dilakukan produksi xilanase
dengan tiga konsentrasi xilan tongkol jagung berbeda yaitu 0.5, 1, dan 1.5. Komposisi media cair yang digunakan disajikan pada
Tabel 6. Ketiga isolat yang telah ditumbuhkan pada media agar-agar
19 xilan oatspelt dinokulasilasikan sebanyak 2 ”cockbor” koloni pada
media cair dengan volume 100 ml dalam erlenmeyer 500 ml dan diinkubasi pada shaker selama 10-12 hari pada suhu 28
o
C. Tabel 6. Komposisi media cair untuk produksi xilanase
Bahan Media Produksi bv
Xilan oatspelt atau Xilan tongkol jagung
0.5 0.5, 1.0, dan 1.5
Sukrosa 10.3 Ekstrak khamir
1.0
3 Pengamatan
Xilanase a Aktivitas Xilanase
Aktivitas xilanase diekspresikan dalam unit U sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk melepaskan 1 mol
ekuivalen reduksi xilosa per menit. Metode pengujian aktivitas xilanase disajikan dalam Lampiran 3
. Aktivitas xilanase pada
penelitian ini berdasarkan kurva standar xilosa pada Lampiran 4. Pada penelitian ini dilakukan perbandingan aktivitas xilanase
antara substrat xilan oatspelt dengan xilan tongkol jagung. b Aktivitas Spesifik Xilanase
Aktivitas spesifik xilanase merupakan perbandingan antara aktivitas xilanase dengan kadar protein ektrak kasar
xilanase. Kadar protein diperoleh dengan menggunakan metode Bradford 1976. Prosedur pengujian kadar protein untuk
penentuan aktivitas spesifik xilanase disajikan dalam Lampiran 5. Aktivitas spesifik xilanase pada penelitian ini berdasarkan
kurva standar protein pada Lampiran 6. b.
Hidrolisis Xilan menggunakan Xilanase Hidrolisis xilan dilakukan dengan cara ekstrak enzim kasar xilanase
pada hari optimum masing-masing isolat diambil sebanyak 1 ml dari kultur cairnya. Ekstrak enzim kasar tersebut kemudian ditambahkan
20 larutan buffer substrat 10 ml dan larutan buffer 9 ml. Hasil pencampuran
ekstrak enzim kasar, larutan substrat buffer dan larutan buffer tersebut ditempatkan pada erlenmeyer dan diinkubasikan pada suhu optimum
masing-masing isolat. Hasil hidrolisis xilan diambil sebanyak 1 ml setiap jamnya selama 5 jam inkubasi dan dididihkan untuk inaktivasi enzim.
c. Karakterisasi Produk Hidrolisis 1 Total Gula
Total gula hasil hidrolisis xilanase ditetapkan berdasarkan metode fenol asam sulfat Apriyantono 1989 dengan prinsip bahwa
gula sederhana, oligosakarida, polisakarida dan turunannya dapat bereaksi dengan fenol dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna
oranye yang stabil. Penetapan total gula dijelaskan dalam Lampiran 7. Nilai total gula pada penelitian ini berdasarkan kurva standar total gula
pada Lampiran 8. 2 Gula Pereduksi
Gula pereduksi diukur menggunakan metode DNS Miller 1959. Prinsip pengukuran yaitu larutan DNS akan bereaksi dengan
gula pereduksi menghasilkan warna oranye. Semakin banyak gula pereduksi maka warna oranye akan semakin pekat. Penetapan gula
pereduksi disajikan dalam Lampiran 3. 3 Derajat Polimerisasi
Derajat polimerisasi menyatakan perbandingan antara total gula dengan gula pereduksi dengan rumus hitung sebagai berikut:
Total gula mgml Derajat polimerisasi =
Gula pereduksi mgml 4 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis KLT merupakan metode untuk identifikasi suatu substansi dan mengetahui kemurniannya. Separasi
pada KLT melibatkan distribusi pencampuran dua atau lebih substansi diantara fase stasioner dan fase gerak. Fase stasioner adalah adsorben
pada plate silica gel. Fase gerak adalah cairan yang dapat membawa
21 sampel melewati fase stasioner. Komponen pada sampel akan terpisah
dari fase stasioner sesuai dengan berapa banyak sampel tersebut terserap pada fase stasioner dan bagaimana sampel dapat terbawa pada
fase gerak. Penyiapan bahan dan metode disajikan pada Lampiran 9.
22
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A.