Kajian Patologi dan Imunohistokimia Kasus Lapang Newcastle Disease pada Ayam

KAJIAN PATOLOGI DAN IMUNOHISTOKIMIA KASUS LAPANG
NEWCASTLE DISEASE PADA AYAM

ETRIWATI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Kajian Patologi dan
Imunohistokimia Kasus Lapang Newcastle Disease pada Ayam adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, Januari 2015
Etriwati
NIM B351120011

*Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB
harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait

RINGKASAN
ETRIWATI. Kajian Patologi dan Imunohistokimia Kasus Lapang Newcastle Disease
pada Ayam. Dibimbing oleh DEWI RATIH AGUNGPRIYONO dan SURACHMI
SETIYANINGSIH.
Newcastle disease (ND) merupakan penyakit yang sangat penting di Indonesia,
karena telah menyebar di seluruh Indonesia dan menimbulkan kerugian besar.
Merebaknya kembali wabah ND pada ayam sejak tahun 2009 sampai saat ini
mengindikasikan bahwa usaha dalam melakukan protektif selama ini belum
menghentikan penyebaran virus Newcastle disease (VND) secara maksimal di lapangan.
Penelitian ini bertujuan mengetahui pola distribusi VND pada organ interna ayam dari
kasus-kasus lapangan melalui pewarnaan imunohistokimia.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sepuluh kasus lapang yang
dikumpulkan dari ayam broiler, layer dan buras berasal dari daerah Jawa Barat yang

dikirim ke Bagian Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (FKH
IPB). Sampel dipilih berdasarkan pemeriksaan klinis dan temuan perubahan patologi
anatomi hasil diagnosis Patologist bagian Patologi, FKH IPB sebagai suspect ND dan
selanjutnya dikonfirmasi positif ND dengan uji real time reverse-trancription polymerase
chain reaction (rRT-PCR) di Bagian Mikrobiologi FKH IPB. Sampel berupa organorgan: trakhea, paru-paru, jantung, proventrikulus, duodenum, seka tonsil, hati, pankreas,
ginjal, limpa, bursa Fabricious dan otak. Semua sampel organ-organ tersebut dipotong 1
x 1 x 0,5 cm dan difiksasi dalam larutan neutral buffered formalin (NBF) 10 % selama
minimal 24 jam dan dibuat sediaan histopatologi dalam paraffin blok.
Pemeriksaan dengan pewarnaan Mayer’s Hematoksilin dan Eosin (HE) untuk
melihat adanya degenerasi dan nekrosis, hemoragi, kongesti, edema, infiltrasi sel-sel
inflamasi dan untuk melihat derajat lesi pada masing-masing organ dilakukan dengan
melihat sebaran lesi fokal dengan derajat ringan, multifokal dengan derajat sedang dan
difus dengan derajat berat. Pengamatan dilakukan dengan pembesaran 100 kali dengan 3
kali ulangan lapang pandang.
Pemeriksaan immunohistokimia (IHK) dilakukan dengan kit komersial untuk IHK
dengan menggunakan prosedur yang dianjurkan dalam katalog Dako, North America. Inc.
Pemeriksaan IHK dinyatakan positif apabila dalam pembacaan preparat ditemukan
antigen yang terwarnai kecoklatan dan derajat imunopositif ND pada masing-masing
organ dilakukan skoring dengan derajat ringan (1-10 sel imunopositif terhadap VND),
sedang (11-20 sel imunopositif terhadap VND) dan berat (lebih dari 20 sel imunopositif

terhadap VND). Pengamatan dilakukan dengan pembesaran 400 kali dengan 3 kali
ulangan lapang pandang.
Hasil pemeriksaan gejala klinis berupa susah bernafas, ngorok, anemia disertai
depresi, nafsu makan menurun, lemah, penurunan berat badan, diare hijau keputihan,
sayap terkulai, susah berdiri dan tortikolis. Pada ayam muda disertai dengan gangguan
pertumbuhan dan ayam betina dewasa diikuti dengan penurunan produksi telur dan

albumin telur encer. Berdasarkan data anamnesis diketahui bahwa ayam broiler dan ayam
layer telah divaksinasi, morbiditas dan mortalitas tinggi. Sedangkan pada ayam buras
tidak divaksinasi, angka morbiditas dan mortalitas 100 %.
Pemeriksaan patologi anatomi (PA) dan Pemeriksaan histopatologi (HP)
menunjukkan terjadinya trakheitis kataral, pneumonia, degenerasi otot jantung,
epikarditis bersamaan dengan miokarditis, proventikulitis kataralis, enteritis kataralis,
thyplitis, degenerasi hati, hepatitis, pankreatitis, nefritis, splenitis, atrofi bursa Fabricious
dan ensefalitis. Derajat lesi PA dan HP secara umum tersebar sedang sampai berat.
Pemeriksaan imunohistokimia menunjukkan reaksi imunopositif pada sel-sel
inflamasi mononuklear dari semua organ yang diamati, sitoplasma sel-sel epitel mukosa
trakhea, sel-sel epitel parabronkhus, pneumosit, sitoplasma otot jantung dan sel-sel
endotel pembuluh darah di jantung, sel-sel epitel lapisan mukosa pada proventrikulus,
duodenum dan sekatonsil, sitoplasma sel-sel hepatosit dan sel-sel asinar pankreas, sel-sel

epitel tubulus, sel-sel endotel pembuluh darah dan sel-sel makrofag di dalam glomerulus
ginjal, sel-sel limfoid di zona mantel bursa Fabricious, sitoplasma sel-sel neuron, sel-sel
glia dan sel-sel endotel pembuluh darah di otak. Derajat imunopositif berat pada semua
organ kecuali pada organ jantung, hati dan pankreas ayam layer dengan derajat sedang.
Pola distribusi dari sepuluh sampel lapang yang digunakan dalam penelitian ini masih
sama dengan pola distribusi VND lama yang tersebar secara sistemik pada organ interna
ayam. Tingkat keganasan VND bersifat velogenik viserotropik yang disertai dengan
velogenik neurotropik. Distribusi VND tinggi ditemukan pada organ trakhea, paru-paru,
proventrikulus, duodenum, seka tonsil, ginjal, limpa, otak dan pada ayam muda ditambah
dengan bursa Fabricious. Distribusi VND sedang ditemukan pada organ jantung, hati dan
pankreas.
Kata kunci: imunohistokimia, kajian patologi, kasus lapang, Newcastle disease

SUMMARY
ETRIWATI. Pathology and Immunohistochemical Studies of Field Case Newcastle
Disease in Chickens. Supervised by DEWI RATIH AGUNGPRIYONO and SURACHMI
SETIYANINGSIH.
Newcastle disease (ND) is a disease that is very important in Indonesia, because
it has spread throughout Indonesia and incurring huge losses. Newcastle disease
outbreaks in 2009 to date indicate that the protective efforts in doing so far not stop the

spread of Newcastle disease virus (VND) to the maximum in the field. The aim of this
study was to detect the distribution patterns of NVD in internal organs of chickens from
a field case by imunohistochemical staining (IHC). Ten chickens groups of broiler, layer
and domestic chickens were collected from necropsy room of Division Pathology, Bogor
Agricultural University. These chickens were originated from West Java and collected
base on Pathologist diagnosis as suspect ND, and subsequently confirmed positive ND
with real time-reverse trancriptase (rRT)-PCR assay. Samples of the organs trachea,
lungs, heart, proventriculus, duodenum, caeca tonsil, liver, pancreas, kidney, spleen,
bursa of Fabricious and brain have been collected. All samples of these organs are
sectioning 1 x 1 x 0.5 cm and were fixed in neutral buffered formalin solution (NBF) 10
% for at least 24 hours and made preparations histopathology in paraffin blocks.
Examination with Mayer's hematoxylin and eosin (HE) staining for the presence
of degeneration and necrosis, hemorrhage, congestion, edema, infiltration of
inflammatory cells and to see the degree of lesion in each organ. The degree of lesion in
each organ grouped by focal lesions with mild, multifocal lesions with moderate and
diffuse lesions with severe degree. Observations were made with a magnification of 100
times with 3 repetitions visual field.
Immunohistochemical staining was performed with a commercial kit for IHC
using the procedure recommended in the catalog Dako, North America. Inc.
Immunohistochemical examination antigen positive when stained brownish and degrees

immunopositive ND in each organ done scoring with mild (1-10 cells immunopositive to
VND), moderate (11-20 immunopositive cells to VND) and severe (more than 20 cells
immunopositive to VND). Observations were made with a magnification of 400 times
with 3 repetitions visual field.
The results of examination of clinical symptoms such as difficulty breathing,
snoring, anemia accompanied by depression, loss of appetite, weak, weight loss, diarrhea
whitish green, drooping wings, hard standing and torticollis. At a young chickens
accompanied with growth disorders and adult hens followed by a decrease in egg
production and egg albumin dilute. According to the data anamnesis is known that the
broiler and layer chickens were vaccinated, high morbidity and mortality. Whereas
unvaccinated domestic poultry, morbidity and mortality of 100 %.

The gross pathology and histopathology changes were tracheitis and pneumonia,
pericarditis and myocarditis, proventriculitis catharral, enteritis catharral, thyplitis,
perihepatitis, pancreatitis, nephritis interstitial, splenitis, atrophy in the bursa of
Fabricious and encephalitis. The degree of lesion gross pathology and histopathology in
general is moderate to severe.
Immunohistochemical examination results showed immunopositive reaction in
mononuclear inflammatory cells of all organs were observed, the cytoplasm of epithelial
cells trachea mucosa, epithelial cells parabronchi, pneumocytes, the cytoplasm of cardiac

muscle and endothelial cells of blood vessels in the heart, epithelial cells in the mucosa
lining of the proventriculus, duodenum and caecal tonsil, the cytoplasm of cells
hepatocytes and pancreatic acinar cells, cells of the tubule epithelial, endothelial cells of
blood vessels and makrofag cells of the glomerulus in the renal, lymphoid cells in the
mantle zone bursa of Fabricious, the cytoplasm of neurons, glial cells and endothelial
cells of blood vessels in the brain. Immunopositive degree is severe on all organs except
in the heart, liver and pancreas organ of chicken layers with a moderate degree.
The distribution patterns of NVD in internal organs of chickens from field case in
this study similar with previously distribution patterns that systemic distribution in the
internal chicken organs. Newcastle disease virus virulence levels categorized as
viscerotropic velogenic accompanied by neurotropic velogenic. The high intensity of
immunohistochemistry were detected in organs trachea, lung, proventriculus, duodenum,
caecal tonsil, kidney, spleen, bursa of Fabricious and brain. The moderate intensity of
immunohistochemistry were detected in organs heart, liver and pancreas.

Keywords: immunohistochemistry, natural field case, Newcastle disease, pathology

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau

menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu
masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam
bentuk apa pun tanpa izin IPB

KAJIAN PATOLOGI DAN IMUNOHISTOKIMIA KASUS LAPANG
NEWCASTLE DISEASE PADA AYAM

ETRIWATI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Biomedis Hewan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR

2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Drh Ekowati Handharyani, MSi PhD APVet

Judul Tesis : Kajian Patologi dan Imunohistokimia Kasus Lapang Newcastle Disease
pada Ayam
Nama
: Etriwati
NIM
: B351120011

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Drh Dewi Ratih Agungpriyono, PhD APVet
Ketua

Drh. Surachmi Setiyaningsih, PhD
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Ilmu Biomedis Hewan

Dekan Pascasarjana IPB

Drh Agus Setiyono, MS PhD

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 20 Januari 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala
karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan November 2013 ini ialah penyakit Newcastle
Disease, dengan judul Kajian Patologi dan Imunohistokimia Kasus Lapang Newcastle

Disease pada Ayam.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Drh. Dewi Ratih Agungpriyono, PhD APVet
dan Drh. Surachmi Setiyaningsih, PhD selaku dosen pembimbing yang telah banyak
meluangkan waktu untuk membantu memberi arahan, bimbingan, dan saran selama
penulis melaksanakan penelitian sampai penyusunan tesis. Terimakasih kepada Prof Drh
Ekowati Handharyani, MSi PhD APVet selaku penguji luar komisi. Penghargaan penulis
sampaikan kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Kementrian Pendidikan dan
Kebudayaan yang telah memberi kesempatan kepada penulis untuk melanjutkan
pendidikan pada jenjang magister ini melalui program Beasiswa Pendidikan
Pascasarjana. Penghargaan juga penulis sampaikan kepada Dekan dan Kepala
Laboratorium Patologi FKH Unsyiah. Disamping itu terimakasih kepada Drh. Mawar
Subangkit, Bapak Sholeh, Bapak Kasnadi, Bapak Endang, Mba Kiki, Mba Yanti dan
seluruh staf Bagian Patologi serta Pegawai Bagian Mikrobiologi FKH IPB. Terimakasih
juga kepada Drh. Soedirun, Drh. Tri, Drh. Rinto, Drh. Aprijal Panus, Mas Dani dan Mas
Eka di Laboratorium Patologi Balai Veteriner Subang dan teman-teman mayor IBH 2012.
Teristimewa karya ini penulis persembahkan untuk seluruh keluarga tercinta, tanpa
kasih sayang, do’a, keikhlasan dan motivasi yang tulus tidak mungkin perjalan panjang
dengan penuh suka dan duka ini bisa penulis selesaikan.
Akhirnya hanya Allah subhanahu wa ta’ala pemilik segala kesempurnaan, segala
kekurangan dalam penulisan ini hanyalah kekhilafan penulis, kritik dan saran ke arah
yang lebih baik sangat penulis harapkan dan semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2015

Etriwati

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN

iv
v
vi

1. PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
3
3

2. TINJAUAN PUSTAKA
Newcasle Disease
Gejala Klinis
Patogenesis
Penularan
Diagnosis
Perubahan Patologi Anatomi dan Histopatologi
Imunohistokimia Sebagai Alat Diagnosis Penyakit ND
Pewarnaan Imunohistokimia (IHK)

3
3
5
6
7
7
8
9
10

3. METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu
Alat dan Bahan
Materi
Data Anamnesis dan Patologi Anatomi
Pembuatan Blok Parafin
Pewarnaan Hematoksilin dan Eosin
Pewarnaan Imunohistokimia
Analisis Data

11
11
11
12
12
12
13
13
14

4. HASIL DAN PEMBAHASAN
Organ Respirasi
Organ Sirkulasi
Organ Digesti
Organ Urinari
Organ Limforetikuler
Organ Syaraf

14
15
20
23
35
37
41

5. SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

45
45
45

DAFTAR PUSTAKA

45

LAMPIRAN

51

RIWAYAT HIDUP

53

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Newcastle Disease (ND) merupakan penyakit unggas yang sangat penting di
Indonesia, karena telah menyebar di seluruh Indonesia dan menimbulkan kerugian
besar. Secara signifikan ND menimbulkan kerugian yang sangat besar bagi industri
perunggasan karena memiliki tingkat morbiditas dan mortalitas yang tinggi serta
waktu penyebarannya yang sangat cepat, baik pada ayam broiler, ayam buras
maupun jenis unggas lainnya. Mortalitas maupun morbiditas infeksi virus
Newcastle Disease (VND) dapat mencapai 100 %, VND telah menginfeksi lebih
dari 200 spesies unggas, virulensinya tergantung pada induk semang dan strain
virus yang menyerang (OIE 2012).
Newcastle Disease disebabkan Avian Paramyxovirus type-1 (APMV-1),
genus Avulavirus, merupakan virus Ribo Nucleic Acid (RNA) yang memiliki genom
serat tunggal (single stranded/ss) dan berpolaritas negatif. Famili Paramyxoviridae
berbentuk pleomorfik, biasanya memiliki morfologi bulat dengan diameter 100-500
nm, namun ada pula yang memiliki morfologi filamen dan beramplop (Alexander
dan Senne 2008). Gejala klinis dan tingkat keganasan yang disebabkan oleh VND
berbeda-beda pada unggas (Alexander 2001).
Berdasarkan tingkat keganasannya, virus ini terbagi menjadi empat golongan
yaitu velogenik viserotropik (tipe Asia) ditandai dengan infeksi letal akut dengan
lesi hemoragi pada intestinal, velogenik neurotropik (tipe Amerika) ditandai dengan
lesi saluran respirasi dan syaraf tetapi tidak ada lesi pada intestinal dengan
mortalitas tinggi, mesogenik (misalnya kumarov, mukteswar, roikin) ditandai
dengan lesi saluran respirasi dan syaraf dengan mortalitas rendah dan lentogenik
(misalnya La Sota, B1, F) ditandai dengan lesi bersifat asimptomatis pada usus
(Alexander dan Senne 2008; Miller et al. 2010). Sejak tahun 1950, penggunaan
vaksin aktif pada unggas peliharaan telah dilakukan untuk menurunkan kejadian
penyakit dan kerugian ekonomi akibat ND, namun ND tetap menjadi masalah yang
serius pada industri perunggasan (Czegledi et al. 2006; Liu et al. 2007). Selama
periode 2000 sampai 2009 di Eropa, VND virulen dari ayam telah dideteksi dari
unggas liar dan merpati peliharaan (Alexander 2011). Selama 40 tahun terakhir
perjalanan ND di Asia dan Afrika tetap endemik pada unggas komersial, meskipun
telah dilakukan vaksinasi intensif (Alexander et al. 2012).
Pada tahun 1927 penyebaran ND terjadi di Newcastle-Upon-Tyne, Inggris
menyebabkan angka mortalitas unggas yang terkena lebih dari 90 %. Penyebaran
selanjutnya terjadi di Timur Tengah tahun 1960 sampai tahun 1970 terutama
menyerang merpati (Alexander dan Senne 2008; Quinn et al. 2011). Sejak
ditemukannya VND tahun 1926 sembilan genotipe virus dari kelas satu dan sepuluh
dari kelas dua telah diidentifikasi, munculnya genotipe varian baru dari epizootik
global dan perubahan sekuens genomik virulensi VND rendah dan tinggi secara
tidak langsung menimbulkan opini telah terjadi perubahan virulensi VND serentak
pada daerah yang berbeda di dunia (Miller et al. 2010).
Wabah VND di Indonesia pertama terjadi di Jawa, pada tahun 1926
(Alexander dan Senne 2008). Sejak terjadi wabah sampai saat ini telah dilakukan

2
pengendalian penyakit dengan program vaksinasi, akan tetapi sampai saat ini
Indonesia masih menjadi daerah endemik VND, bahkan sirkulasi virusnya dapat
dideteksi sepanjang tahun. Berdasarkan data lapangan tahun 2008-2011
menunjukkan bahwa serangan penyakit ND selalu menempati rangking 10 besar
yang menyerang semua umur ayam, dimana peningkatan kasus terbesar terjadi
tahun 2011 dibanding tahun sebelumnya, kejadian penyakit merata di Sumatra,
Jawa, Bali, Kalimantan maupun Sulawesi (Anonimus 2012). Pada tahun 2007
sekitar 1.500-8.000 ekor ayam terinfeksi ND tiap bulannya di Bali-Indonesia (OIE
2009). Wabah ND pada tahun 2009 dan tahun 2010 pada ayam komersial
menyebabkan mortalitalitas 70-80 % (Xiao et al. 2012).
Beberapa laporan menyebutkan bahwa strain virus yang beredar di Indonesia
saat ini telah mengalami perubahan dari segi genetik. Hasil analisis filogenetik virus
ND isolat lapang di Indonesia termasuk genotipe VII kelas 2 serta secara genetik
berbeda dengan virus vaksin (Dharmayanti et al. 2014). Sedangkan diagnosis yang
ditetapkan selama ini oleh Patologist di lapangan dalam menentukan arah penyakit
masih mengacu pada perubahan patognomonis penyakit ND dan lesi-lesi yang
selama ini dilaporkan. Lesi patognomonis pada penyakit ND ditandai dengan
petechiae pada proventikulus, ventrikulus, usus, seka tonsil, trakhea dan paru-paru
(Kencana dan Kardena 2011); Airsacculitis, trakheitis, nekrotik dan petechiae pada
proventrikulus dan submukosa gizzard, nekrotik dan hemoragi usus, enteritis parah
di duodenum, sekum dan hemoragi di proventrikulus, lesi pada usus terutama
terjadi pada bentuk ND tipe viserotropik (Jordan 1990); Velogenik viserotropik
Newcastle Disease menimbulkan hiperemi dan bengkak pada konjungtiva, nekrosis
multifokal pada limpa, hemoragi pada mukosa proventrikulus, duodenum, seka
tonsil, atrofi bursa Fabricious dan timus (Nakamura et al. 2010); Lesi pada otak
selalu teramati pada ayam-ayam yang terinfeksi dengan tipe velogenik neurotropik
walaupun kadang juga ditemukan pada tipe viserotropik dan mesogenik (Bhaiyat et
al. 1994). Oleh karena itu studi khusus tentang distribusi antigen sangat perlu
dilakukan untuk melihat keberadaan VND di dalam jaringan guna menjelaskan
patogenesa penyakit ND yang tepat pada kasus lapangan.

Perumusan Masalah
Merebaknya kembali wabah ND pada ayam sejak tahun 2009 sampai saat ini
mengindikasikan bahwa usaha dalam melakukan protektif selama ini belum
menghentikan penyebaran VND secara maksimal di lapangan. Meskipun demikian,
pola distribusi VND pada organ dari kasus-kasus lapangan saat ini belum diketahui.
Sehingga perlu dilakukan penelitian tentang distribusi VND pada kasus lapang
dengan pewarnaan imunohistokimia. Salah satu alternatif cara peneguhan diagnosis
ND pada berbagai jenis inang yang rentan adalah uji imunohistokimia.
Imunohistokimia (IHK) merupakan metode identifikasi protein/antigen dalam
jaringan yang dipotong dengan menggunakan antibodi spesifik (Vara 2005). Uji
imunohistokimia dapat melacak distribusi virus pada berbagai organ sehingga dapat
dipakai untuk mengetahui patogenesis infeksi VND dan uji IHK relatif aman karena
dilakukan pada organ yang telah difiksasi dengan formalin. Menurut Rao et al.
(2010) imunohistokimia sebagai alat diagnosis telah digunakan untuk studi
patogenesis dan patologi dari ND pada berbagai spesies unggas dan jaringan.

3

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengetahui pola distribusi VND pada organ interna
ayam dari kasus-kasus lapangan yang meliputi organ trakhea, paru-paru, jantung,
proventrikulus, duodenum, seka tonsil, hati, pankreas, ginjal, limpa, bursa
Fabricious dan otak melalui pewarnaan imunohistokimia.

Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah:
1. Memberikan informasi tentang pola distribusi VND pada organ interna
ayam dari kasus-kasus lapangan.
2. Menentukan tingkat keganasan VND pada ayam dari kasus-kasus lapangan.
3. Menambah informasi tentang efektivitas vaksinasi ND di lapangan.

1 TINJAUAN PUSTAKA
Newcastle Disease
Newcastle disease (ND) biasa disebut juga sebagai Pseudo-Fowl Pest,
Pseudovogel-Pest, Atypische Gefugelpest, Pseudo-Poultry Plague, Avian Pest,
Avian Distemper, Ranilchet Disease, Tetelo Disease, Korean Fowl Plague, dan
Avian Pneumoencephalitis (Alexander dan Senne 2008). Newcastle disease
disebabkan oleh strain virulent dari avian paramyxovirus type 1(APMV-1) genus
avulavirus, famili paramyxoviridae (OIE 2012).
Virus Newcastle disease memiliki satu serotipe dan terdiri dari dua kelas.
Genom virus kelas satu terdiri dari 15.198 nukleotida dan genom virus kelas dua
terdiri dari 15.156 atau 15.192 nukleotida (Czegledi et al. 2006). Genom VND
membawa sandi untuk enam protein virus yaitu: protein L, protein HN
(Hemaglutinin Neuraminidase), protein F (protein Fusi), protein NP (Protein
Nukleokapsid), protein P (Fosfoprotein), dan protein M (Matrik) (Miller et al.
2010). Virus Newcastle disease memiliki dua membran glikoprotein yaitu
hemaglutinin neuramidase (HN) dan fusion (F), Glikoprotein HN terdapat pada
permukaan sel yang mengandung sialic acid yang merespon aktivitas hemaglutinasi
dan neuramidase yang memungkinkan pencegahan agregasi virus progeni dan
glikoprotein F menyebabkan fusi diantara sel-sel terinfeksi (Zee 1999). Sifat-sifat
fisik VND yaitu: mempunyai kemampuan untuk mengaglutinasi dan melisiskan
eritrosit ayam, diinaktifkan pada temperatur 56 0C/3 jam atau 60 0C/30 menit pada
pH ≤2 dan pada suhu diatas 1-2 oC virus dilaporkan masih bertahan dikulit ayam
selama 60 hari dan dalam sumsum tulang bertahan hingga 200 hari (OIE 2012).

Gambar 1 Penampang VND (ViralZona 2010)

2
Berdasarkan virulensinya, VND dikelompokkan menjadi tiga patotipe yaitu:
lentogenik adalah strain virus yang kurang virulen, mesogenik merupakan strain
virus dengan virulensi sedang dan velogenik adalah strain virus dengan virulensi
ganas. Strain velogenik dibedakan lagi menjadi bentuk neurotrofik dengan gejala
gangguan syaraf disertai kelainan pada sistem pernafasan, dan bentuk viserotrofik
yang ditandai dengan kelainan pada sistem pencernaan (Aldous dan Alexander
2001). Australia, Selandia Baru, Kanada, Amerika Serikat, Jerman dan beberapa
negara Eropa, penyakit ND disebabkan oleh virus lentogenik bukan velogenik
(Spradbrow 1992).
Newcastle disease pertama kali dilaporkan tahun 1926 di Newcastle, Upon
Tyne, Inggris dan di pulau Jawa, Indonesia kemudian menyebar dengan cepat di
Asia. Panzootik pertama terjadi tahun 1970 di Asia Tenggara dan panzootik kedua
terjadi diakhir tahun 1960 menyebar ke seluruh dunia, pengaruh panzootik yang
hebat tidak dapat diperkirakan seperti di Great Britain, 43 wabah terjadi tahun 1.969,
3.328 wabah tahun 1970 dan 4.217 wabah tahun 1971 sebelum dilakukan vaksin
hidup untuk mencegah penyakit (Alexander 2001).
Wabah ND pada unggas selama periode 1986 sampai 1993 terjadi di negaranegara Eropa, total lima kasus terjadi tahun 1986 dan berfluktuasi mencapai 134
kasus tahun 1993 (Alexander 2011). Wabah ND di Inggris menyebabkan angka
kematian unggas yang terkena lebih dari 90 %. Wabah ND terbaru di California,
Nevada dan Texas, Amerika Serikat menyerang lebih dari 3,4 juta ekor unggas dan
memerlukan biaya lebih dari US $ 5 Milyar untuk pengendalian penyakit (Brown
et al. 1999). Wabah di Ireland tahun 1990 secara genetik dan antigenik sangat
berbeda dari semua virus virulen yang ada, tetapi genetiknya dekat dengan virus
virulensi rendah yang diisolasi dari unggas air yang tergolong virus kelas I
(Alexander et al. 2012). Sampel dari unggas liar dan peliharaan yang dikoleksi
antara 2006-2010 di Luxembourg telah dianalisis terhadap VND, ditemukan strain
genotipe I avirulen pada unggas air mirip dengan strain yang bersirkulasi pada ayam
liar di Finlandia menunjukkan bahwa virus tersebut merupakan strain avirulen yang
khas pada unggas liar di Eropa dan tiga sampel strain PPMV-1 virulen ditemukan
pada merpati (Snoeck et al. 2013).
Wabah ND di Afrika Selatan menyebabkan mortalitas yang tinggi pada ayam
ditandai dengan gejala-gejala pernafasan, syaraf dan pencernaan. Wabah ND di
Amerika Serikat ditandai dengan gejala-gejala pernafasan ringan dan syaraf yang
dikenal dengan pneumoencephalitis (Bwala 2009). Australia dinyatakan bebas dari
VND lebih dari enampuluh tahun sampai muncul wabah oleh strain virulen tahun
1998 yang merupakan hasil dari mutasi virus virulensi rendah (Alexander et al.
2012). Wabah tahun 1998 sampai 2002 lebih lanjut terjadi mutasi virus dari
lentogenik menjadi virus virulen yang berasal dari luar Australia (AUSVETPLAN
2010). Kejadian lain di Australia, pada beberapa tahun terakhir ini juga membuat
panik kalangan industri perunggasan, karena dampak secara ekonomi sangat tinggi.
Kerugian berupa kematian, pengendalian penyakit serta penghentian impor dari
negara-negara yang terserang wabah ND (Brown et al. 1999).
Selama periode 2008 sampai 2011 sebanyak 51 isolat ND diisolasi dari ayamayam di Asia secara genetik menunjukkan genetik VII tetap yang utama (Ebrahimi
et al. 2012). Newcastle disease bentuk velogenik viserotropik atau dikenal juga
dengan bentuk pencernaan, karena gejala-gejala utama terlihat pada saluran
pencernaan terjadi di Asia (Tabbu 2000). Analisis phylogenetic sebelumnya

3
menunjukkan bahwa genotipe VII dari VND tetap utama pada unggas di Asia dan
Eropa, terutama di daerah Timur Jauh, Eropa dan Afrika Selatan. Genotipe tersebut
telah dikelompokkan kedalam subgenotipe VIIa-VIIh, dimana VIIa-VIIe terutama
bersirkulasi di Cina, Malaysia, Kazakhstan dan Kyrgyzstan, sedangkan VIIf-VIIh
bersirkulasi di Afrika (Ebrahimi et al. 2012; Miller et al. 2010).
Virus ND di Indonesia sudah menyebar ke semua provinsi, kerugian ekonomi
yang diakibatnya pada ayam buras secara nasional rata-rata Rp. 340 milyar per
tahun. Pada umumnya serangan VND mulai meningkat awal musim hujan dan
mencapai puncaknya pada pertengahan musim tersebut, serta wabah biasanya
terjadi pada peralihan musim hujan ke musim kemarau (Sudardjat 1996). Virus ND
yang terdapat di Indonesia termasuk dalam patotipe velogenik viserotropik ND
yang merupakan virus ND paling virulen (Sardjono 1993). Wibowo et al. (2012)
melaporkan bahwa berdasarkan kecepatan elusi di antara 13 isolat virus ND
menunjukkan karakter virus virulen sebanyak 11 isolat sedangkan virus kurang
virulen dua isolat. Virus ND lapangan Indonesia 2009-2010 berbeda dengan virus
strain La Sota dalam 13 situs asam amino (Anonimus 2012).

Gejala Klinis
Gejala klinis ND bervariasi tergantung pada sifat dari virus yang menginfeksi,
dosis infeksi dan imunitas dari paparan sebelum atau vaksinasi (Alexander dan
Senne 2008). Tipe velogenik viserotropik menunjukkan gejala perakut seperti
penurunan produksi telur yang tajam, depresi, respirasi meningkat, diare profus
berwarna hijau, edema, sianosis, konjungtivitis dan mortalitas lebih dari 90 %.
Velogenik neurotropik, menunjukkan gejala syaraf seperti depresi, tremor,
tortikolis, batuk, paralisis sayap dan kaki, mortalitas pada ayam 20 %. Tipe
mesogenik, gejala yang tampak adalah depresi, penurunan berat badan, penurunan
produksi telur, gangguan respirasi akut, mortalitas 10 %. Tipe lentogenik,
umumnya bersifat subklinis dengan gejala gangguan penafasan ringan, produksi
telur menurun, tidak tampak gejala syaraf dan kematian kecuali disertai dengan
masuknya agen penyakit lain, misalnya E coli dan tipe avirulent yaitu bersifat
subklinis tanpa gejala infeksi (CFSPH 2008; Ghiamirad et al. 2010; OIE 2012).
Empat manifestasi klinis ND menurut Jordan (1990) diidentifikasikan
sebagai berikut:
1. Velogenic Viscerotropic ND (VVND): diawali dengan lesu, pernafasan
meningkat, lemah, jatuh dan akhirnya mati, kadang-kadang menyebabkan
oedema disekitar mata dan kepala, diare hijau, tremor otot, tortikolis,
paralisis sayap dan kaki, opistonus mungkin juga terlihat dan menyebabkan
mortalitas mencapai 100 %.
2. Neurotropic Velogenic ND (NVND): diawali dengan gangguan pernafasan,
satu atau dua hari kemudian diikuti gejala syaraf, produksi telur turun drastis,
biasanya diare tidak terlihat, morbiditas 100 % dengan mortalitas diatas
50 % pada ayam tua dan pada ayam muda 90 %.
3. Mesogenic ND: menyebabkan gangguan pernafasan pada ayam tua,
produksi telur turun, gejala syaraf mungkin muncul tetapi jarang, mortalitas
rendah kecuali pada ayam sangat rentan dan ayam muda.

4
4.

Lentogenic ND: jarang menyebabkan penyakit pada ayam tua, namun
pada ayam yang rentan dan ayam muda mungkin menunjukkan
gangguan pernafasan serius.

Patogenesis
Patogenisitas VND dipengaruhi oleh galur virus, rute infeksi, umur,
lingkungan, dan status kebal saat terinfeksi virus (Alexander 2007). Berdasarkan
spesies, ayam lebih rentan daripada bebek dan angsa, pada ayam muda infeksi lebih
akut daripada ayam tua, tidak ada pengaruh breed atau genetik terhadap kerentanan
ayam dan rute infeksi alami melalui nasal, oral dan okular dapat menimbulkan
penyakit pernafasan, sedangkan infeksi melalui intramuskular, intravena dan
intracerebral meningkatkan gejala syaraf (Alexander dan Sanne 2008; Jordan 1990).
Secara umum patogenesis dari infeksi virus famili paramyxoviridae diawali
dengan penyebaran virus dari ayam sakit ke ayam yang lain melalui aerosol. Virus
ditangkap di mukosa rongga hidung, difagosit makrofag lokal dan dieliminasi
keluar tubuh. Namun, apabila sistem kekebalan tubuh lemah atau virus bersifat
virulen maka selajutnya akan disebarkan oleh makrofag (leukocytic trafficking) ke
kelenjar pertahanan regional. Virus bereplikasi pada kelenjar pertahanan regional,
diikuti viremia primer. Setelah viremia primer, terjadi viremia sekunder dimana
virus disebarkan sistem limfoid mencapai sel-sel epitel dari mukosa pernafasan,
mukosa ginjal, saluran pencernaan dan sistem syaraf. Pada syaraf penyebaran
makrofag diawali dengan perivascular cuffing selanjutnya terjadi penyebaran lokal
pada astrosit dan sel migrolial. Mediator inflamasi dilepaskan dari limfosit, sel-sel
mikroglial dan trafficking makrofag yang akhirnya menginisiasi lesi pada organ
(Zachary 2007).
Patogenisitas VND terjadi ketika sakit, ayam mengeluarkan virus dalam
jumlah besar melalui feses (Alexander 2001). Replikasi virus diawali pada lapisan
epitel saluran pernafasan, pencernaan dan sistem syaraf pusat. Masa inkubasi dan
gejala klinis penyakit ND pada ayam bervariasi, tergantung pada strain virus dan
status kebal ayam saat terinfeksi. Pada infeksi virus strain lentogenik, penyakit
bersifat subklinis atau ditandai dengan gangguan respirasi yang bersifat ringan
seperti bersin dan keluar leleran dari hidung. Infeksi virus strain mesogenik bersifat
akut ditandai dengan gangguan respirasi dan kelainan syaraf (Zee 1999). Replikasi
virus berlangsung di dalam sitoplasma sel inang, penyebarannya melalui inhalasi
dan ingesti, masa inkubasi penyakit ini antara 2-15 hari, rata-rata 2-6 hari (OIE
2009).
Pada mulanya virus bereplikasi pada epitel mukosa dari saluran pernafasan
bagian atas dan saluran pencernaan, segera setelah infeksi virus menyebar lewat
aliran darah ke ginjal dan sumsum tulang yang menyebabkan viremia sekunder.
Viremia sekunder menyebabkan infeksi pada organ-organ lain seperti paru, usus
dan sistem syaraf pusat. Kesulitan bernafas dan sesak nafas timbul akibat
penyumbatan bronchiolus pada paru-paru dan kerusakan pada pusat pernafasan di
otak (Fenner et al. 1993; Zee 1999).
Pertumbuhan virus ND virulen dapat merusak sel-sel epitel, makrofag,
fibroblast, endotel dan akhirnya menyebar ke seluruh embrio dan menyebabkan
kematian embrio (Wibowo et al. 2012). Bouzari dan Spardbrow (2006) melaporkan

5
bahwa replikasi VND setelah diinfeksi virus V4 secara oral pada ayam berumur 3
minggu menunjukkan hasil bahwa virus dapat diisolasi 24 jam pasca inokulasi dari
esofagus, tembolok dan trakhea.
Penularan
Penularan VND dapat terjadi secara langsung antar ayam dalam satu
kelompok ternak tertular biasanya berasal dari ekskreta ayam terinfeksi baik
melalui pakan, air minum, lendir, feses, maupun udara yang tercemar virus,
peralatan dan pekerja kandang (Tabbu 2000).
Penularan virus dari ayam terinfeksi tergantung pada tempat bereplikasi virus.
Ayam yang menunjukkan gejala pernafasan akan mengeluarkan virus yang berasal
cairan mukus dan menginfeksi ayam lain melalui inhalasi. Virus ND yang
bereplikasi dalam saluran pencernaan akan mengeluarkan virus melalui feses. Anak
ayam yang baru menetas dapat tertular dari cangkang telur yang terkontaminasi feses
yang mengandung VND (OIE 2009)
Diagnosis
Diagnosis ND mungkin saja dilakukan berdasarkan gejala klinis atau
perubahan makroskopis post-mortem, akan tetapi diagnosis definitif tidak akurat
karena kemiripan dengan penyakit unggas lainnya. Diagnosa banding ND adalah
fowl kolera, highly pathogenic avian influenza (HPAI), laringotrakheitis akut, fowl
pox bentuk dipteritik, mikoplasmosis, infeksius bronkhitis, aspergillosis dan
manajemen kandang yang tidak baik (Capua dan Terregino 2009).
Isolasi dan identifikasi patotipe virus dapat dilakukan dengan uji mean death
time (MDT), intravenous pathogenicity index (IVPI) dan intracerebral
pathogenecity index (ICPI), reverse-trancription polymerase chain reaction (RTPCR) dan sekuensing pada tempat pembelahan, peningkatan titer pada pengujian
serologi haemagglution inhibition test (HI) atau enzyme linked immunoasorbent
assay (ELISA) (Alders dan Spradbrow 2001; Alexander dan Senne 2008). Teknik
pewarnaan imunohistokimia (IHK) juga dapat digunakan untuk melihat profil
antigenik isolat VND (Rao et al. 2010).
Perubahan Patologi Anatomi dan Histopatologi
Perubahan makroskopis pada saluran pencernaan meliputi hemoragi pada
proventrikulus, duodenum dan seka tonsil (Gambar 2) (Capua dan Terregino 2009).
Bagian yang mendapat perhatian adalah seka tonsil, dimana terdapat nekrosis
apabila dibuka dan perubahan hiperemi di sebagian besar organ terutama otak. Lesi
mikroskopik utama ND adalah nonpurulen ensefalomyelitis, vaskulitis, nekrosis
limfoid (bursa, limpa, timus dan jaringan limfoid mukosa usus), trakheitis,
pneumonia, salfingitis, nekrosis hati, pankreatitis dan konjungtivitis. Beberapa
kajian melaporkan tentang pembentukan ensefalomalasia dan pankreatitis nekrotik
pada ND (Zee 1999; Tabbu 2000). Pada usus halus lesi nekrotik hemoragi bersifat
multifokal, secara histopatologi terlihat nekrosis fokal maupun difus serta infiltrasi
sel-sel mononuklear pada jaringan limpa, hati, ginjal, paru-paru, usus, sekum,
proventrikulus dan otak (Oladele et al. 2008). Meskipun tidak ada lesi

6
patognomonik, hemoragi pada intestinal bisa digunakan untuk membedakan
velogenik viserotropik ND dengan velogenik neurotropik ND (Alexander 2001).
Akoso (1998) menyatakan pada kasus Newcastle disease hasil bedah bangkai
memperlihatkan gejala khas, seperti adanya petechiae pada proventrikulus,
perubahan pada lapisan usus berupa hemoragi dan nekrosa, pada organ pernafasan
akan terjadi eksudasi dan kantung udara menebal. Menurut Tabbu (2000)
perubahan makroskopik yang ditemukan biasanya erat hubungan dengan galur tipe
patologik dari virus ND, pada VVND tersifat oleh adanya nekrosis dan hemoragik
pada saluran pencernaan, meliputi proventrikulus, ventrikulus dan berbagai bagian
usus, dimana lesi tersebut dapat dipakai untuk membedakan VVND dengan NVND.
Velogenik viserotropik ND menimbulkan merah dan bengkak pada konjungtiva,
nekrosis multifokal pada limpa, hemoragi pada mukosa proventrikulus, duodenum,
seka tonsil, atrofi bursa Fabricious dan timus (Nakamura et al. 2010).

Gambar 2 Pendarahan pada mukosa proventrikulus, usus dan seka tonsil (Capua
dan Terregino 2009)
Perubahan patologi anatomi pada ayam yang tidak divaksin tapi ditantang
dengan virus lapang (virus ND velogenik isolat lokal (VND/Tasik/M13/2009 secara
intramuskular) pada hari ke-5 hingga hari ke-6 paska uji tantang terlihat bahwa
semua sampel ayam ditemukan perdarahan yang meluas di proventrikulus dan di
organ usus halus ditemukan fokus nekrotik-hemoragika. Pada pemeriksaan
histopatologi, lumen kelenjar proventrikulus terlihat membesar dan berisi sel-sel
runtuhan, adanya hiperemi hingga hemoragi, nekrosis parah, edema serta endotel
yang rusak (Nuryanto 2012).
Adi et al. (2010) melaporkan bahwa ayam terserang ND ketika wabah di Bali
menunjukkan atrofi pada organ-organ limfoid seperti bursa Fabricious, timus dan
limpa; hemoragi intestinal dan edema pada otak. Pemeriksaan histopatologi
menunjukkan meningoensefalomyelitis nonsuppuratif ditandai dengan nekrosis
neuron, gliosis multifokal sampai difus dan perivascular cuffing dari sel-sel
mononuklear, nekrosis hemoragik pada trakhea dan usus serta deplesi dan nekrosis
pada jaringan limfoid termasuk bursa Fabricious.

7
Perubahan pada proventrikulus tiga hari paska infeksi menunjukkan infiltrasi
limfositik pada jaringan limfoid, pemendekan papila proventrikulus dan infiltrasi
difus dari limfosit di mukosa. Pada hari ke-7 paska infeksi terlihat infiltrasi
limfositik pada folikel limfoid dan pemendekan papilla proventrikulus. Sedangkan
perubahan pada usus pada hari ke-3 dan ke-7 paska infeksi pada duodenum teramati
deskuamasi vili usus (Mohammadamin dan Qubih 2011).
Ayam broiler sebanyak 39 ekor berumur 4-5 minggu yang dikoleksi pada
wabah strain mesogenik ND di Jepang memperlihatkan perubahan patologi anatomi
seperti hemoragi pada paru-paru, kongesti pada trakhea, splenomegali, atrofi timus
dan bursa Fabricious, otak bewarna keputih-putihan. Secara mikroskopis terlihat
pneumonia hemoragi ringan, trakheitis kataral, nekrosis folikel limfoid pada limpa,
timus, bursa Fabricious dan sekum serta ensefalitis nonsuppuratif. Lesi ensefalitis
ditandai dengan perivascular cuffing multifokal, malasia, demyelinasi dan
vaskulitis proliferatif (Bhaiyat et al. 1994).
Imunohistokimia Sebagai Alat Diagnosis Penyakit ND
Prinsip dari metode histokimia adalah perpaduan antara reaksi imunologi dan
kimiawi, dimana reaksi imunologi ditandai adanya reaksi antara antigen dengan
antibodi, dan reaksi kimiawi ditandai dengan adanya reaksi antara enzim dengan
substrat. Pada reaksi imunohistokimia ini sifatnya adalah spesifik karena bahan
yang dideteksi akan direaksikan dengan antibodi spesifik yang dilabel dengan suatu
enzim. Enzim yang digunakan untuk melabel antibodi tersebut dapat berupa enzim:
peroksidase, alkali fosfatase dan β-galaktosidase (Vara 2005). Kata
imunohistokimia diambil dari istilah immune yang merujuk kepada antibodi dan
histo merujuk kepada jaringan (Wikipedia 2013). Imunohistokimia menjadi alat
yang penting untuk mengetahui diagnosis histopatologi dan penelitian penyakit
infeksius (Kammerer et al. 2001; Vara 2005; Wikipedia 2013). Sistem
imunodeteksi termasuk direct horseradish peroksidase (HRP), Peroxidase-antiperoxidase (PAP), avidin-biotin complex (ABC) dan alkaline phosphatase-antialkaline phosphatase (APAAP) (Bwala 2009).
Penggunaan antibodi monoklonal lebih akurat dalam IHK dibandingkan
antibodi poliklonal karena spesifisitasnya tinggi, karena tidak ada hasil reaksi silang
dan positif palsu (Haines dan Chelack 1991). Antibodi monoklonal memiliki
spesifik yang tinggi karena antibodi hanya melekat pada epitop tunggal antigen,
sedangkan antibodi poliklonal terdiri dari antibodi-antibodi yang mengikat antigen
tidak spesifik (Vara 2005).
Pewarnaan Imunohistokimia (IHK)
Secara imunohistokimia antigen virus ND terdeteksi pada lesi di berbagai
organ terutama di sitoplasma dan jarang dalam inti sel, dilaporkan pada beberapa
kajian terdahulu yang dihimpun pada (Tabel 1).

8

Tabel 1 Rangkuman kajian distribusi antigen VND
No
Organ tempat antigen virus ND terdeteksi
1
Sel limforetikuler dan seka tonsil
2
Limpa dan paru-paru
3
Otak, trakhea, kantung udara, paru-paru,
pankreas, duodenum, proventrikulus, bursa
Fabricious, ginjal dan jantung
4
Folikel limfoid bursa Fabricious
5
Paru-paru, limpa, jantung dan membran
khorioalantoik
6
Otak
7
Otak,
trakhea,
paru-paru,
duodenum,
proventrikulus, hati, limpa dan bursa Fabricious
8
Trakhea dan paru-paru
9
Usus halus, ginjal, paru-paru dan otak
10 Limpa, bursa Fabricious dan timus

Pustaka
Hamid et al. 2007
Wakamatsu et al. 2007
Nakamura et al. 2008

Adi et al. 2010
Al-garib et al. 2010
Ecco et al. 2011
Adi et al. 2012
Kim et al. 2012
Nuryanto 2012
Anis et al. 2013

Antigen virus ND dapat diobservasi pada serebrum, serebelum dan medulla
oblongata yang mengalami degenerasi, nekrosis dan gliosis; pada sel-sel asinar
pankreas yang mengalami degenerasi, nekrotik dan deplesi; didalam makrofag pada
lapisan dan dinding arteri paru-paru yang mengalami kongesti; pada lapisan sel-sel
mesotelial epikardium; pada lapisan muskulus duodenum; pada otot esofagus yang
mengalami nekrosis, deskuamasi dan erosi; pada folikel limfoid nekrotik pada bursa
Fabricious; pada sel-sel epitel kantung udara; pada sel-sel epitel ginjal nekrosis;
jaringan limfoid nekrotik di lamina propria usus; serta syaraf perifer pada lapisan
otot usus dan proventrikulus, atau dalam jaringan ikat di sekitar trakhea tanpa
disertai lesi histologis yang signifikan. Antigen virus ND terlihat juga pada sel-sel
epitel skuamosa esofagus berdekatan dengan proventrikulus (Nakamura et al. 2008).
Virulensi, sifat dan distribusi lesi dievaluasi dari sistem syaraf pusat ayamayam yang diinokulasi dengan 10 isolat virus ND berbeda seperti; CA 1083, Korea
97-147, Australia (velogenik viscerotropik), Texas GB dan Turkey North Dakota
(velogenik neurotropik), Nevada cormorant, Anhinga dan Roakin (mesogenik) dan
B1 dan QV4 (lentogenik) menunjukkan bahwa ayam yang diinfeksi dengan strain
Australia, Roakin, B1 dan QV4, menunjukkan tidak ada ensefalitis atau secara IHK
tidak terdeteksi nukleoprotein pada otak. Dua stain yang menyebabkan kematian 5
hari setelah infeksi (CA 1083 dan Korea 97-147), strain velogenik neurotropik dan
beberapa strain mesogenik menunjukkan adanya inflamasi multifokal dan secara
IHK virus terdeteksi di dalam sitoplasma syaraf, beberapa sel-sel glial dan jarang
pada sel-sel endothelial otak (Ecco et al. 2011). Nakamura et al. (2008) melaporkan
bahwa ayam yang diinfeksi dengan virus VVND (APMV1/chiken/Japan/fukuoka11/2004) terdeteksi VND secara IHK di syaraf tepi.
Pemeriksaan imunohistokimia pada ayam yang tidak divaksin tapi ditantang
dengan virus lapang (virus ND velogenik isolat lokal (VND/Tasik/M13/2009 secara
intramuskular) hari ke-3 paska infeksi, antigen VND dapat terdeteksi di beberapa
organ yaitu: usus halus, ginjal, paru-paru dan otak. Pada usus halus antigen
terwarnai dan terlihat jelas terutama di kripta, Peyer patches dan tunika muskularis

9
(Nuryanto 2012). Virus ND positif ditemukan 96 jam paska diinokulasi dengan
VND virulen pada organ paru-paru, limpa, jantung dan membran khorioallantoik
telur ayam berembrio umur 14 hari (Al-garib et al. 2010).
Lokasi antigen VND yang diinfeksi melalui oro-nasal dengan strain
lentogenik (V4) dengan tekhnik immunoperoksidase dengan menggunakan agent
virus homolog, antigen ditemukan di sitoplasma sel limphoretikuler, menetap
selama 28 hari di seka tonsil, sel-sel positif tidak terlihat pada bursa dan otak
(Hamid et al. 1990).

1 METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi
dan Patologi dan Bagian Mikrobiologi Medik, Departemen Ilmu Penyakit Hewan
dan Kesmavet Fakultas Kedokteran Hewan IPB, serta di Laboratorium Patologi
Balai Veteriner Subang yang berlangsung dari bulan November 2013 sampai Juni
2014.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat nekropsi, botol spesimen,
gelas ukur, tissue cassette, automatic tissue processor, paraffin embedding console,
mikrotom, gelas sediaan, gelas penutup, staining system, inkubator, mikroskop
cahaya, alat digital photomicrograph, glove, microtube, microwave, humidity
chamber, mikropipet, tips dan vortek.
Bahan penelitian terdiri dari larutan etanol bertingkat 70 %, 80 %, 90 %, 96
% dan absolut etanol, paraffin, silol, hidrogen peroksida 0,3 % dalam methanol
(Merck), rabbit anti-NDV HN protein Polyclonal Antibody, Cy7 conjugated
(Bioss#bs-4529R, North America), kit imunohistokimia (Dako REAL™, North
America), Mayer’s hematoxylin (Sigma#2 CS 401-1D), eosin (Fisher Scientific),
entelan (Merck, Art. 1691), Poly-L-lysine coating slide (Sigma P4707), entellan
(Merck, Art. 1691), larutan phosphat buffer saline (PBS) (Fisher Scientific),
aquades dan brain heart infusion (BHI).
Materi
Materi penelitian adalah organ interna untuk pemeriksaan histopatologi dan
hasil usap orofaring dan kloaka yang disimpan dalam media transport BHI untuk
uji rRT-PCR. Sebanyak 10 kasus lapang dikumpulkan dari ayam broiler, layer dan
buras. Seluruh sampel berasal dari daerah Jawa Barat yang dikirim ke Bagian
Patologi FKH IPB. Sampel dipilih berdasarkan pemeriksaan klinis dan temuan
perubahan patologi anatomi hasil diagnosis Patologist bagian Patologi, FKH IPB
sebagai suspect ND dan selanjutnya dikonfirmasi positif ND dengan uji rRT-PCR
di bagian Mikrobiologi FKH IPB. Sampel berupa organ-organ: trakhea, paru-paru,
jantung, proventrikulus, duodenum, seka tonsil, hati, pankreas, ginjal, limpa, bursa
Fabricious dan otak. Semua sampel organ-organ tersebut dipotong 1 x 1 x 0,5 cm
dan difiksasi dalam larutan neutral buffered formalin (NBF) 10 % selama minimal
24 jam dan dibuat sediaan histopatologi dalam paraffin blok (Mohammadamin dan
Qubih 2011). Alur penelitian disajikan pada gambar 3 di bawah ini.

2

Kadaver Ayam
Pemeriksaan
Klinis

Pemeriksaan PA

Usap Orofaring
dan Kloaka

Analisis Data
(HE, IHK)

Diduga ND

Uji rRT-PCR

Histopatologi
(HE, IHK)

Koleksi Organ
(BNF 10%)

Positif

Gambar 1 Alur Penelitian

Data Anamnesis dan Patologi Anatomi
Data anamnesis meliputi pengamatan klinis, pencatatan sejarah penyakit,
jumlah ayam yang sakit, jumlah ayam yang mati, jenis, ras dan umur ayam.
Gambaran patologi anatomi diamati dan dicatat terhadap semua kelainan yang
tampak pada masing-masing organ tersebut meliputi perubahan warna, bentuk,
konsistensi, degenerasi dan nekrosis, gangguan sirkulasi, peradangan dan eksudasi.
Untuk melihat derajat lesi patologi anatomi pada masing-masing organ dilakukan
dengan melihat sebaran lesi fokal dengan derajat ringan, multifokal dengan derajat
sedang dan difus dengan derajat berat.
Pembuatan Blok Parafin
Potongan (trimming) masing-masing organ setebal 5 mm dimasukkan ke
dalam tissue cassette, kemudian dimasukkan ke dalam automatic tissue processor
untuk dilakukan; Dehidrasi menggunakan etanol bertingkat 70 %, 80 %, 90 %, 96
% dan etanol absolut tiga kali ulangan. Clearing dengan silol dua kali ulangan.
Infiltrasi oleh paraffin dua kali ulangan. Seluruh proses tersebut membutuhkan
waktu 24 jam. Selanjutnya dilakukan embedding pada alat paraffin embedding
console dengan memindahkan jaringan dalam cassette ke dalam cetakan yang berisi
paraffin. Blok paraffin disayat setebal 5 µm dengan rotary microtome. Sayatan
jaringan diapungkan pada akuades dalam waterbath 45 0C dan dilekatkan pada
gelas sediaan berperekat poly-L-Lysine 1 %. Sayatan jaringan yang telah dilekatkan
pada gelas sediaan, dimasukkan ke dalam inkubator selama 1 malam dengan suhu
50-60 0C untuk kemudian dilakukan pewarnaan HE dan IHK.
Pewarnaan Hematoksilin dan Eosin
Potongan jaringan yang telah dilekatkan pada gelas sediaan diwarnai dengan
hematoksilin dan eosin (HE) sesuai prosedur standar (Mohammadamin dan Qubih

3
2011). Prosedur pewarnaan HE adalah sebagai berikut; gelas sediaan yang berisi
sayatan organ dideparafinasi dan rehidrasi dengan merendamnya di dalam silol dua
kali ulangan masing-masing selama 2 menit dilanjutkan dengan etanol absolut dua
kali ulangan masing-masing selama 2 menit, etanol 96 % dan 80 % masing-masing
selama 1 menit dan dicuci dengan air mengalir selama 1 menit. Pewarnaan
dilakukan dengan merendam sediaan dalam pewarna Mayer's haematoxyllin selama
8 menit, dicuci dengan air mengalir selama 30 detik, dicuci dalam lithium carbonat
selama 30 detik dan air mengalir selama 2 menit. Pewarnaan dilanjutkan dengan
merendaman jaringan didalam eosin selama 3 menit dan dicuci dengan air mengalir
selama 60 detik. Selanjutnya dilakukan dehidrasi jaringan dengan etanol 96 % dan
et