12
c. Pembuatan Kurva Tumbuh, Pengukuran Aktivitas Enzim dan Aktivitas Spesifik Inokulum dibuat dengan tiga corkborrer kultur bakteri hasil peremajaan yang telah
diinkubasi selama 24 jamdiinokulasikan ke dalam 100 ml media cair susu skim 1 kemudian diinkubasi dalam shaker pada kecepatan 100 rpm dengan suhu 30
Cselama 24 jam.Volume inokulum yang dimasukkan ke dalam media kultur sebesar 1 ml 10
6
selml dan diinkubasi dalam shaker pada suhu 30
C dengan kecepatan 100 rpm. Setiap 6 jam sekali dilakukan pengukuran Optical Density OD menggunakan spektrofotometer dengan
panjang gelombang 620 nmdan pengukuran aktivitas enzim dengan menggunakan metode Kunits Walter 1984 Lampiran 4.Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford
1976. Pengukuran absorbans dilakukan pada panjang gelombang 595 nm Lampiran 6. Aktivitas spesifik dapat dihitung berdasarkan nilai aktivitas enzim yang diperoleh dibagi
dengan kadar proteinnya. d. Total Plate Count TPC
Pada isolat FLp1 dan FLp2 diambil sebanyak 0.1 ml dari masing-masing kultur cairnya,selanjutnya dilakukan pengenceran berseri 10
-1
sampai 10
-8
dengan NaCl fisiologis.Dari setiap pengencerandiambil 0.1 ml kemudian disebar ke dalam cawan petri
berisi media pada sususkim, diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Koloni yang tumbuhkemudian dihitung.
3.3.1.2 Karakterisasi Bahan Baku
Analisis proksimat dilakukan pada buah kopi yaitu bagian kulit kopi dan biji kopi yang meliputi kadar air, abu, lemak, protein dan serat kasar. Prosedur analisis disajikan pada Lampiran 2.
3.3.2. Penelitian Utama
3.3.2.1 Persiapan Substrat
Buah kopi yang sudah masak berwarna merah dipisahkan antara kulit dengan biji kopinya. Kulit kopi dikeringkan di bawah sinar matahari selama + 24 jam hingga kadar air + 14. Kemudian
kulit kopi dihaluskan menggunakanblender dan diayak dengan saringan 40 mesh.
3.3.2.2 Persiapan Inokulum
Isolat yang akan digunakan sebagai inokulum pada media fermentasi diremajakan terlebih dahulu.Isolat terpilih diremajakan dengan menggores pada media padat di cawan petri yaitu media
xilan untuk bakteri xilanolitik FLx3, media CMC untuk bakteri selulolitik FLs1 dan media NA dengan susu skim untuk bakteri proteolitik FLp1 kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 24
jam. Sebanyak dua corkborrer kulturbakteri hasil peremajaan diinokulasikan ke dalam media cair,
kemudian diinkubasi dalam shaker pada kecepatan 100 rpm dengan suhu 30 C dan 37
C selama 18 jam untuk bakteri selulolitik FLs1 dan bakteri proteolitik FLp1, sedangkan untuk bakteri
xilanolitik FLx3 selama 22 jam.
13
3.3.2.3Fermentasi
Biji kopi dan kulit kopi ditimbang sebanyak 30 g, kemudian ditambah dengan akuades steril sebanyak 10 ml. Semua bahan tersebut berada dalam botol, kemudian disterilisasi dengan autoklaf
selama 20 menit dengan suhu 121 C. Setelah itu, bahan kopi tersebut dibiarkan hingga dingin. Setiap
botol ditambah dengan starter sebanyak 10. Starter dicampur secara merata, kemudian botol ditutup kembali dan disimpan dalam inkubator pada suhu 30
C dan 37 C selama 4 hari. Terdapat tiga
perlakuan berbeda dalam penambahan inokulum, yaitu :
Perlakuan Jumlah inokulum
FLs1 FLp1
FLx3
Tunggal 3 ml
- -
Kombinasi 2 1.5 ml
1.5 ml -
Kombinasi 3 1 ml
1 ml 1 ml
3.3.2.4 Pengujian Cairan Hasil Fermentasi
Pengujian pada cairan hasil fermentasi bertujuan untuk mengetahui mekanisme kerja enzim dalam menghidrolisis kulit kopi yang menyebabkan terjadinya perubahan komposisi karbohidrat yaitu
gula total dan gula pereduksi, kadar protein, pengukuran aktivitas enzim dan susut bobot. Setiap 24 jam diambil sampel dari botol fermentasi untuk setiap suhu. Kemudian dilakukan
pengenceran dengan ditambahkan 100 ml akuades steril ke dalam masing-masing botol tersebut dan diaduk agar merata. Setelah itu dilakukan penyaringan dengan kertas saring untuk memisahkan
cairannya dengan kulit kopi dan biji kopi.Kulit kopi yang telah terpisah dari cairan fermentasi dikeringkan dalam oven dengan kertas saringnya selama 24 jam untuk mengamati perubahan bobot
kulit kopi susut bobot. Biji kopinya disimpan dalam freezer untuk diamati perubahan asam-asam organik menggunakan HPLC. Cairan hasil saringan tersebut di sentrifugasi dengan kecepatan 3000
rpm selama 15 menit pada suhu 4 C untuk memperoleh enzim ekstrak kasar. Kemudian dilakukan
analisa terhadap supernatantersebut yaitu pengukuran aktivitas enzim, kadar protein, gula total dan gula pereduksi.
14
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 PENELITIAN PENDAHULUAN
Penelitian pendahuluan dilakukan untuk menyeleksi bakteri proteolitik terbaik sebagai starter proteolitik dalam fermentasi. Tahapan penelitian pendahuluan terdiri atas beberapa parameter yang
diamati yaitu zona bening, kurva tumbuh, aktivitas enzim,total plate count TPC, kadar protein dan aktivitas spesifik yang diperoleh dari hasil pembagian kadar protein dengan aktivitas enzimnya.
Parameter yang dijadikan dasar untuk penetapan bakteri terpilih adalah nilai aktivitas enzim tertinggi.
4.1.1 Seleksi Bakteri Proteolitik
Isolat bakteri protease diperoleh dari isolasi biji kopi hasil fermentasi yang ada pada feses luwak dan diperoleh dua isolat dengan kode FLp1 dan FLp2. Isolat bakteri yang ditumbuhkan pada
mediaNA dengan susu skim membutuhkan waktu tumbuh sekitar 24 jam. Menurut Fardiaz 1992, kemampuan tumbuh mikroorganisme bergantung pada kondisi pH, suhu, waktu inkubasi, dan
konsentrasi substrat. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode pengamatan visual berdasarkan difusi zona bening halo yang terbentuk di sekitar koloni yang mengandung susu skim
1 Gambar 4. Penambahan susu skim 1 ke dalam media NA berfungsi untuk menginduksi sel bakteri dalam
mensintesis protease. Menurut Suhartono 1989, beberapa senyawa karbon sumber energi menimbulkan pengaruh induktif bagi sintesis enzim-enzim tertentu, dan biasanya substrat bagi enzim
berfungsi sebagai senyawa induksi.
Gambar 4. Pembentukan zona bening di sekitar koloni bakteri a FLp1 dan b FLp2 pada media NA dengan susu skim diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam
Pembentukan zona bening di sekitar koloni menunjukkan adanya degradasi senyawa protein oleh enzim-enzim ekstraseluler proteolitik yang dihasilkan bakteri. Menurut Suhartono 1991,
untuk beberapa produk ekstraseluler, dapat dihubungkan tingkat produktivitas galur dengan ukuran radius daerah difusi produk yang dikeluarkan dari koloni mikroba yang ditumbuhkan pada media
padat. Media yang digunakan mengandung senyawa “inducer” bagi produk yang diinginkan dan bebas dari senyawa-senyawa yang mungkin mengganggu sintesis enzim yang bersangkutan.
Tujuan penumbuhan pada media dengan penambahan susu skim ini adalah untuk menguji kemampuan isolat FLp1 dan FLp2 dalam menghasilkan enzim protease. Zona bening yang terbentuk
a b
