11
III. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai September 2012 di Laboratorium Bioteknologi Hewan dan Biomedis, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi PPSHB
dan Laboratorium Bioindustri Teknologi Industri Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
3.2 BAHAN DAN ALAT
Bahan yang digunakan adalah buah kopi Arabika dan sumber isolat selulolitik, xilanolitik dan proteolitik yang berasal dari feses luwak yang diperoleh dari perkebunan kopi di Desa Pangalengan,
Bandung. Mikroorganisme yang digunakan adalah proteolitik FLp1, xilanolitik FLx3 dan selulolitik FLs1. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya, ketiga bakteri tersebut telah diidentifikasi
yaitu : FLs1 Proteus penneri, FLp1 Bacillus aerophillus dan FL3 Stenotrophomonas sp MH 34.Media yang digunakan meliputi media xilan birchwood untuk bakteri xilanolitik, media Carboxy
Methyl Cellulose CMC untuk bakteri selulolitik dan media NA dengan susu skim untuk bakteri proteolitik. Komposisi media disajikan pada Lampiran 1. Bahan-bahan kimia yang digunakan meliputi
aquades, H
2
SO
4
untuk pengukuran analisa total gula, NaCl fisiologis, Asam Dinitro Salisilat DNS dan bufer fosfat untuk pengukuran aktivitas enzim, fenol 5, BSA Bovine Serum Albumin untuk
pengukuran kadar protein, buffer tris HCl 0.2 M pH 8, buffer kasein, tirosin standar, asam trikloroasetat, Na
2
CO
3,
Peralatan yang digunakan meliputi saringan 40 mesh, pisau, blender, spektrofotometer, sentrifuse, Laminar Air Flow, shaker inkubator, vortex, timbangan analitik, pipet mikro, erlenmeyer,
pH meter, botol durham, cawan petri, jarum inokulasi, bunsen, oven, tabung reaksi, tabung eppendorf, tabung sentrifuse, autoklaf, penangas air, alat-alat gelas dan berbagai peralatan laboratorium
mikrobiologi lainnya. pewarna folin,dan alkohol 70 .
3.3 METODE PENELITIAN 3.3.1. Penelitian Pendahuluan
3.3.1.1 Seleksi Bakteri Proteolitik
a. Peremajaan Isolat Proteolitik Kedua isolat proteolitik masing-masing FLp1 dan FLp2 diremajakan pada media padat susu
skim 1, komposisi media disajikan pada Lampiran 2. Isolat diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam.
b. Uji Kemampuan Proteolitik Dua isolat FLp1 dan FLp2 ditumbuhkan pada media padat susu skim dan diinkubasi
pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah itu dilakukan pengamatan terhadap adanya zona bening yang terbentuk, yang mengindikasikan aktivitas protease.
12
c. Pembuatan Kurva Tumbuh, Pengukuran Aktivitas Enzim dan Aktivitas Spesifik Inokulum dibuat dengan tiga corkborrer kultur bakteri hasil peremajaan yang telah
diinkubasi selama 24 jamdiinokulasikan ke dalam 100 ml media cair susu skim 1 kemudian diinkubasi dalam shaker pada kecepatan 100 rpm dengan suhu 30
Cselama 24 jam.Volume inokulum yang dimasukkan ke dalam media kultur sebesar 1 ml 10
6
selml dan diinkubasi dalam shaker pada suhu 30
C dengan kecepatan 100 rpm. Setiap 6 jam sekali dilakukan pengukuran Optical Density OD menggunakan spektrofotometer dengan
panjang gelombang 620 nmdan pengukuran aktivitas enzim dengan menggunakan metode Kunits Walter 1984 Lampiran 4.Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford
1976. Pengukuran absorbans dilakukan pada panjang gelombang 595 nm Lampiran 6. Aktivitas spesifik dapat dihitung berdasarkan nilai aktivitas enzim yang diperoleh dibagi
dengan kadar proteinnya. d. Total Plate Count TPC
Pada isolat FLp1 dan FLp2 diambil sebanyak 0.1 ml dari masing-masing kultur cairnya,selanjutnya dilakukan pengenceran berseri 10
-1
sampai 10
-8
dengan NaCl fisiologis.Dari setiap pengencerandiambil 0.1 ml kemudian disebar ke dalam cawan petri
berisi media pada sususkim, diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Koloni yang tumbuhkemudian dihitung.
3.3.1.2 Karakterisasi Bahan Baku
Analisis proksimat dilakukan pada buah kopi yaitu bagian kulit kopi dan biji kopi yang meliputi kadar air, abu, lemak, protein dan serat kasar. Prosedur analisis disajikan pada Lampiran 2.
3.3.2. Penelitian Utama
3.3.2.1 Persiapan Substrat
Buah kopi yang sudah masak berwarna merah dipisahkan antara kulit dengan biji kopinya. Kulit kopi dikeringkan di bawah sinar matahari selama + 24 jam hingga kadar air + 14. Kemudian
kulit kopi dihaluskan menggunakanblender dan diayak dengan saringan 40 mesh.
3.3.2.2 Persiapan Inokulum