Identifikasi Fragmen DNA Genomik Kelapa Sawit (Elaeis guineensis Jacq.) Hasil PCR (Polymerase Chain Reaction) Menggunakan Primer Spesifik untuk Beta Karoten

LAMPIRAN

Lampiran 1. Profil elektroforegram perbandingan primer SSR-3574

Keterangan: M = DNA ladder 1kb (Marker), A = isolasi DNA berasal dari bagian akar, D = isolasi DNA berasal dari bagian daun, B = isolasi DNA berasal dari bagian

buah

Lampiran 2. Profil elektroforesis perbandingan primer SSR-3574

Keterangan: M = DNA ladder 1kb (Marker), D = DNA stok berasal dari bagian daun, B = DNA stok berasal dari bagian buah P = DNA stok berasal dari bagian pollen,

O = DNA stok berasal dari bagian bunga betina

33D 33A 34D 34A 35D 35A 36D 36A 15D 15B 100bp 16D 16B 17D 17B 18D 18B 6D 6B 7D

Lampiran 3. Profil elektroforegram pengulangan proses PCR dengan Primer Beta pada sampel bagian akar

Keterangan: M = DNA ladder 1kb (Marker), A = isolasi DNA berasal dari bagian akar, B = isolasi DNA berasal dari bagian buah

Lampiran 4. Profil elektroforegram yang dianalisis menggunakan UVITEC FIREREADER

Lampiran 5. Profil elektroforegram yang dianalisis menggunakan UVITEC FIREREADER

Lampiran 6. Pembuatan larutan stok dan buffer A. Pembuatan Larutan Stok

• CTAB 5 % (100 ml): Timbang NaCl sebanyak 2.0 gram dan CTAB

sebanyak 5.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hotplate.

• Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml): Timbang Tris sebanyak 12.114 gram.

Masukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hotplate. Selanjutnya, ditambahkan 4.2 ml HCl pekat sedikit demi sedikit sampai pH mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.

• Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m): Timbang Tris sebanyak 6.057 gram.

campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hotplate. Selanjutnya, ditambahkan NaOH 2.5 M sedikit demi sedikit sampai pH mencapai 7.4. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 50 ml.

• EDTA 0.5 M pH 8.0 (100 ml) : Timbang EDTA sebanyak 18.612 gram dan

NaOH 2.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirer kemudian diletakkan diatas hotplate. Selanjutnya, ditambahkan HCl pekat sedikit demi sedikit sampai pH mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.

• NaCl 5 M(l00 ml): Timbang NaCl sebanyak 29.22 gram. Masukkan ke

dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hotplate. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.

**Semua bahan di atas disterilkan dengan menggunakan autoklaf kecuali CTAB 5%.

B. Pembuatan Larutan Buffer

• Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml): Campurkan 40 ml CTAB 5%, 25.1 ml

NaCl 5 M, 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0, 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0 dan 20.8 ml aquades.

• Buffer TAE 50 X (100 ml): Campurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M pH 7.4, 5.7

ml Asam Asetat Glasial, 10 ml EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.

• Buffer TAE 1X (500 ml): Campurkan 10 ml Buffer TAE 50 X dan 490 ml

aquades.

• Buffer TE (50 ml): Campurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M pH 8.0, 0.1 m lEDTA

0.5 M pH 8.0 dan 49.4 ml aquades.

• Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml): Campurkan 48 ml Kloroform dan

2 ml Isoamilalkohol.

Lampiran 7. Hasil uji kuantitas dengan nanospektrometer

Sampel A260/A280 Konsentrasi (ng/µl)

6D 2.38 765.60

6B 2.01 244.90

7D 2.45 616.60

7B 2.09 255.00

9D 1.83 172.50

9B 2.15 500.60

15D 2.06 407.00

15B 2.04 422.50

16D 2.04 817.60

16B 2.06 400.10

17D 2.57 739.40

17B 2.08 712.50

18D 1.63 257.20

18B 2.01 66.60

19D 2.36 692.10

19B 1.78 60.40

21D 1.78 270.80

21B 3.17 336.40

23D 1.90 226.90

23B 2.11 597.80

25D 2.04 471.70

25B 2.08 606.30

28D 1.88 570.30

28B 2.11 468.30

30D 1.94 929.90

30B 2.15 786.80

31D 2.00 338.70

31P 1.95 53.50

32D 2.03 951.20

32O 1.74 706.09

33D 1.99 724.30

33A 1.96 112.50

34D 2.05 863.40

34A 1.89 120.50

Lampiran 8. Data binari skoring

6B 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

6D 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0

7B 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0

7D 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0

9B 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0

9D 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0

15B 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

15D 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0

16B 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

16D 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

17B 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0

17D 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0

18B 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

18D 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0

19B 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

19D 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1

21B 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1

21D 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1

23B 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1

23D 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1

25B 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0

25D 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0

28D 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1

30B 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1

30D 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1

31D 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0

31P 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0

32D 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0

32O 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

33A 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

33D 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0

34A # # # # # # # # # # # # # # # #

34D 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0

35A # # # # # # # # # # # # # # # #

35D 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0

36A # # # # # # # # # # # # # # # #

Lampiran 9. Data PCoA (Principal Coordinates Analysis)

Sampel

Axis 1 Axis 2 Axis 3 Axis 4 Axis 5

Coord. Cos² Coord. Cos² Coord. Cos² Coord. Cos² Coord. Cos²

6B -0.2911 769 0.1363 169 -0.0297 8 0 0 0 0

6D 0.026 24 0.1264 566 -0.1287 586 0 0 0 0

7B 0.3263 461 -0.1167 59 -0.1604 111 0 0 0 0

7D 0.3996 819 -0.1038 55 -0.1632 137 0 0 0 0

9B -0.0918 229 0.143 557 -0.0929 235 0 0 0 0

9D 0.1321 859 0.0885 386 -0.0456 102 0 0 0 0

15B -0.2911 769 0.1363 169 -0.0297 8 0 0 0 0

15D 0.026 24 0.1264 566 -0.1287 586 0 0 0 0

16B -0.2911 769 0.1363 169 -0.0297 8 0 0 0 0

16D -0.2911 769 0.1363 169 -0.0297 8 0 0 0 0

17B -0.058 45 0.1058 151 -0.0761 78 0 0 0 0

17D 0.1852 462 0.0318 14 -0.0675 61 0 0 0 0

18B -0.2911 769 0.1363 169 -0.0297 8 0 0 0 0

18D 0.026 24 0.1264 566 -0.1287 586 0 0 0 0

19B -0.5406 951 0.0551 10 0.0952 29 0 0 0 0

19D 0.2288 566 0.0046 0 0.1305 184 0 0 0 0

21B 0.4169 -0.0567 20 -0.1091 75 0 0 0 0

21D 0.179 746 0.0608 86 0.0069 1 0 0 0 0

23B 0.2367 643 0.0054 0 0.1661 317 0 0 0 0

23D 0.2473 533 -0.0181 3 0.1926 323 0 0 0 0

25D 0.1327 233 0.0327 14 0.2021 541 0 0 0 0

28B 0.0478 118 0.1026 544 -0.002 0 0 0 0 0

28D 0.1876 275 -0.0292 7 0.313 765 0 0 0 0

30B 0.2144 736 0.0298 14 0.1109 197 0 0 0 0

30D 0.2103 660 0.0351 18 0.0718 77 0 0 0 0

31D 0.1587 538 0.0611 80 -0.0288 18 0 0 0 0

31P -0.2911 769 0.1363 169 -0.0297 8 0 0 0 0

32D 0.0827 27 -0.1254 63 0.2718 294 0 0 0 0

32O -0.5406 951 0.0551 10 0.0952 29 0 0 0 0

33A -0.5406 951 0.0551 10 0.0952 29 0 0 0 0

33D 0.026 24 0.1264 566 -0.1287 586 0 0 0 0

34A -0.1795 40 -0.6661 546 -0.0537 4 0.528 343 0.2335 67

34D 0.1321 859 0.0885 386 -0.0456 102 0 0 0 0

35A -0.1795 40 -0.6661 546 -0.0537 4 -0.4662 267 0.3405 143

35D 0.1321 859 0.0885 386 -0.0456 102 0 0 0 0

36A -0.1795 40 -0.6661 546 -0.0537 4 -0.0618 5 -0.574 405

36D 0.0973 103 0.0509 28 -0.1837 366 0 0 0 0

Keterangan : Axis Eigenvalue Inertia%

1 0.06456 33.67

2 0.04319 22.52

3 0.0147 7.67

4 0.01316 6.86

Lampiran 11. Data ukuran pasangan basa amplikon DNA

Sampel Produk PCR

6B 6D 7B 7D 9B 9D 15B 15D 16B 16D 17B 17D 18B 18D

843 1934 2248 1934 1934 1934 843 1934 843 843 1934 2248 843 1934

738 1060 1934 1756 843 1060 738 1060 738 738 991 1934 738 1060

843 1756 1060 738 843 843 843 991 843

738 1060 843 738 738 738 843 738

340 843 428 428 738

Lampiran 12. Data ukuran pasangan basa amplikon DNA

Sampel Produk PCR

19B 19D 21B 21D 23B 23D 25B 25D 28B 28D 30B 30D 31D 31P

738 3029 3029 3029 3029 3029 1934 1934 1934 3029 3029 3029 1934 843

2248 1934 1934 1934 1934 1060 843 843 1934 2248 2248 1060 738

1934 1060 1060 1060 1060 843 738 738 1146 1934 1934 991

1060 843 843 843 843 738 568 428 843 1060 1060 843

843 428 738 738 738 568 501 738 843 843 738

738 428 568 568 501 428 568 738 738 428

568 501 501 428 501 568 501

462 428 428 428 428 428

Lampiran 13. Data ukuran pasangan basa amplikon DNA

Sampel Produk PCR

32D 32O 33A 33D 34A 34D 35A 35D 36A 36D

1756 738 738 1934 1934 1934 2248

1146 1060 1060 1060 1934

991 843 843 843 1060

843 738 738 738 843

738 738 428 428 738

568 340

428

340

Lampiran 14. Foto kegiatan penelitian

Isolasi DNA

Uji Kuantitas

Elektroforesis

DAFTAR PUSTAKA

Allorerung, D., M. Syakir, Z. Poeloengan, Syafaruddin, dan W. Rumini. 2010. Budidaya Kelapa Sawit. Pusat Penelitian dan Pengembangan Perkebunan. Bogor.

Bahagiawati. 2011. Bioteknologi jalan pintas angkat produksi petani. Agro Inovasi. Edisi 16-22 Maret 2011 No. 3397 Tahun XLI.

Ferreira, M. E. and D. Grattapaglia. 1998. Introducao ao uso de marcadores moleculares em analise genetica. Embrapa-Cenargen. Brasilia.

Graham A. dan C. R. Newton. 1997. PCR (Polymerase Chain Reaction). Ed Ke-2. New York: Springer Verlag.

Hadi, M. M. 2004. Teknik Berkebun Kelapa Sawit. Adicita. Yogyakarta.

Handoyo, D. dan Rudiretna, A. 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR) [General Principles and Implementation of Polymerase Chain Reaction]. Unitas, 9 (1): P. 17-29.

Hartley, C. 1988. The Oil Palm. London: Longman.

Kementrian Perdagangan. 2013. Market Brief Kelapa Sawit dan Olahannya. ITPC – Hamburg.

Kiswanto, J. H. Purwanta., dan B. Wijayanto. 2008. Teknologi Budidaya Kelapa Sawit. Balai Besar Pengkajian Dan Pengembangan Teknologi Pertanian, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Lampung.

Lincoln, R. E. dan John W. P. 1950. Inheritance of beta-carotene in tomatoes. Genetics. 35(206):206-212.

Malaysian Palm Oil Board. 2003. Natural Palm Oil from Tropical Tradition.

Mangoensoekarjo, S. dan H. Semangun. 2008. Manajemen Agrobisnis Kelapa Sawit. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.

Moehs, C. P., Tian L., Osteryoung K. W., Dellapenna D. 2001. Analysis carotenoid biosynthetic gene expression during marigold petal development. Plant Mol. Biology. 45: 281-293.

Olson, J. A. 1999. Carotenoids. dalam: Shils ME, Olson JA, Shike M, Ross AC, eds. Modern Nutrition in Health and Disease, 9th edition. Baltimore, MD: Williams & Wilkins. Hal. 525 – 541.

Padmalatha, K., & Prasad, M.N.V. (2006). Optimization of DNA isolation and PCR protocol for RAPD analysis of selected medicinal and aromatic plants of conservation concern from Peninsular India. African Journal of Biotechnology, 5(3), 230-234.

Perrier, X. and Jacquemoud-Colled J.P. 2009. DARwin Software. http://darwin.cirad.fr/darwin

Puchooa, D. (2004). A simple, rapid and efficient method for the extraction of genomic DNA from lychee (Litchi chinensis Sonn.). African Journal of Biotechnology, 3(4), 253-255.

Putri, L. A. P. 2010. Pendugaan Parameter Genetik dan Karakterisasi Molekuler Keragaman Genetik dengan Marka Mikrosatelit (SSR) pada Kelapa Sawit. Disertasi. Program Pascasarjana IPB. Bogor.

Putri, L. A. P., Muhdi, Meiriani, dan Diana S. 2007. Desain primer spesifik untuk gen yang berperan pada biosintesis beta karoten kelapa sawit. Agrista. Vol. 11 No. 2., 73-80.

Rasid, O. A., Kadir A. P. G., Singh R., dan Ravigadevi S. 2011. Lycopene cyclase genes for modification of carotenoid content. MPOB Information Series No. 480.

Rasid, O. A., Singh R., Harikhrishna K., Ho C. L., Cheah S. C. 2003. Isolation of partial DNA sequence coding for lycopene β-cyclase from oil palm (E. guineensis). Proceedings of the PIPOC 2003 International Palm Oil Congress (Agriculture). Kuala Lumpur, Malaysia. Pp: 781-788

Rasid, O. A., Wan N. S., Nor H. A., Masura S. S., Zulqarnain M., Ho C. L., Sambanthamurthi R., dan Suhaimi N. 2008. RT-PCR amplification and cloning of partial DNA sequence coding for oil palm (Elais oleifera) phytoene synthase gene. AsPac J. Mol. Biol. Biotechnol., Vol 16(1): 17-24 Reddy, B. V. S., Ramesh S., Longvah T. 2005. Prospects of breeding for

micronutrients and beta-carotene-dense sorghums. Journal of SAT Agricultural Research, 14 pages. DOI:10.3914/ICRISAT.0126.

Sambanthamurthi, R., Sundram, K. & Tan, Y. 2000. Chemistry and biochemistry of palm oil. Prog. Lipid Res. 39, 507–558.

Santoso, D. 2001. Pengembangan pelacak DNA spesifik gen melalui bioinformatika: Indentifikasi gen penyandi protein biji 21 kDa pada kakao UAH Indonesia. Menara Perkebunan. 69 (1): 10-17.

Santra M., Santra D. K., Rao V. S., Taware S. P., Tamhankar S. A. 2005. Inheritance of β-carotene concentration in durum wheat (Triticum turgidum L. ssp. durum). Euphytica. 144: 215–221.

Sastrosayono, S. 2003. Budidaya Kelapa Sawit. Agromedia Pustaka. Jakarta. Singh, R., Low, E. T., Ooi, L. C., Ong-Abdullah, M., Nookiah, R., Ting, N. C., et

al. (2014). The oil palm VIRESCENS gene controls fruit colour and encodes a R2R3-MYB. Nat. Commun. 5, 4106. doi: 10.1038/ncomms5106 Soehardjo. 1999. Vademescum Kelapa Sawit. PT. Perkebunan Nusantara IV

(Persero). Pematang Siantar.

Suryanto, D. 2003. Melihat keanekaragaman organisme melalui beberapa teknik genetika molekuler.

Wilkins, T.A. and Smart, L.B. 1996. Isolation of RNA from plant tissue in Krieg, P.A. (ed). A Laboratory guide to RNA isolation, analysis and synthesis. New York: Wiley – Liss.

Ye J., Coulouris G., Zaretskaya I., Cutcutache I., Rozen S., dan Thomas L. M. 2012. Primer-BLAST: A tool to design target specific primers fro polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13:134.

Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction (PCR). Penerbit ANDI. Yogyakarta.

Zein, S.A. dan D. M. Prawiradilaga. 2013. DNA Bercode Fauna Indonesia. Kencana Prenademedia Group. Jakarta.

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman

Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara Medan dan Laboratorium Bio Molekuler PT. Socfin Indonesia SSPL Bangun Bandar Desa Martebing Kecamatan Dolok Masihul Kabupaten Serdang Bedagai

Sumatera Utara. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2016 sampai bulan Agustus 2016.

Bahan dan Alat Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 4 sampel akar muda, 13 sampel daging buah muda, 19 sampel daun muda (daun tombak), 1 sampel pollen, dan 1 sampel bunga betina yang berasal dari tanaman kelapa sawit yang dikeluarkan oleh PT. Socfin Indonesia, air, aquades, ddH2O,

Polyvinylpolypyrolidone (PVPP), nitrogen cair, buffer ekstraksi CTAB,

β-merkaptoethanol, tube 2 ml, tube 1,5 ml, tube 0,2 ml, Khloroform IsoAmil

Alkohol, isopropanol, buffer TE, ethanol absolute, ethanol 70%, larutan TBE 1x dan 0,5x, larutan TAE 1x, gel agarose, es, nuclease free water, dan loading buffer. Digunakan dua primer yaitu primer spesifik Beta (terdiri dari primer Beta Forward (5’-CCA CTG GCT TCT CTA GGC-3’) dan primer Beta Reverse (5’-CCT CTC TAT CGG CCA GAC-3’)) dan primer SSR-3574 sebagai primer pembanding. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mortar dan alu, alumunium foil, pestle, mikropipet, rak tube, waterbath, stirer, centrifuge, kulkas, freezer, komputer, nanospec, timbangan analitik, erlenmeyer, microwave, cetakan agarose, bak elektroforesis, thermocycler, UV Transilluminator, Geldoc dan spin.

Metode Penelitian

Metode penelitian yang digunakan adalah metode marka molekuler

dengan menggunakan primer spesifik berdasarkan PCR (Polymerase Chain Reaction) yang mengamplifikasi sekuen DNA secara spesifik.

PELAKSANAAN PENELITIAN Pengambilan Sampel

Semua alat disiapkan seperti pisau dan plastik sampel, lalu diambil sampel akar muda, buah muda, daun muda (daun tombak), pollen, dan bunga betina yang berasal dari tanaman kelapa sawit yang dikeluarkan oleh PT. Socfin Indonesia di lapangan dari masing-masing populasi dengan cara memotong bagian menggunakan pisau yang telah disemprot alkohol setiap kali sampel diambil. Sampel dibersihkan dengan air bersih kemudian dibuang bagian yang tidak diperlukan dan kemudian dipotong kecil-kecil. Dimasukkan potongan sampel ke alumunium foil atau amplop coklat lalu simpan ke dalam kulkas.

Isolasi DNA

Sampel yang sudah dicuci dan bersih ditambahkan ke dalam mortar dingin sebanyak 0,1 g. Kemudian ditambahkan ± 0,1 g Polyvinylpolypyrolidone (PVPP) dan nitrogen cair, gerus hingga halus. Serbuk halus yang dihasilkan kemudian dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml yang berisi 1 ml buffer Castillo yang telah dipanaskan dan diberi 2 μl β-merkaptoethanol 1%. Campuran tersebut kemudian dikocok menggunakan stirer, lalu dipanaskan selama 30 menit pada suhu 65oC di waterbath. Larutan dibiarkan dingin pada suhu kamar lalu, ditambahkan chloroform isoamil alkohol 1 Volume. Larutan tersebut disentrifius selama 10 menit dengan kecepatan 11.000 rpm. Supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tube 2 ml yang baru. Kemudian ditambahkan 1 volume Chloroform: Isoamil alkohol, Tube tersebut dikocok bolak balik, kemudian tube tersebut disentrifius selama 10 menit dengan 11 kecepatan 13.000 rpm, cairan bagian atas didalam tube kemudian dipipet dan dimasukkan kedalam tube baru kemudian

ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 1 volume. Dikocok perlahan hingga homogen kemudian simpan dalam kulkas 1 – 4 jam, kemudian disentrifius selama 10 menit dengan kecepatan 11.000 rpm. Cairan dan pellet DNA dibuang dan dikeringkan dengan cara membalikkan tabung. Pellet DNA dilarutkan dalam 0,1 ml buffer TE, kemudian ditambahkan ethanol absolute sebanyak 2,5 volume. Larutan tersebut dikocok hingga homogen dan disimpan dalam freezer selama 30 menit atau semalam. Kemudian larutan tersebut disentrifius selama 10 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Cairan tersebut kemudian dibuang dan pellet DNA diambil kemudian dicuci dengan ethanol 70% lalu dikeringkan. Pellet DNA yang sudah kering dilarutkan dalam 50 μl buffer TE atau nuclease free water, kemudian simpan dalam freezer. Kualitas DNA kemudian diuji dengan elektroforesis gel agarose 2% dan konsentrasinya diukur dengan nanospec pada panjang gelombang 260 dan 280 nm.

Uji Kuantitas DNA

Sebanyak 2 μl stok DNA diukur menggunakan Nanospektrometer sinar UV. Absorban diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Kemurnian DNA ditentukan dari nilai perbandingan A260/A280.

Konsentrasi DNA = faktor konversi x faktor pengenceran x A260

Tingkat kemurnian DNA ditetapkan dengan membandingkan nilai absorbansi pada A260 nm terhadap A280 nm. Bila rasio perbandingan menunjukan nilai 1,8 ‒ 2,0 maka tingkat konsentrasi DNA dinyatakan memenuhi syarat untuk dianalisis selanjutnya.

Uji Kualitas DNA

Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis metode standar dengan cara memasukkan 2 μl stok DNA ditambah 1 μl loading dye ke dalam sumur gel agarose 0.8%.

Sebelum dilakukan elektroforesis disiapkan gel agarose konsentrasi 0,8% (b/v). Agarose ditimbang 1,04 g kemudian dilarutkan kedalam 130 ml buffer TAE 1x atau buffer TBE 1x. Larutan tersebut dimasukkan kedalam Erlenmeyer kemudian dipanaskan dan diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larutan menjadi bening kemudian didinginkan dengan cara dialirkan tabung tersebut pada air yang mengalir. Setelah larutan agak dingin (suhu ± 60oC), ditambahkan 1 μl etidium bromida, diaduk sambil dipanaskan kembali ± 2 menit dan didinginkan sampai ± 60oC kemudian larutan dimasukkan dalam cetakan agar yang telah dipasang sisir pembuat lubang dan dibiarkan memadat selama ± 40 menit. Gel yang telah memadat dimasukkan kedalam elektroforesis dan diberi larutan TAE 1x atau TBE 0,5x sebanyak ± 670 ml (hingga terendam). Contoh DNA yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam sumur gel. Setelah semua lubang sumur gel berisi selanjutnya dielektroforesis. Running elektroforesis dilakukan pada kondisi 75 volt selama 60 menit. Visualisasi DNA yang telah dielektroforesis dilakukan dengan UV Transluminator dan didokumentasikan.

Kualitas DNA dinyatakan baik bila hasil elektroforesis menunjukkan pola pita yang terang dan fokus. Artinya DNA yang dihasilkan cukup solid, utuh dan mempunyai konsentrasi yang tinggi.

Amplifikasi dan Genotiping

Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer spesifik Beta Forward dan Beta Reverse yang telah teruji dari penelitian Putri et al. (2007).

Sebelum running PCR dilakukan pengenceran DNA dengan mengambil 9 µl stok DNA dan ditambah 15 µl ddH2O sehingga diperoleh 24 µl aliquot DNA.

Kemudian dilakukan pengenceran primer yaitu tube primer disentrifius selama 5 menit setelah itu ditambahkan ddH2O sesuai ukuran molar. Dibuat aliquot primer

yaitu dengan mengambil 10 – 15 µl stok primer.

Persiapan awal PCR adalah mencairkan komponen untuk running PCR yaitu paket PCR produksi Promega dalam kotak berisi pecahan es. Untuk mempermudah pembuatan larutan master dimisalkan 5 sampel yang akan digunakan maka larutan master terdiri atas: ddH2O 3,5 µl x 5 = 17,5 µl, Go Tag

7,5 µl x 5 = 37,5 µl, aliquot primer 1 µl x 5 = 5 µl. Dari tube diambil 15 µl ke tube yang lain sehingga diperoleh 5 tube untuk PCR dan ditambahkan masing-masing DNA sebanyak 2 µl. Kemudian tabung dispin manual. Tabung berisi stok DNA dan campuran master dimasukkan dalam blok sampel di mesin PCR dengan

annealing 54o C. Reaksi amplifikasi thermocycler didesain waktu, suhu dan

jumlah siklus termal 30 ‒ 35 kali (± 2 jam 51 menit) yang telah digunakan pada tanaman kelapa sawit, tertera pada Tabel 1 (Putri et al., 2007).

Setelah reaksi PCR selesai DNA hasil amplifikasi disimpan dalam suhu 20o C bila sedang tidak digunakan.

Tabel 1. Proses amplifikasi PCR

No. Tahapan Suhu Waktu Jumlah

Siklus

1 Denaturasi awal 94o C 2 menit 1

2 Denaturasi 94o C 2 menit 30 - 35

3 Annealing 54o C 1 menit 30 - 35

4 Extension 72o C 1 menit 30 - 35

5 Extension akhir 72o C 10 menit 1

6 Kondisi akhir PCR 4o C Tak terbatas 1

Elektroforesis

Gel agarose disiapkan dengan konsentrasi 2%, kemudian dicetak dan dimasukkan ke dalam bak elektroforesis, loading buffer kemudian disiapkan dalam parafilm. Loading buffer dan sampel kemudian dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis. Alat elektroforesis dijalankan dengan menghubungkannya dengan power supply dan ditunggu ± 1 jam. Gel agarose kemudian dikeluarkan dari bak elektroforesis kemudian hasil running elektroforesis difoto menggunakan Geldoc.

Analisis Data

Penentuan ukuran pita hasil PCR

Ukuran fragmen basa (pasangan basa = bp) produk PCR ditentukan dengan menggunakan UVITEC Cambridge FireReader. Fragmen DNA yang digunakan sebagai standart ukuran yaitu 1 kb DNA ladder. Data gambar hasil elektroforesis yang dimasukkan ke dalam program akan dideteksi muncul tidaknya band dan dinilai berdasarkan marker value yang telah dimasukkan.

Analisis hubungan genetik

Untuk penentuan kekerabatan genetik, produk PCR diskoring berdasarkan muncul tidaknya pita. Pita yang muncul pada gel diasumsikan sebagai alel. Keragaman alel ditentukan dari perbedaan migrasi alel pada gel dari

masing-masing sampel. Berdasarkan ada atau tidaknya pita, profil pita diterjemahkan ke

dalam data biner. Pita yang muncul diberi kode 1 (ada) dan 0 (tidak ada) (Ferreira dan Grattapaglia, 1998).

Data skoring kemudian diolah menggunakan software DARwin 6.0.13 (Perrier dan Jacquemoud-Collet, 2009) dimana matriks jarak atau ketidaksamaan genetik untuk semua kombinasi pasangan individu dapat dilakukan dengan dua tipe analisis deskriptif dari keragaman: (i) Principal Coordinates Analysis (PCoA), suatu jenis analisis faktorial pada tabel ketidaksamaan untuk mendapatkan group origin utama dan (ii) Neighbor-Joining Tree (NJTree) untuk memperoleh gambaran dari kekerabatan di antara individu-individu.

HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil

Beberapa sampel yang diperoleh dari lapangan yang terdiri 19 sampel daun muda (daun tombak), 13 sampel buah muda (9 jenis virescens dan 4 jenis nigrescens), 4 sampel akar kecambah, 1 sampel pollen (serbuk sari), dan 1 sampel bunga betina tanaman kelapa sawit yang dikeluarkan oleh PT. Socfin Indonesia diperoleh identitas yang dapat dilihat pada Tabel 2.

Uji kualitas DNA dapat dilakukan untuk mengetahui hasil dari isolasi DNA sampel tanaman kelapa sawit dengan metode Orozco-Castillo et al. (1994) yang dimodifikasi dengan penambahan Polyvinilpolypirolidone (PVPP) dan

β-mercaptoethanol dapat digunakan untuk proses PCR. Sedangkan hasil dari uji

kuantitas DNA stok dapat dilihat pada Lampiran 7.

Hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan marka molekuler terkait karakter beta karoten pada tanaman kelapa sawit (primer Beta) menunjukkan pola pita (amplikon) yang beragam dengan persentase polimorfisme yang tinggi sebesar 100%. Terdapat perbedaan pola pita pada sampel yang berasal dari individu yang sama tetapi berbeda sumber bagian tanaman yang diisolasi. Pada penelitian ini diperoleh fragmen pita polimorfik dengan ukuran berkisar ± 155 bp ‒ 3172 bp.

Berdasarkan analisis faktorial PCoA dapat diketahui bahwa keragaman dari 38 sampel DNA stok kelapa sawit sangat tinggi yaitu sebesar 56.19 % dan analisis dendogram menunjukkan 38 sampel DNA stok kelapa sawit terbagi menjadi 3 kelompok utama.

Tabel 2. Identitas sampel yang dikeluarkan oleh PT. Socfin Indonesia

No. Sampel Kode Sampel di Lapangan Origin Jenis Buah Tahun Tanam Bentuk Sampel yang diisolasi

6 133B/68/23 KAMERUN Virescens 2009 Daun/Buah

7 133B/57/18 KAMERUN Virescens 2009 Daun/Buah

9 133B/49/20 KAMERUN Virescens 2009 Daun/Buah

15 140A/92/1 OLEIFERA HYBRID Nigrescens 2008 Daun/Buah

16 140A/95/1 OLEIFERA HYBRID Nigrescens 2008 Daun/Buah

17 140A/98/5 OLEIFERA HYBRID Nigrescens 2008 Daun/Buah

18 140A/96/6 OLEIFERA HYBRID Nigrescens 2008 Daun/Buah

19 145A/54/16 WA Virescens 2005 Daun/Buah

21 145A/64/21 WA Virescens 2005 Daun/Buah

23 145A/64/14 WA Virescens 2005 Daun/Buah

25 68B/16/16 ANGOLA Virescens 2012 Daun/Buah

28 68B/17/12 ANGOLA Virescens 2012 Daun/Buah

30 68B/20/13 ANGOLA Virescens 2012 Daun/Buah

31 68B/77/19 YANGAMBI - 1998 Daun/Pollen

32 59B/166/9 DELI - 1998 Daun/Bunga Betina

33 Polybag (1) LAME - 2016 Daun/Akar

34 Polybag (2) LAME - 2016 Daun/Akar

Uji kualitas DNA

Kualitas DNA dinilai dari uji gel agarose 0.8% hasil running electrophoresis (elektroforegram). Elektroforegram untuk 38 sampel yang telah diisolasi DNA dapat dilihat pada Gambar 2 ‒ Gambar 9.

Gambar 2. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % Keterangan:

D = isolasi DNA berasal dari bagian daun (15, 16, 21, 23, 25, 28, 30) x = sampel lain

Gambar 3. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % Keterangan:

B = isolasi DNA berasal dari bagian Buah (7, 9, 15, 16) x = sampel lain

Gambar 4. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % Keterangan:

D = isolasi DNA berasal dari bagian daun (6 dan 9) B = isolasi DNA berasal dari bagian buah (17, 18, 19) x = sampel lain

x x x x 15D 16D 21D x 23D x 25D x x 28D x 30D

x x x x x x 7B x 9B x x x x x 15B 16B

Gambar 5. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % Keterangan:

D = isolasi DNA berasal dari bagian daun (15, 16, 25, 30) B = isolasi DNA berasal dari bagian buah (7, 9, 15, 17, 18) * = sampel cadangan

x = sampel lain

Gambar 6. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % Keterangan:

D = isolasi DNA berasal dari bagian daun ( 33, 34, 35, 36) B = isolasi DNA berasal dari bagian buah (19)

A = isolasi DNA berasal dari bagian akar (33, 34, 35, 36) P = isolasi DNA berasal dari bagian pollen (31)

x = sampel lain

Gambar 7. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % Keterangan:

D = isolasi DNA berasal dari bagian daun (6, 7, 9, 17, 18, 19, 31) B = isolasi DNA berasal dari bagian buah (23)

x = sampel lain

x x x 15D*16D 25D x x 30D 7B 9B x x 15B 17B*

19B x 33D 34D 35D 36D 33A 34A 35A 36A 31P 17B 18B 19B x

Gambar 8. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % Keterangan:

D = isolasi DNA berasal dari bagian daun (32)

B = isolasi DNA berasal dari bagian buah (6, 21, 25, 28, 30) x = sampel lain

Gambar 9. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % Keterangan:

D = isolasi DNA berasal dari bagian daun (9 dan 32) B = isolasi DNA berasal dari bagian buah (21, 25, 28, 30) P = isolasi DNA berasal dari bagian pollen (31)

x = sampel lain

Dari elektroforegram uji kualitas DNA yang dihasilkan di gel agarose dapat dilihat pada Gambar 2 – 9, menunjukkan bahwa DNA dari 37 sampel berhasil diisolasi dan sudah memenuhi syarat untuk dilanjutkan pada proses amplifikasi mesin PCR. Sampel yang terlihat pada elektroforegram awal memiliki kualitas yang kurang baik (smear) telah dipurifikasi dan ditunjukkan pada proses elektroforesis selanjutnya, seperti pada pola pita sampel 16D dan 30D pada Gambar 2 telah terlihat jelas pada Gambar 5.

32D 21B x x 25B x x 28B x 30B x x x x x

Keragaan primer spesifik dan ukuran pasangan basa pita

Sebanyak 38 stok sampel DNA telah diamplifikasi menggunakan mesin PCR dan diseparasi dengan elektroforesis gel agarose 1.2% yang kemudian divisualisasikan menggunakan UV Transluminator. Elektroforegram produk PCR menunjukkan bahwa tiga sampel tidak dapat teramplifikasi menggunakan primer Beta. tiga sampel tersebut adalah 34A, 35A, dan 36A. Terdapat satu sampel yang menampilkan pita yang tipis yaitu 19B. Sedangkan saat 38 stok sampel yang sama diamplifikasi menggunakan primer pembanding yaitu primer SSR-3574, semua sampel dapat teramplifikasi. Elektroforegram sampel yang diampifikasi menggunakan primer SSR-3574 dapat dilihat pada Lampiran 1 dan 2.

Gambar 10. Profil elektroforegram produk PCR primer Beta pada beberapa sampel kelapa sawit

Keterangan:

M = DNA ladder 1kb (Marker)

A = isolasi DNA berasal dari bagian akar (33, 34, 35, 36) D = isolasi DNA berasal dari bagian daun (15, 16, 33, 34, 35, 36) B = isolasi DNA berasal dari bagian buah (15 dan 16)

10.000bp

2.000bp 1.500bp 1.000bp 750bp 500bp 250bp

Tabel 3. Hasil Amplifikasi Produk PCR Primer Beta Kode

Sampel

Ukuran Pasangan Basa Amplikon Primer Beta

340 bp 428 bp 738 bp 843 bp 1060 bp 1934 bp 2248 bp

33D √ √ √ √

33A √

34D √ √ √ √ √

34A

35D √ √ √ √ √

35A

36D √ √ √ √ √ √

36A

15D √ √ √ √

15B √ √

16D √ √

16B √ √

Keterangan: A = isolasi DNA berasal dari bagian akar (33, 34, 35, 36) D = isolasi DNA berasal dari bagian daun (15, 16, 33, 34, 35, 36) B = isolasi DNA berasal dari bagian buah (15 dan 16)

Gambar 11. Profil elektroforegram produk PCR primer Beta pada beberapa sampel kelapa sawit

Keterangan:

M = DNA ladder 1kb (Marker)

D = DNA stok berasal dari bagian daun (6, 7, 9, 17, 18) B = DNA stok berasal dari bagian buah (6, 7, 9, 17, 18) P = DNA stok berasal dari bagian pollen (31)

O = DNA stok berasal dari bagian bunga betina (32) 10.000bp 2.000bp 1.500bp 1.000bp 750bp 500bp 250bp

Tabel 4. Hasil Amplifikasi Produk PCR Primer Beta Kode

Sampel

Ukuran Pasangan Basa Amplikon Primer Beta 340 bp 428 bp 738 bp 843 bp 991 bp 1060 bp 1756 bp 1934 bp 2248 bp

17D √ √ √ √ √ √ √

17B √ √ √ √

18D √ √ √ √

18B √ √

6D √ √ √ √

6B √ √

7D √ √ √ √ √ √

7B √ √ √ √ √

9D √ √ √ √ √

9B √ √ √

31P √ √

32O √

Keterangan: D = DNA stok berasal dari bagian daun (6, 7, 9, 17, 18) B = DNA stok berasal dari bagian buah (6, 7, 9, 17, 18) P = DNA stok berasal dari bagian pollen (31)

O = DNA stok berasal dari bagian bunga betina (32)

Gambar 12. Profil elektroforegram produk PCR primer Beta pada beberapa sampel kelapa sawit

Keterangan:

M = DNA ladder 1kb (Marker)

D = DNA stok berasal dari bagian daun (19, 21, 23, 25, 28, 30, 31, 32) B = DNA stok berasal dari bagian buah (19, 21, 23, 25, 28, 30) 10.000bp 2.000bp 1.500bp 1.000bp 750bp 500bp 250bp

Tabel 5. Hasil Amplifikasi Produk PCR Primer Beta Kode

Sampel

Ukuran Pasangan Basa Amplikon Primer Beta 156 bp 340 bp 354 bp 428 bp 462 bp 501 bp 568 bp 738 bp 843 bp 991 bp 1060 bp 1146 bp 1756 bp 1934 bp 3029 bp

19D √ √ √ √ √ √ √ √

19B √

21D √ √ √ √ √ √

21B √ √ √ √ √

23D √ √ √ √ √ √ √ √ √

23B √ √ √ √ √ √ √ √

25D √ √ √ √ √ √

25B √ √ √ √ √ √ √

28D √ √ √ √ √ √ √ √

28B √ √ √ √

30D √ √ √ √ √ √ √

30B √ √ √ √ √ √ √

31D √ √ √ √ √ √

32D √ √ √ √ √ √ √ √ √

Keterangan: D = DNA stok berasal dari bagian daun (19, 21, 23, 25, 28, 30, 31, 32) B = DNA stok berasal dari bagian buah (19, 21, 23, 25, 28, 30)

Amplifikasi terhadap 38 sampel kelapa sawit yang dilakukan dengan primer Beta menghasilkan 16 amplikon yang berukuran ± 156 bp ‒ 3029 bp. Dari Gambar 10 ‒ 12 dan Tabel 3 ‒ 4, dapat dilihat bahwa terdapat tiga sampel seperti 34A, 35A, dan 36A tidak membentuk amplikon. Sampel-sampel tersebut telah dilakukan pengulangan PCR dengan primer yang sama agar didapati amplikon namun tetap tidak teramplifikasi (Lampiran 3).

Persentase polimorfisme primer Beta berada pada 100% polimorfik yang menunjukkan bahwa keragaman genetik individu yang menjadi sampel adalah tinggi. Jumlah amplikon terbanyak ada pada sampel 19D (isolasi DNA dari daun origin WA dan jenis buah virescens), 23D (isolasi dari daun origin WA dan jenis buah virescens), dan 32D (isolasi dari daun origin DELI). Dari Lampiran 8 ‒ 10 diketahui bahwa data ukuran fragmen basa tertinggi yaitu terdapat pada sampel 19D, 21D, 21B, 23D, 23B, 28B, 30D dan 30B (3029 bp) sedangkan ukuran fragmen terendah terdapat pada sampel 32D (156 bp).

Analisis hubungan genetik

Gambar 13 menunjukkan persentase keragaman genetik berdasarkan analisis faktorial PCoA (Principal Coordinates Analysis). Melalui software DARwin 6.0.13, keragaman molekuler dari hasil analisis faktorial menunjukkan bahwa total keragaman molekuler pada aksis 1 sebesar 33.67 % dan aksis 2 sebesar 22.52 % dengan total 56.19 %. Sebaran genetik sampel-sampel terdapat pada semua bidang yang terbentuk dari aksis 1 dan 2.

Gambar 13. Faktorial analisis PCoA (Principal Coordinates Analysis) aksis 1 (horizontal) dan aksis 2 (vertikal) dengan marka primer Beta

Hasil analisis pengelompokan dengan metode Matrix Dissimilarity Simple Matching untuk 38 sampel stok DNA kelapa sawit dengan marka primer Beta menghasilkan dendogram yang menunjukkan bahwa semua sampel dapat dibedakan dengan jelas antara satu dengan yang lain (Gambar 14)

Factorial analysis: (Axes 1 / 2)

-.6 -.5 -.4 -.3 -.2 -.1 .1 .2 .3 .4 .5

.15 .1 .05 -.05 -.1 -.15 -.2 -.25 -.3 -.35 -.4 -.45 -.5 -.55 -.6 -.65 -.7 6B _6D 7B 7D 9B 9D 15B _15D 16B 16D 17B 17D 18B _18D 19B 19D 21B 21D 23B 23D 25B 25D 28B 28D 30B 30D 31D 31P 32D 32O33A 33D 34A 34D 35A 35D 36A 36D

Gambar 14. Profil filogenik Neighbor-Joining dari 38 sampel DNA stok kelapa sawit berdasarkan Matrix Dissimilarity Simple Matching dengan primer Beta

Dari Gambar 14 dapat diketahui bahwa 38 sampel DNA stok kelapa sawit terbagi menjadi 3 kelompok utama (cluster). Kelompok pertama (22 sampel) yang terdiri dari origin WA (5 sampel), origin Angola (5 sampel), origin Kamerun (4 sampel), origin Lame (4 sampel), origin Oleifera Hybrid (3 sampel), dan origin Yangambi (1 sampel). Kelompok kedua (15 sampel) yang terdiri dari origin Oleifera Hybrid (5 sampel), origin Lame (4 sampel), origin Kamerun (2 sampel),

6B 6D 7B 7D 9B 9D 15B 15D 16B 16D 17B 17D 18B 18D 19B 19D 21B 21D 23B 23D 25B 25D 28B 28D 30B 30D 31D 31P 32D 32O 33A 33D 34A 34D 35A 35D 36A 36D 45 10 18 12 40 37 32 30 22 34 16 42 7 49 35 74 4 34 5 6 14 16 6 0 0 3

I

II

III

Pita spesifik

Dari Gambar 10 ‒ 12 dan Tabel 5 dapat dilihat pada amplikon polimorfik yang dihasilkan ditemukan pita spesifik yang tidak dijumpai pada sampel yang lain. Hal ini dapat dilihat pada sampel 19D (isolasi DNA dari daun origin WA dan jenis buah virescens) dengan ukuran 462 bp, 23D (isolasi DNA dari daun origin WA dan jenis buah virescens) dengan ukuran 354 bp dan 32D (isolasi DNA dari daun origin Deli) dengan ukuran 156 bp.

Pembahasan

Berdasarkan hasil uji kualitas DNA yang dilihat secara visual dari gel agarose 2.0% yang didapat melalui proses elektroforesis pada Gambar 2 ‒ 10 diketahui bahwa 37 sampel yang diuji menunjukkan kualitas yang beragam. Sampel 7D, 6B, 16B,17D, 18D, 19D, 21D, 23D, 23B, 28D, 33D, 33A, 34D, 35D, 36D memperlihatkan kualitas pita yang baik tanpa memerlukan dilakukannya purifikasi DNA stok. Sementara itu sampel dengan pita yang terlihat smear pada awalnya seperti 15D, 15B, 16D, 21B, 25D, 25B, 28B, 30D, 30B, 7B, 9D, 9B, 17B, 18B, 19B, 6D, 31P, 32D perlu dilakukan purifikasi untuk memurnikan DNA stok agar sampel layak untuk diamplifikasi pada proses PCR selanjutnya. Hal ini dikarenakan kualitas pita yang smear menunjukkan tingkat kemurnian DNA rendah yang diakibatkan oleh kontaminasi oleh senyawa lain seperti polisakarida. Jika dibiarkan maka kontaminasi ini dapat mengganggu proses amplifikasi sampel pada proses PCR. Hal ini sesuai dengan pernyataan Padmalatha dan Prasad (2006) yang menyatakan bahwa permasalahan yang umum ditemui dalam proses isolasi dan purifikasi DNA tanaman adalah degradasi DNA oleh enzim endonuklease, tingginya kandungan polisakarida, senyawa inhibitor seperti polifenol dan

metabolit sekunder lain yang dapat mengganggu reaksi enzimatik dan didukung oleh pernyataan Puchooa (2004) yang mengatakan tingkat kemurnian DNA hasil isolasi juga menjadi salah satu faktor penentu keberhasilan proses amplifikasi DNA pada proses PCR.

Dari hasil penelitian yang diperoleh dapat dilihat bahwa banyak terdapat pola pita yang terlihat tipis, redup, maupun smear, misalnya pada Gambar 12. Hal ini diduga karena adanya senyawa-senyawa polisakarida dan metabolit sekunder yang masih tersisa pada DNA stok, sesuai dengan pernyataan Wilkins dan Smart (1996) yang mengatakan senyawa-senyawa kontaminan yang dapat mengganggu reaksi PCR seperti polisakarida dan metabolit sekunder. Struktur polisakarida yang mirip dengan asam nukleat akan menyebabkan polisakarida tersebut akan mengendap bersama dengan asam nukleat. Hal ini bisa juga disebabkan oleh faktor lain seperti yang dikatakan oleh Handoyo dan Rudiretna (2000) yang menyatakan perlu diingat bahwa di dalam proses PCR efisiensi amplifikasi tidak terjadi 100 %, hal ini disebabkan oleh target templat terlampau banyak, jumlah polimerase DNA terbatas, dan kemungkinan terjadinya reannealing untai target.

Pada Gambar 10 yang menunjukkan profil amplikon menggunakan primer Beta didapati beberapa sampel yang tidak teramplifikasi oleh mesin PCR. Sampel tersebut adalah 34A, 35A, dan 36A yang DNA-nya diisolasi langsung dari bagian akar. Dari hasil uji kuantitas yang dilakukan menggunakan nanospektrometer pada Lampiran 7 dan hasil uji kualitas pada gel agarose 2.0% (Gambar 2 ‒ 10)

Namun setelah dilakukan proses PCR ulang, ketiga sampel tersebut tetap tidak teramplifikasi. Hal ini menunjukkan bahwa kontaminasi bukanlah hal yang menghalangi DNA untuk tidak teramplifikasi menggunakan primer Beta yang menyandikan parsial fragmen gen lintasan biosintesis beta karoten. Maka dari itu dapat diambil kesimpulan bahwa hal ini diduga disebabkan oleh beta karoten yang tidak disintesis pada bagian akar tanaman. Selain itu, primer Beta yang digunakan adalah primer spesifik yang hanya dapat mengamplifikasi pita dengan sekuen DNA spesifik.

Perbedaan bagian tanaman yang diisolasi DNAnya dari satu individu yang sama juga memperlihatkan pola pita yang berbeda. Perbedaan ini terdapat pada bagian daun dengan buah, daun dengan akar, daun dengan pollen, dan daun dengan bunga betina. Salah satu contoh sampel yang menunjukkan perbedaan pola pita yang sangat nyata adalah sampel 31D dan 32D dengan sampel 31P dan 32O. Pada Sampel 31D dan 32D masing-masing membentuk enam dengan ukuran 428 bp ‒ 1934 bp dan sembilan amplikon dengan ukuran 156 bp ‒ 1756 bp. Sedangkan pada sampel 31P dan 32O pada tiap masing-masingnya hanya membentuk dua amplikon dengan ukuran 738 bp ‒ 843 bp dan satu amplikon dengan ukuran 738 bp. Seperti yang telah diduga pada paragraf sebelumnya, hal ini disebabkan oleh tiap-tiap bagian tanaman membentuk biosintesis beta karoten yang berbeda. Perbedaan tingkat kandungan metabolit sekunder yang diproduksi pada tiap bagian tanaman diduga menjadi salah satu penyebab terjadinya perbedaan amplikon yang dihasilkan. Sebab diketahui bahwa kandungan metabolit sekunder pada tanaman dapat mengganggu proses amplifikasi pada saat PCR.

Pita yang ada pada ukuran 738 bp dan 843 bp dapat teramplifikasi pada 35 sampel menunjukkan bahwa hampir setiap individu tanaman kelapa sawit secara konsisten memiliki gen yang menyandikan beta karoten pada ukuran pasangan basa tertentu. Dengan kata lain, primer Beta yang telah didesain oleh Putri et al. (2007) dapat dijadikan sebagai acuan marka molekuler genetik terhadap karakter beta karoten untuk tanaman kelapa sawit.

Tanaman kelapa sawit sebagai sampel yang memiliki jenis buah virescens dan nigrescens menghasilkan amplikon yang berbeda, dimana pada sampel dengan jenis buah virescens (6, 7, 9, 19, 21, 23, 25, 28, 30) membentuk amplikon lebih banyak yaitu rata-rata enam amplikon sedangkan sampel dengan jenis buah nigrescens (15, 16, 17, 18) terdapat sebanyak rata-rata tiga amplikon. Hal ini diduga disebabkan oleh jenis buah virescens yang memiliki kandungan karotenoid lebih tinggi dibandingkan dengan jenis buah nigrescens yang mengandung lebih banyak antosianin. Pernyataan ini didukung oleh Sambanthamurthi et al. (2000) yang menyatakan bahwa buah nigrescens mengakumulasi antosianin dalam jumlah yang besar sehingga menyebabkan warnanya ungu gelap hingga hitam pada bagian ujung buah dan kuning pada bagian dasar saat belum matang, dengan perubahan warna yang sedikit dari bagian ujungnya saat pematangan. Buah virescens berwarna hijau saat belum matang, dan menjadi oranye karena akumulasi karotenoid dan degradasi klorofil yang berhubungan dengan pematangan buah.

dari pita yang telah diskoring kemudian dianalisis dengan menggunakan software DAWwin 6.0.13 sehingga didapatkan hasil yaitu dendogram. Dendogram adalah pohon filogenetik yang menggambarkan pengelompokkan sampel dengan Operational Taxonomic Unit (OTU) yang berderet rata secara vertikal pada satu sisi yang berbentuk pohon. Setiap cabang pada dendogram dilakukan analisis kepercayaan cabang dengan metode bootstrap yang dilakukan sampai 1000 kali. Pada penelitian ini diketahui bahwa 38 sampel DNA stok kelapa sawit terbagi menjadi tiga kelompok utama yang masing-masing memiliki sub-kelompok. Kelompok pertama (sampel 23D, 23B, 28D, 25D, 25B, 30B, 19D, 30D, 21D, 21B, 35D, 34D, 9D, 31D, 17D, 7D, 7B, 36D, 15D, 6D, 18D, dan 33D), kelompok kedua (sampel 15B, 6B, 16B, 16D, 18B, 31P, 32O, 19B, 33A, 9B, 17B, 36A, 34A, 35A, dan 32D), dan kelompok ketiga (sampel 28B). Hasil analisis faktorial untuk PCoA juga menunjukkan bahwa keragaman secara molekuler menggunakan primer Beta adalah sebesar 56.19 %. Hal ini menunjukkan bahwa adanya variasi genetik di antara sampel yang satu dengan sampel lainnya menyebabkan perbedaan yang dapat dibedakan atau dikelompokkan dengan jelas. Keragaman genetik yang tinggi membuka peluang yang besar untuk mendapatkan kultivar unggul.

Profil amplikon dari 38 sampel yang diamplifikasi menggunakan primer Beta menunjukkan adanya pita spesifik. Pita spesifik yang tidak ditemukan pada sampel yang lain hanya terdapat pada sampel 19D (isolasi DNA dari daun origin WA dan jenis buah virescens) dengan ukuran 462 bp, 23D (isolasi DNA dari daun origin WA dan jenis buah virescens) dengan ukuran 354 bp dan 32D (isolasi DNA dari daun origin Deli) dengan ukuran 156 bp. Dari hal ini dapat diambil

kesimpulan bahwa primer Beta juga dapat dijadikan sebagai marka molekuler yang menggambarkan keunikan suatu individu secara genetik yang dapat dijadikan sebagai identitas individu tersebut. Hal ini sesuai dengan pernyataan Karsinah (2002) yang mengemukakan dalam penelitiannya menggunakan primer RAPD terhadap plasma nutfah jeruk bahwa pita-pita spesifik dapat memberi harapan sebagai identifikasi kultivar. Ditemukannya pita spesifik sebagai pembeda dengan kultivar lainnya sangat penting dalam identifikasi bibit pada tahap awal.

KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan

Hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan marka molekuler terkait karakter beta karoten pada tanaman kelapa sawit (primer Beta) menunjukkan pola pita (amplikon) yang beragam sebanyak 16 amplikon. Persentase polimorfisme yang dihasilkan sebesar 100%. Terdapat perbedaan pola pita pada sampel yang berasal dari individu yang sama tetapi berbeda sumber bagian tanaman yang diisolasi. Pada penelitian ini diperoleh fragmen pita polimorfik dengan ukuran berkisar ± 156 bp ‒ 3029 bp. Keragaman molekuler dari 38 sampel DNA stok kelapa sawit yaitu sebesar 56.19 % dan analisis dendogram menunjukkan semua sampel terbagi menjadi 3 kelompok utama.

Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui tingkat ekpresi gen pada tiap bagian tanam yang diisolasi dan menganalisis sekuen dari amplikon primer Beta dari sampel-sampel yang terlihat untuk mendapatkan informasi lebih banyak terkait parsial fragmen gen yang menyandi lintasan biosintesis beta karoten.

TINJAUAN PUSTAKA Botani Tanaman

Klasifikasi tanaman kelapa sawit menurut Allorerung et al. (2010) adalah Kingdom: Plantae, Divisi: Embryophyta siphonagama, Kelas: Angiospermae, Ordo: Monocotyledonae, Famili: Arecaceae (Dahulu Palmae), Sub-famili: Cocoideae, Genus: Elaeis, Spesies: Elaeis guineensis Jacq.

Sebagaimana tanaman monokotil, kelapa sawit memiliki akar serabut yang terdiri dari akar utama, akar sekunder, akar tersier, dan akar rambut. Akar utama (primer) merupakan akar yang pertumbuhannya lurus vertikal ke bawah, searah pusat bumi. Fungsi utama akar primer adalah menunjang batang agar batang tetap berdiri kokoh. Akar sekunder dan akar tersier biasanya menyebar secara horizontal hingga radius yang sama panjang daun, pada zontal hingga radius yang sama dengan panjang daun, pada kedalaman kurang dari 150 cm, bahkan sebagian muncul ke permukaan tanah. fungsi utama akar sekunder adalah menjangkau unsur hara dan air dalam tanah (Hadi, 2004).

Batang kelapa sawit tumbuh tegak (phototrophy) dibalut oleh pangkal pelepah daun. Batang berbentuk silinderis dan mempunyai diameter 45 - 60 cm pada tanaman dewasa. Bagian bawah umumnya lebih besar (gemuk) di sebut bongkol batang atau bowl. Sampai tanaman berumur 3 tahun batang belum terlihat karena masih terbungkus kelapa yang belum tunas. Tergantung dari varietas dan kondisi lingkungannya yaitu pupuk yang diberikan, iklim, kerapatan tanam; kecepatan tumbuh pertahun rata-rata 20 - 60 cm. Tinggi tanaman juga sangat

Daun terdiri atas tangkai daun (petiole) yang apada kedua tepinya terdapat dua baris duri (spines). Tangkai daun bersambung dengan tulang daun utama (rachis), yang jauh lebih panjang dari tangkaiaa dan pada kiri-kanannya terdapat anak-anak daun (pinna; pinnata). Daun pertama yang keluar pada stadium benih berbentuk lanset (lanceolate), beberapa minggu kemudian berbentuk daun seperti bulu (pinnate) atau menyirip. Misalnya pada bibit berumur lima bulan susunan daun terdiri atas 5 lanset, 4 berbelah dua dan 10 berbentuk buluh . susunan daun kelapa mirip dengan kelapa (nyiur), yaitu membentuk daun menyirip (Mangoensoekarjo dan Semangun, 2008).

Susunan bunga terdiri dari karangan bunga yang terdiri dari bunga jantan (tepung sari) dan bunga betina (putik). Namun, ada juga tanaman kelapa sawit yang hanya memproduksi bunga jantan. Umumnya bunga jantan dan bunga betina terdapat dalam dua tandan yang terpisah. Namun, adakalanya bunga jantan dan betina terdapat dalam tandan yang sama. Bunga jantan selalu masak lebih dahulu pada bunga betina. Karena itu, penyerbukannya sendiri antara bunga jantan dan betina dalam satu tandan sangat jarang terjadi. Masa reseptif (masa putik dapat menerima tepung sari) adalah 3 x 24 jam. Setelah itu, putik akan berwarna hitam dan mengering (Sastrosayono, 2003).

Hasil utama perkebunan kelapa sawit adalah buah kelapa sawit. Selanjutnya, buah kelapa sawit di proses (ekstraksi) di pabrik penggiling (mill) sehingga menghasilkan ekstrak, berupa minyak kelapa sawit yang mentah atau CPO (Crude Palm Oil) dan minyak kelapa sawit KPO (Kernel Palm Oil). Tandan bunga betina yang telah menjadi buah disebut tandan buah segar (TBS). Setiap TBS pada tanaman dewasa umumnya terdiri dari 1.000 - 2.000 buah. Setiap buah

berdiameter 1,5 - 3 cm. Berat setiap butir buah adalah 10 – 30 g, sehingga satu TBS pada tanaman dewasa beratnya mencapai 10- 40 kg. Pada umur 3 tahun atau saat tanaman berbuah untuk pertama kali, berat TBS adalah 3 – 6 kg (Soehardjo, 1999).

Pada umumnya tanaman kelapa sawit menghasilkan jenis buah nigrescens atau virescens (Hartley, 1988). Buah nigrescens mengakumulasi antosianin dalam jumlah yang besar sehingga menyebabkan warnanya ungu gelap hingga hitam pada bagian ujung buah dan kuning pada bagian dasar saat belum matang, dengan perubahan warna yang sedikit dari bagian ujungnya saat pematangan. Buah virescens berwarna hijau saat belum matang, dan menjadi oranye karena akumulasi karotenoid dan degradasi klorofil yang berhubungan dengan pematangan buah (Sambanthamurthi et al., 2000).

Dalam kondisi utuh (tidak pecah), biji kelapa sawit bersifat dorman sampai sekitar enam bulan. Kondisi dorman ini dapat dipatahkan, antara lain dengan pemanasan biji (Mangoensoekarjo dan Semangun, 2008).

Syarat Tumbuh

Curah hujan yang ideal berkisar 2.000 – 3.500 mm/th yang merata sepanjang tahun dengan minimal 100 mm/bulan. Di luar kisaran tersebut tanaman akan mengalami hambatan dalam pertumbuhan dan berproduksi. Curah hujan antara 1700 – 2.500 mm/th dan 3.500 – 4.000 mm/th menyebabkan tanaman akan mengalami sedikit hambatan. Di lokasi dengan curah hujan kurang dari 1.450 mm/th dan lebih dari 5.000 mm/th sudah tidak sesuai untuk sawit. Suhu

sangat erat kaitannya dengan tinggi tempat di atas permukaan laut (dpl). Tinggi tempat optimal adalah 200 m dpl, dan disarankan tidak lebih dari 400 m dpl, meskipun di beberapa daerah, seperti di Sumatera Utara, dijumpai pertanaman sawit yang cukup baik hingga ketinggian 500 m dpl. Di daerah yang banyak berawan menyebabkan intensitas matahari yang diterima daun sawit menjadi lebih rendah. Sebaliknya meskipun curah hujan relatif tinggi tetapi lebih banyak terjadi sore hingga malam dan perawanan kurang, maka intensitas matahari bias cukup untuk mendukung fotosintesis yang tinggi. Makin tinggi tempat, suhu makin rendah dan biasanya disertai perawanan yang lebih lama atau curah hujan yang tinggi dan makin menjauh dari garis khatulistiwa penyinaran matahari makin berkurang. Kelapa sawit memerlukan lama penyinaran antara 5 dan 12 jam/hari (Allorerung et al., 2010).

Kelapa sawit dapat tumbuh pada jenis tanah Podzolik, Latosol, Hidromorfik Kelabu, Alluvial atau Regosol, tanah gambut saprik, dataran pantai

dan muara sungai. Tingkat keasaman (pH) yang optimum untuk sawit adalah 5,0 – 5,5. Kelapa sawit menghendaki tanah yang gembur, subur, datar, berdrainase

(beririgasi) baik dan memiliki lapisan solum cukup dalam (80 cm) tanpa lapisan padas. Kemiringan lahan pertanaman kelapa sawit sebaiknya tidak lebih dari 15o (Kiswanto et al., 2008).

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik sederhana yang digunakan untuk memperbanyak molekul DNA secara invitro di dalam laboratorium. Hasil perbanyakan molekul DNA sangat banyak, karena jumlah perbanyakan molekul DNA bertambah secara eksponensial. Oleh sebab itu, ribuan

molekul DNA dapat dibuat dalam waktu yang singkat. PCR dapat diaplikasikan dalam analisis genetik, seperti: diagnosis medis, dan forensik. PCR merupakan metode yang sangat sensitif sehingga dari satu pasang molekul DNA dapat diperbanyak menjadi jutaan kali lipat setelah 30 - 40 siklus PCR (Mullis, 1990).

PCR banyak digunakan untuk banyak keperluan karena memiliki beberapa keuntungan diantaranya cepat, memerlukan DNA dalam jumlah yang sedikit, dan dapat dilakukan pada tahap dini dengan teknik isolasi DNA sederhana. Hal-hal yang mempengaruhi keberhasilan dalam reaksi PCR adalah sekuen primer, dNTP, enzim polymerase, dan suhu annealing (Graham, 1997).

Kemajuan teknologi telah memungkinkan para ilmuan untuk meniru urutan nukleotida suatu gen dengan cara melakukan amplifikasi DNA dengan teknik reaksi berantai polimerase (PCR). Amplifikasi DNA dilakukan secara in vitro (di dalam tabung) dengan menggunakan: (1) enzim DNA polymerase; (2) dNTP (dinukleotida triphosphat; (3) oligonukleotida primer; dan (4) molekul DNA cetakan (DNA template) (Yuwono, 2006).

Reaksi PCR secara umum dilakukan dalam empat tahap. Molekul DNA rantai ganda akan diurai menjadi molekul tunggal dengan pemanasan. Primer akan menempel pada molekul DNA rantai tunggal pada tempat yang sudah ditentukan. Selanjutnya enzim polimerase akan memperpanjang primer dengan basa nitrogen yang tersedia. Tahapan tersebut merupakan cara untuk menggandakan molekul DNA yang diinginkan (Mullis, 1990). Tahap peleburan (melting) atau denaturasi merupakan tahap awal reaksi yang berlangsung pada suhu tinggi, yaitu 94 – 96 °C

(sampai 5 menit) untuk memastikan semua utas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi template bagi primer. Tahap kedua adalah penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA template yang komplementer uruta basanya. Hal ini dilakukan pada suhu antara 45 – 60°C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Tahap ketiga adalah pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA-polimerase yang dipakai. Proses ini biasanya menggunakan Taq-polimerase dan dilakukan pada suhu 72°C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Setelah tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Tahap 4 menunjukkan perkembangan yang terjadi pada siklus-siklus selanjutnya. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa utas baru menjadi template bagi primer lain dan akhirnya terdapat utas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial. Tahapan amplifikasi DNA dapat dilihat pada Gambar 1.

Perlu diingat bahwa di dalam proses PCR effisiensi amplifikasi tidak terjadi 100 %, hal ini disebabkan oleh target templat terlampau banyak, jumlah polimerase DNA terbatas, dan kemungkinan terjadinya reannealing untai target. Ukuran primer yang pendek kemungkinan terjadinya mispriming (penempelan primer di tempat lain yang tidak diinginkan) tinggi, ini akan menyebabkan berkurangnya spesifisitas dari primer tersebut yang nantinya akan berpengaruh juga pada efektifitas dan efisiensi proses PCR (Handoyo dan Rudiretna, 2000).

Genetik Beta Karoten

Didapati nilai duga heritabilitas arti luas yang tinggi sebesar 84,8% untuk karakter kandungan beta karoten pada tanaman kelapa sawit. Hal ini mengindikasikan adanya peran efek gen aditif. Dapat diambil kesimpulan bahwa faktor genetik untuk karakter kandungan beta karoten lebih berperan dari pada faktor lingkungan (Putri, 2010).

Heritabilitas beta karoten pada gandum durum (Santra et al., 2005) dan sorghum (Reddy et al., 2005) bervariasi mulai 67 hingga 99%. Nilai duga heritabilitas pada selada dan jagung lebih rendah namun tergolong cukup tinggi yaitu 50,81%. Studi sebelumnya telah disepakati bahwa faktor lingkungan berpengaruh sangat kecil sekali terhadap karakter karotenoid.

Moehs et al. (2001) menyebutkan dalam penelitiannya bahwa dalam lintasan metabolisme pembentukan kandungan beta karoten pada buah, yang berperan adalah enzim kunci yaitu lycopene β-cyclase, yang diduga dikendalikan oleh satu gen (single gen) yaitu gen lycopene β-cyclase, sehingga nilai duga

varietas tanaman tomat beta karoten rendah dengan varietas beta karoten tinggi telah diteliti. Gen tunggal yang dinyatakan sebagai gen B, didapatkan untuk pewarisan beta karoten berdasarkan analisis populasi F1, F2, dan Fa dari persilangan tersebut. Gen ini diyakini berperan sebagai lycopene untuk membentuk beta karoten. Gen-gen yang lain diasumsikan fungsinya sebagai pengubah komponen yang lebih sederhana dari beta karoten seperti zeta karoten dan phytofluene menjadi lycopene pada saat gen tersebut ada dalam keadaan heterozigot atau homozigot dominan (Lincoln, 1950).

Rasid et al., (2003) yang melakukan penelitian di Malaysia berhasil mendapatkan fragmen sekuen DNA sebesar 675 bp melalui RT-PCR yang menyandi lycopene β-cyclase dari jaringan mesokarp kelapa sawit umur 17 minggu. Disebutkan di dalam penelitannya bahwa dugaan koding sekuen lycopene

β-cyclase kelapa sawit memiliki kesamaan 80% dengan lycopene β-cyclase dari

tanaman Narcisus pseudonarcissus, Sandersonia aurantiaca, Citrus sinensis dan Capsicum annuum yang berperan dalam pembentukan beta karoten. Penelitian amplifikasi RT-PCR oleh Rasid et al. (2008) pada E. oleifera telah berhasil melakukan kloning koding sekuen partial DNA untuk phytoene synthase gene.

Rasid et al. (2011) dalam penelitiannya menemukan bahwa secara

keseluruhan pola ekpresi gen target lycopene β-cyclase (lcyb) dan

lycopene ε-cyclase (lcye) mengindikasikan beberapa tingkatan regulasi diferensial

dari gen-gen ini dipengaruhi oleh stadia perkembangan maupun tipe jaringan tanaman kelapa sawit. Dalam jaringan mesokarp, lcyb terkespresi cukup tinggi pada mesokarp muda (5 minggu setelah anthesis (MSA)). Tingkatan ekspresi lalu menurun pada jaringan mesokarp berumur 7, 9, 11, 13, 15 MSA dan meningkat

lagi pada 17 dan 19 MSA hingga hampir menyamai tingkatan ekspresi gen pada 5 MSA. Sebaliknya tingkat ekspresi gen lcye rendah pada jaringan mesokarp di semua stadia.

Primer Spesifik

Primer berfungsi sebagai penginisiasi reaksi polimerase DNA secara in vitro. Tanpa primer reaksi polimerase DNA tidak akan terjadi meskipun enzim dan komponen lainnya sedah tersedia. Selain itu, primer bertanggung jawab untuk mengenali dan menandai fragmen sampel DNA (template DNA) yang akan diamplifikasi (Zein dan Prawiradilaga, 2013).

Beberapa teknik analisis keanekaragaman genetik seperti RAPD, RFLP, dan DGGE membutuhkan amplifikasi daerah genom tertentu dari suatu organisme. Amplifikasi ini membutuhkan primer spesifik (sekuen oligonukelotida khusus) untuk daerah tersebut. Primer biasanya terdiri dari 10 - 20 nukleotida dan dirancang berdasarkan daerah konservatif dalam genom tersebut. Makin panjang primer, makin harus spesifik daerah yang diamplifikasi. Jika suatu kelompok organisme memang berkerabat dekat, maka primer dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah tertentu yang sama dalam genom kelompok tersebut. Beberapa faktor seperti konsentrasi DNA contoh, ukuran panjang primer, komposisi basa primer, konsentrasi ion Mg, dan suhu hibridisasi primer harus dikontrol dengan hati-hati agar dapat diperoleh pita-pita DNA yang utuh dan baik (Suryanto, 2003).

ujung 3’-OH rantai DNA cetakan yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan selama 1 - 2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikan menjadi 72oC selam 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polimerase akan melakukan proses polimerase rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerase, rantai DNA akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hidrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA yang baru hasil polimerase selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikan suhu inkubasi menjadi 95oC. Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerase berikutnya (Yuwono, 2006).

Memilih primer yang sesuai mungkin adalah faktor tunggal yang paling penting mempengaruhi polymerase chain reaction (PCR). Amplifikasi spesifik dari target yang diharapkan membutuhkan primer yang tidak dapat cocok dengan target lainnya pada beberapa orientasi dan dalam jarak tertentu yang memungkinkan terjadinya proses amplifikasi yang tidak diinginkan. Proses mendesain primer spesifik pada umumnya melibatkan dua tahap. Pertama, daerah apit primer yang diinginkan dapat diciptakan baik secara manual ataupun menggunakan software tool; lalu dicari database sekuen nukleotida yang sesuai menggunakan alat seperti BLAST untuk mengamati target-target potensial (Ye et al., 2012)

PENDAHULUAN Latar Belakang

Kelapa sawit adalah penghasil minyak nabati terbesar di dunia karena minyaknya dapat diproduksi baik dari serabut buah maupun inti. Minyak tersebut dapat digunakan sebagai minyak masak, minyak industri, maupun bahan bakar (biodiesel). Keunggulannya yang lain diantaranya sifatnya yang tahan oksidasi dengan tekanan tinggi dan kemampuannya melarutkan bahan kimia yang tidak larut oleh bahan pelarut lainnya, serta daya melapis yang tinggi membuatnya dapat digunakan untuk berbagai macam keperluan (Kemendag, 2013).

Peningkatan perhatian konsumen minyak nabati akan nilai nutrisi dan kesehatan menjadi tuntutan permintaan masyarakat saat ini. Menurut Mangoensoekarjo dan Semangun (2008), diantara jenis-jenis tanaman penghasil minyak nabati, kelapa sawit termasuk tanaman yang potensi produksi minyaknya tertinggi. Sastrosayono (2003) menyatakan potensi produksi minyak nabati kelapa sawit per hektar mencapai 6 ton per tahun, bahkan lebih. Jika di bandingkan dengan tanaman penghasil minyak lainnya (4,5 ton per tahun), tingkat produksi ini termasuk tinggi. Melalui program-program pemuliaan yang mutakhir, potensi ini dapat ditingkatkan lagi.

Kelapa sawit adalah tanaman penghasil minyak nabati yang dapat diandalkan, karena minyak yang dihasilkan memiliki berbagai keunggulan dibandingkan dengan minyak yang dihasilkan oleh tanaman lain. Minyak kelapa sawit mengandung beta-karoten yang cukup tinggi, berkisar antara 500 - 700 ppm, yang

(Mangoensoekarjo dan Semangun, 2008) dan mengandung retinol 15 kali lebih

banyak dari wortel, 300 kali lebih banyak dari tomat (Malaysian Palm Oil Board, 2003).

Karotenoid itu sendiri pada manusia berfungsi sebagai sumber vitamin A. Karotenoid diasosiasikan dengan berbagai macam kegunaannya untuk kesehatan, diantaranya sebagai antioksidan bagi tubuh, meningkatkan sistem imun, mengurangi resiko beberapa jenis kanker dan penyakit kardiovaskular, juga mengurangi resiko katarak (Olson, 1999).

Karakter kandungan beta karoten pada tanaman kelapa sawit memiliki nilai heritabilitas yang tinggi. Berdasarkan penelitian Putri (2010) didapati bahwa nilai duga heritabilitas arti luas karakter tersebut sebesar 84,8%. Dari hal ini dapat disimpulkan bahwa karakter kandungan beta karoten pada tanaman kelapa sawit lebih banyak dipengaruhi oleh faktor genetik ketimbang faktor lingkungan.

Pemuliaan konvensional memiliki beberapa keterbatasan, diantaranya waktu yang diperlukan untuk memasukkan/introgresi gen-gen yang diinginkan dan jumlah genotipe yang harus ditangani pada saat awal-awal seleksi yang besar sehingga membutuhkan tenaga kerja dalam jumlah yang sangat besar. Oleh sebab itu, diperlukan penggunaan teknologi baru untuk membantu meringankan pekerjaan pemulia tanaman, salah satunya adalah penggunaan marka molekuler. Penggunaannya dapat mempersingkat waktu yang dibutuhkan dalam melakukan seleksi dan menentukan apakah gen yang diinginkan benar-benar ada dalam tanaman terseleksi (Bahagiawati, 2011).

Usaha untuk memahami ataupun memodifikasi berbagai proses biologi pada tingkat molekuler, memerlukan tersedianya gen-gen yang terlibat di dalam

proses tersebut termasuk informasi yang terkait dengan gen-gen tersebut. Untuk itu diperlukan adanya pelacak spesifik gen yang dapat mengidentifikasi keberadaannya maupun ekspresinya dengan cara yang mudah namun akurat. Ada beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk mengembangkan pelacak spesifik tersebut. Pendekatan yang memanfaatkan kemajuan bioinformatika dan teknik PCR, saat ini merupakan salah satu cara yang relatif mudah yang dapat dilakukan (Santoso, 2006).

Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Desain primer yang tepat adalah salah satu faktor yang paling penting dalam keberhasilan sekuensing DNA. Beberapa teknik analisis keanekaragaman genetik seperti RAPD, RFLP, dan DGGE membutuhkan amplifikasi daerah genom tertentu dari suatu organisme. Amplifikasi ini membutuhkan primer spesifik (sekuen oligonukelotida khusus) untuk daerah tersebut. Primer biasanya terdiri dari 10 - 20 nukleotida dan dirancang berdasarkan daerah konservatif dalam genom tersebut. Makin panjang primer, makin harus spesifik daerah yang diamplifikasi (Suryanto, 2003).

Penelitian menggunakan primer spesifik untuk mengidentifikasi gen-gen tertentu telah banyak dilakukan. Santoso (2006) dalam penelitiannya berhasil mendapatkan dua pasang primer DNA yang dirancang menggunakan dasar daerah terkonservasi. Pengujian di tingkat genom kakao dengan teknik PCR membuktikan bahwa kedua pasangan primer tersebut dapat mengamplifikasi secara spesifik gen penyandi protein target. Baik PCR dengan pasangan primer

menghasilkan dua amplikon yang ukurannya sesuai dengan ukuran prediksi, yaitu sekitar 465 dan 160 pb-an.

Primer untuk lycopene �-cyclase berhasil dirancang berdasarkan daerah homologi gen pada beberapa spesies tanaman menggunakan akses internet dan dapat digunakan mengamplifikasi fragmen DNA kelapa sawit dengan menghasilkan satu atau lebih amplikon (pita). Desain PRIMER3 mampu menghasilkan primer spesifik Beta-F dan Beta-R dengan produk PCR sebesar 578 bp. Parsial fragmen gen target yang berperan dalam lintasan metabolisme yang menghasilkan beta karoten berhasil diisolasi dari kelapa sawit dalam bentuk genomik klon (Putri et al., 2007).

Berdasarkan latar belakang di atas penulis tertarik untuk melakukan penelitian guna mengidentifikasi fragmen DNA genomik kelapa sawit hasil PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk beta karoten.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi fragmen DNA genomik kelapa sawit hasil PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk beta karoten.

Kegunaan Penulisan

Sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar sarjana pertanian di Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara, Medan dan sebagai bahan informasi bagi pihak yang membutuhkan.

Manfaat Penelitian

Manfaat yang diperoleh dari mengidentifikasi fragmen DNA genomik kelapa sawit hasil PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk beta karoten adalah tersedianya beberapa informasi mengenai gen yang memetakan lintasan

biosintesis beta karoten pada tanaman kelapa sawit dalam usaha menghasilkan tanaman kelapa sawit unggul dengan kandungan beta karoten yang tinggi.

oil with PCR products using specific primer for beta carotene, supervised by LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI and REVANDY I. M. DAMANIK.

The aim of the research was to identify genomic DNA fragments of palm oil with PCR products by using spesific primer for beta carotene. This research was conducted in Plant Tissue Culture Laboratory, Faculty of Agriculture, University of Sumatera Utara and Bio Molecular Laboratory PT. Socfin Indonesia SSPL Bangun Bandar, Dolok Masihul, Serdang Bedagai-Sumatera Utara, from February to August 2016. A total of 38 palm oil samples issued by PT. Socfin Indonesia was identified using specific Beta primer of molecular marker for beta carotene

The results showed band patterns a total of 16 amplicons. Polymorphism percentage was indicated at 100%. There was differences in band patterns on samples derived from the same individual but different sources of isolated plant

tissues. In this research DNA fragments was obtained ranged from ± 156 ‒ 3029

bp. Dendogram analysis spread 38 samples into three main groups and molecular diversity that can be explained using Beta primer was 56.19 %.

(Elaeis guineensis Jacq.) Hasil PCR (Polymerase Chain Reaction) Menggunakan Primer Spesifik untuk Beta Karoten, dibimbing oleh LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI dan REVANDY I. M. DAMANIK.

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi fragmen DNA genomik kelapa sawit hasil PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk beta karoten. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara dan Laboratorium Bio Molekuler PT. Socfin Indonesia SSPL Bangun Bandar, Dolok Masihul, Serdang

Bedagai-Sumatera Utara, dimulai dari bulan Februari hingga Agustus 2016. Sebanyak 38 sampel dari tanaman kelapa sawit yang dikeluarkan oleh PT. Socfin Indonesia diidentifikasi menggunakan marka molekuler primer spesifik Beta untuk karakter beta karoten.

Hasil penelitian menunjukkan pola pita sebanyak 16 amplikon. Persentase polimorfisme yang dihasilkan sebesar 100%. Terdapat perbedaan pola pita pada sampel yang berasal dari individu yang sama tetapi berbeda sumber bagian tanaman yang diisolasi. Pada penelitian ini diperoleh fragmen DNA dengan ukuran berkisar ± 156 bp ‒ 3029 bp. Analisis dendogram membagi 38 sampel menjadi tiga kelompok utama dan keragaman molekuler yang dapat dijelaskan dengan primer Beta sebesar 56.19 %.

IDENTIFIKASI FRAGMEN DNA GENOMIK KELAPA SAWIT (Elaeis guineensis Jacq.) HASIL PCR (Polymerase Chain Reaction) MENGGUNAKAN PRIMER SPESIFIK

UNTUK BETA KAROTEN

SKRIPSI

OLEH :

ALEXANDER M. LUTHFI / 110301249 PEMULIAAN TANAMAN

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2016

IDENTIFIKASI FRAGMEN DNA GENOMIK KELAPA SAWIT (Elaeis guineensis Jacq.) HASIL PCR (Polymerase Chain Reaction) MENGGUNAKAN PRIMER SPESIFIK

UNTUK BETA KAROTEN

SKRIPSI

OLEH :

ALEXANDER M. LUTHFI / 110301249 PEMULIAAN TANAMAN

Skripsi Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mendapatkan Gelar Sarjana Pertanian

di Program Studi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan

Judul : Identifikasi Fragmen DNA Genomik Kelapa Sawit

(Elaeis guineensis Jacq.) Hasil PCR (Polymerase Chain Reaction) Menggunakan Primer Spesifik

Untuk Beta Karoten Nama : Alexander M. Luthfi

NIM : 110301249

Prodi : Agroekoteknologi Minat Studi : Pemuliaan Tanaman

Disetujui oleh : Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Lollie Agustina P.Putri, M.Si Ir. Revandy Iskandar M. Damanik,M.Si, M.Sc, Ph.D

Ketua Anggota

Mengetahui :

Prof. Dr. Ir. T. Sabrina, M.Sc Ketua Program Studi Agroekoteknologi

oil with PCR products using specific primer for beta carotene, supervised by LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI and REVANDY I. M. DAMANIK.

The aim of the research was to identify genomic DNA fragments of palm oil with PCR products by using spesific primer for beta carotene. This research was conducted in Plant Tissue Culture Laboratory, Faculty of Agriculture, University of Sumatera Utara and Bio Molecular Laboratory PT. Socfin Indonesia SSPL Bangun Bandar, Dolok Masihul, Serdang Bedagai-Sumatera Utara, from February to August 2016. A total of 38 palm oil samples issued by PT. Socfin Indonesia was identified using specific Beta primer of molecular marker for beta carotene

The results showed band patterns a total of 16 amplicons. Polymorphism percentage was indicated at 100%. There was differences in band patterns on samples derived from the same individual but different sources of isolated plant

tissues. In this research DNA fragments was obtained ranged from ± 156 ‒ 3029

bp. Dendogram analysis spread 38 samples into three main groups and molecular diversity that can be explained using Beta primer was 56.19 %.

(Elaeis guineensis Jacq.) Hasil PCR (Polymerase Chain Reaction) Menggunakan Primer Spesifik untuk Beta Karoten, dibimbing oleh LOLLIE AGUSTINA P. PUTRI dan REVANDY I. M. DAMANIK.

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi fragmen DNA genomik kelapa sawit hasil PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk beta karoten. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara dan Laboratorium Bio Molekuler PT. Socfin Indonesia SSPL Bangun Bandar, Dolok Masihul, Serdang

Bedagai-Sumatera Utara, dimulai dari bulan Februari hingga Agustus 2016. Sebanyak 38 sampel dari tanaman kelapa sawit yang dikeluarkan oleh PT. Socfin Indonesia diidentifikasi menggunakan marka molekuler primer spesifik Beta untuk karakter beta karoten.

Hasil penelitian menunjukkan pola pita sebanyak 16 amplikon. Persentase polimorfisme yang dihasilkan sebesar 100%. Terdapat perbedaan pola pita pada sampel yang berasal dari individu yang sama tetapi berbeda sumber bagian tanaman yang diisolasi. Pada penelitian ini diperoleh fragmen DNA dengan ukuran berkisar ± 156 bp ‒ 3029 bp. Analisis dendogram membagi 38 sampel menjadi tiga kelompok utama dan keragaman molekuler yang dapat dijelaskan dengan primer Beta sebesar 56.19 %.

08 Agustus 1993 dari Ayahanda Ali Abuzar dan Ibunda Irzida Tanjung. Penulis merupakan putra kedua dari empat bersaudara.

Pendidikan formal yang pernah ditempuh adalah SD Muhammadiyah 31 Medan lulus pada tahun 2005, SMP Negeri 7 Medan lulus tahun 2008, pada tahun 2011 penulis lulus dari SMA Negeri 4 Medan dan pada tahun yang sama lulus seleksi penerimaan mahasiswa baru melalui jalur Ujian Masuk Bersama (UMB)

pada program studi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan kemudian memilih minat

Pemuliaan Tanaman.

Penulis melaksanakan Praktek Kerja Lapangan (PKL) di Kebun Papaso PT. Permata Hijau Group (PHG) Padang Lawas, Sumatera Utara pada bulan Juli sampai dengan Agustus 2014 dan penelitian di Socfindo Seed Production and Laboratories Bangun Bandar, Desa Martebing, Kecamatan Dolok Masihul, Kabupaten Serdang Bedagai, Sumatera Utara pada bulan Mei ‒ Agustus 2016.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis berkesempatan membantu dosen sebagai asisten dalam menjalankan praktikum Bioteknologi Sub Pemuliaan Tanaman tahun 2015, Dasar Pemuliaan Tanaman tahun 2015 ‒ 2016, Genetika Populasi dan Kuantitatif tahun 2015 ‒ 2016, Genetika Molekuler tahun 2015 ‒ 2016. Selain itu penulis menjadi anggota dalam organisasi Himpunan

rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Identifikasi Fragmen DNA Genomik Kelapa Sawit (Elaeis Guineensis Jacq.) Hasil PCR (Polymerase Chain Reaction) Menggunakan Primer Spesifik untuk Beta Karoten” yang merupakan salah satu syarat untuk mendapatkan gelar sarjana pertanian di Program Studi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan.

Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada Ibu Dr. Ir. Lollie Agustina P. Putri M.Si, selaku ketua pembimbing dan

Bapak Ir. Revandy I. M. Damanik, M.Si., M.Sc., Ph.D, selaku anggota pembimbing yang telah memberikan arahan dan bimbingan serta kritik dan saran sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Ucapan terimakasih juga

disampaikan kepada orang tua tercinta Ibunda Irzida Tanjung, Nenek Hj. Syamsimar Ali, Ayahanda Ali Abuzar atas kasih sayang, seluruh

dukungan, dan do’anya kepada penulis. Kepada saudara tersayang Muhammad Abuzar Algifari, Azalia Qatrunnada Rabbani, dan Irdiana Syahrani

atas semangat dan do’anya.

Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada pihak Socfindo Seed Production and Laboratories (SSPL) Bangun Bandar yaitu Bapak H. Indra Syahputra, Bapak Denny Arifiyanto, dan Bapak Dadang Afandi beserta seluruh staff, Kak Pipit, Bang Hanafi beserta seluruh karyawan yang telah memberikan izin serta membantu penulis dalam menyelesaikan penelitian. Kepada mentor Arnen Pasaribu, rekan sepenelitian Rika Hardianti, Ana Christin Simbolon, dan

Nurhadi Satrio, Nur Ismayani, Cut Tia Mardi, Dewi Maya Sari Sihombing, Yohana Marizsa Purba, Zulfah Siregar, Tria Mentari Siregar, Muhammad Isa, Radinal Muhammad Fikri Nasution, Iqbal Heryanto, Martin Binarta Ginting, Suardhi Tanjung, Ari Fradana Nasution, teman-teman Pemuliaan Tanaman 2011 ‒ 2013, dan Agroekoteknologi 2011 atas semangat, motivasi, dan bantuan selama penulis melaksanakan kuliah dan penelitian. Dan tidak lupa pula kepada seluruh dosen-dosen Fakultas Pertanian yang telah memberikan ilmu dan pembelajarannya sehingga penulis dapat menyelesaikan kuliahnya.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun demi kesempurnaan skripsi ini. Akhir kata semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi kita semua.

Medan, Desember 2016

Dian Arvita, laboran Kak Asni dan Bang Rudi, sahabat-sahabat terbaik Ario Wibowo, Adib Satria Sukma Nasution, Karno Andhika Pasaribu, Nurhadi Satrio, Nur Ismayani, Cut Tia Mardi, Dewi Maya Sari Sihombing,

Yohana Marizsa Purba, Zulfah Siregar, Tria Mentari Siregar, Muhammad Isa, Radinal Muhammad Fikri Nasution, Iqbal Heryanto, Martin Binarta Ginting, Suardhi Tanjung, Ari Fradana Nasution, teman-teman Pemuliaan Tanaman 2011 ‒ 2013, dan Agroekoteknologi 2011 atas semangat, motivasi, dan bantuan selama penulis melaksanakan kuliah dan penelitian. Dan tidak lupa pula kepada seluruh dosen-dosen Fakultas Pertanian yang telah memberikan ilmu dan pembelajarannya sehingga penulis dapat menyelesaikan kuliahnya.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun demi kesempurnaan skripsi ini. Akhir kata semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi kita semua.

Medan, Desember 2016

vi

DAFTAR ISI

ABSTRACT ... i

ABSTRAK ... ii

RIWAYAT HIDUP ... iii

KATA PENGANTAR ... iv

DAFTAR ISI ... vi

DAFTAR TABEL ... viii

DAFTAR GAMBAR ... ix

DAFTAR LAMPIRAN ... x

PENDAHULUAN Latar Belakang ... 1

Tujuan Penelitian ... 4

Kegunaan Penulisan ... 4

Manfaat Penelitian ... 4

TINJAUAN PUSTAKA Botani Tanaman ... 6

Syarat Tumbuh ... 8

PCR (Polymerase Chain Reaction) ... 9

Genetik Beta Karoten ... 12

Primer Spesifik ... 14

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ... 16

Bahan dan Alat Penelitian ... 16

Metode Penelitian ... 17

PELAKSANAAN PENELITIAN Pengambilan Sampel ... 18

Isolasi DNA ... 18

Uji Kuantitas ... 19

Uji Kualitas ... 20

Amplifikasi dan Genotiping ... 21

Elektroforesis ... 22

Analisis Data ... 22

Penentuan ukuran pita hasil PCR ... 22

Analisis hubungan genetik ... 22

Hasil ... 24

Uji kualitas ... 26

Keragaan primer spesifik dan ukuran pasangan basa pita ... 29

Analisis hubungan genetik ... 33

Pita spesifik ... 36

Pembahasan ... 36

KESIMPULAN DAN SARAN ... 42

Kesimpulan ... 42

Saran ... 42 DAFTAR PUSTAKA

viii

DAFTAR TABEL

No. Hal.

1. Proses amplifikasi PCR ... 22

2. Identitas sampel yang dikeluarkan oleh PT. Socfin Indonesia ... 25

3. Hasil Amplifikasi Produk PCR Primer Beta ... 30

4. Hasil Amplifikasi Produk PCR Primer Beta ... 31

DAFTAR GAMBAR

No. Hal.

1. Skema tahapan amplifikasi DNA pada PCR ... 11

2. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % ... 26

3. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % ... 26

4. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % ... 26

5. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % ... 27

6. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % ... 27

7. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % ... 27

8. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % ... 28

9. Profil uji kualitas DNA sampel kelapa sawit dengan gel agarose 2.0 % ... 28

10. Profil elektroforegram produk PCR primer Beta pada beberapa sampel kelapa sawit... 29

11. Profil elektroforegram produk PCR primer Beta pada beberap sampel kelapa sawit... 30

12. Profil elektroforegram produk PCR primer Beta pada beberapa sampel kelapa sawit... 31

13. Faktorial analisis PCoA (Principal Coordinates Analysis) aksis 1 (horizontal) dan aksis 2 (vertikal) dengan marka primer Beta ... 34

14. Profil filogenik Neighbor-Joining dari 38 sampel DNA stok kelapa sawit berdasarkan Matrix Dissimilarity Simple Matching... 35

x

DAFTAR LAMPIRAN

No. Hal.

1. Profil elektroforegram perbandingan primer SSR-3574 ... 46

2. Profil elektroforegram perbandingan primer SSR-3574 ... 46

3. Profil elektroforegram pengulangan proses PCR dengan Primer Beta pada sampel bagian akar ... 47

4. Profil elektroforegram yang dianalisis menggunakan UVITEC FIREREADER ... 47

5. Profil elektroforegram yang dianalisis menggunakan UVITEC FIREREADER ... 48

6. Pembuatan larutan stok dan buffer ... 48

7. Hasil uji kuantitas dengan nanospektrometer ... 51

8. Data binari skoring ... 52

9. Data PCoA (Principal Coordinates Analysis) ... 54

10. Data dissimilarity index ... 56

11. Data ukuran pasangan basa amplikon DNA ... 57

12. Data ukuran pasangan basa amplikon DNA ... 58

13. Data ukuran pasangan basa amplikon DNA ... 59