Optimasi metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik pada pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme - USD Repository

  

OPTIMASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE

TERBALIK PADA PEMISAHAN KLORAMFENIKOL DAN LIDOKAIN

HIDROKLORIDA DALAM SEDIAAN TETES TELINGA COLME ®

  

SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

  Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:

  Winarti H. Wibowo NIM: 088114039

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

  

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Kesuksesan itu jangan dilihat dari hasil yang dicapai tetapi lihatlah

dari proses hingga mendapatkan hasil yang dicapai tersebut”

  “Looking your dream, it’s like looking place far away. The important thing is don’t ever think about giving up, STAND UP again towards t he dream you’ll meet someday”

  

“Orang yang pesimistik selalu menemukan kesulitan dalam

setiap kesempatan. Orang yang optimistik justru menemukan

peluang disetiap kesempatan” –Lawrence P.J.-

  “Hidup itu keras, mampukan dirimu untuk bertahan di

  

setiap rintangan dan cobaan. Jadikan semua itu

pengalaman yang berarti dalam hidupmu”

  Karyaku ini kupersembahbahkan kepada: Keluargaku tercinta

  Sahabat-sahabat setiaku Teman-teman seperjuangan

  Almamaterku

  

PRAKATA

  Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan anugrah yang diberikan sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “Optimasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik pada Pemisahan Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dalam Sediaan Tetes Telinga Colme

  ®

  ” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini, penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  2. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah membimbing dan memberikan pengarahan, masukan dan saran selama berjalannya penelitian hingga berakhirnya penyusunan skripsi.

  3. Bapak Jeffry Julianus, M.Si. dan Ibu Dra. MM. Yetty Tjandrawati, M.Si. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membangun dalam penyusunan skripsi.

  4. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. dan Ibu Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku Dosen Pengajar yang telah bersedia menyediakan waktu untuk

  5. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan ilmu yang bermanfaat demi kemajuan mahasiswa dan mahasiswi dalam berkarya dalam bidang farmasi.

  6. PT. Interbat yang telah bersedia memberikan senyawa standar yang berguna bagi penelitian.

  7. Seluruh staf kemananan, staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma terutama Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto, Mas Otok, dan Pak Timbul yang telah banyak membantu selama penelitian di laboratorium dan menyediakan sarana untuk terselesaikannya seluruh kegiatan akademik dengan lancar.

  8. Martha Herati sebagai sahabat terdekatku yang selalu menyemangatiku untuk belajar dan mengenal arti kehidupan.

  9. Pakde, bude, mas sunu, mas damar, mas daru, mba vero yang menjadi keluargaku selama berada di Yogyakarta dan telah memberikan semangat, doa dan dukungan dalam penyusunan skripsi ini.

  10. Efrida Lusia Sari Tambunan dan Theresia Wijayanti sebagai teman seperjuangan skripsi dan tempat saling berbagi suka dan duka. Terima kasih atas semangat, doa, kegigihan dan kebersamaannya selama ini.

  11. Felicia, Prasilya dan Sasa sebagai teman seperjuangan skripsi satu tema yang selalu membantu dan memberikan semangat.

  12. Novi, Citra, Helena, Ayesa, Amel, Dina, Susi, Nona, Susan sebagai teman seperjuangan di laboratorium.

  13. Teman kelompok bermainku: Dea, Siska, Yessi, Lia, Lala yang selalu menyemangatiku dan memberikan saran, doa dan tempat saling berbagi suka dan duka.

  14. Semua teman-teman FST A yang telah menjadi teman terbaik selama berada di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

  15. Seluruh teman-teman Farmasi angkatan 2008, terima kasih atas pengalaman dan kebersamaan selama ini.

  16. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah membantu penulis dalam mewujudkan skripsi ini. Terima kasih atas dukungannya. Penulis menyadari bahwa masih di dalam skripsi ini masih banyak kekurangan. Oleh karena itu, segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan. Semoga skripsi ini membantu dan bermanfaat bagi pembaca dan dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

  Penulis

  

DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL ................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................ iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................... v LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ................................. vi PRAKATA ............................................................................................... vii DAFTAR ISI ............................................................................................ xi DAFTAR TABEL .................................................................................... xv DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xvi DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xix

  INTISARI ................................................................................................. xxi

  ABSTRACT ............................................................................................... xxii BAB I. PENGANTAR ..............................................................................

  1 A. Latar Belakang ....................................................................................

  1 1. Permasalahan ..................................................................................

  3 2. Keaslian penelitian..........................................................................

  3 3. Manfaat penelitian ..........................................................................

  4 B. Tujuan Penelitian..................................................................................

  4 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA .......................................................

  5

  B. Lidokain Hidroklorida ..........................................................................

  6 C. Obat Tetes Telinga ...............................................................................

  6 D. Spektrofotometer UV ...........................................................................

  7 E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .........................................................

  9 1. Pengenalan dan instrumentasi KCKT ................................................

  9

  2. Kromatografi partisi fase terbalik ..................................................... 12

  3. Pemisahan puncak dalam kromatografi ............................................ 13

  F. Landasan Teori ..................................................................................... 20

  G. Hipotesis .............................................................................................. 21

  BAB III. METODE PENELITIAN ........................................................... 22 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................ 22 B. Variabel Penelitian ............................................................................... 22

  1. Variabel bebas .................................................................................. 22

  2. Variabel tergantung ......................................................................... 22

  3. Variabel pengacau terkendali ........................................................... 22

  C. Definisi Operasional ............................................................................. 23

  D. Bahan-bahan Penelitian ........................................................................ 23

  E. Alat-alat Penelitian ............................................................................... 23

  F. Tata Cara Penelitian .............................................................................. 24

  1. Pembuatan fase gerak ....................................................................... 24

  2. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang digunakan untuk untuk penentuan panjang gelombang

  3. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang digunakan untuk optimasi dengan metode KCKT .................... 25

  4. Pembuatan campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida......... 26

  5. Penentuan panjang gelombang pengamatan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan spektrofotometer UV-Vis.................... 26

  6. Preparasi sampel ............................................................................. 26

  7. Optimasi pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan metode KCKT fase terbalik .................................................. 27 G. Analisis Hasil ....................................................................................... 29

  1. Bentuk peak pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida ..... 29

  2. Waktu retensi (t R ) ............................................................................. 30

  3. Nilai resolusi .................................................................................... 30

  4. Nilai HETP ...................................................................................... 31

  5. Reprodusibilitas ............................................................................... 31

  BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................. 32 A. Pemilihan Pelarut ................................................................................. 32 B. Pembuatan Fase Gerak ......................................................................... 32 C. Pembuatan Larutan Baku ...................................................................... 34 D. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dengan Spektrofotometer UV-Vis .................... 36 E. Optimasi Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dengan Metode KCKT Fase Terbalik ............................................................................ 40

  1. Fase gerak metanol:aquabides 75:25 dengan flow rate 0,8; 1,0; dan1,2 mL/menit .............................................................................. 46

  2. Fase gerak metanol:aquabides 85:15 dengan flow rate 0,8; 1,0; dan 1,2 mL/menit .................................................................................... 50

  3. Fase gerak metanol:aquabides 95:5 dengan flow rate 0,8; 1,0; dan 1,2 mL/menit .................................................................................... 54

  BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .................................................... 64 A. Kesimpulan .......................................................................................... 64 B. Saran .................................................................................................... 64 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 65 LAMPIRAN ............................................................................................. 68 BIOGRAFI PENULIS .............................................................................. 139

  DAFTAR TABEL . ...................................................................................................... Halaman

  Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT ............................ 11 Tabel II. Komposisi fase gerak metanol p.a:aquabides ......................... 24 Tabel III. Indeks polaritas campuran fase gerak metanol:aquabides ...... 33 Tabel IV. Waktu retensi baku kloramfenikol, baku lidokain hidroklorida dan baku campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida .......................................................................... 40

  2 Tabel V. Tekanan kolom (kgf/cm =kPa) ............................................. 44

  Tabel VI. Hasil optimasi kloramfenikol dan lidokain hidroklorida berdasar parameter Asymmetry Factor (AF) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25; 85:15; dan 95:5 pada flow

  rate 0,8; 1,0; dan 1,2 mL/menit ............................................. 45

  Tabel VII. Hasil optimasi flow rate baku campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan fase gerak metanol:aquabides 95:5 ...................................................................................... 58

  Tabel VIII. Data hasil perhitungan %CV waktu retensi baku campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida ............................... 60 Tabel IX. Data hasil perhitungan %CV nilai resolusi baku campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida ............................... 61 Tabel XII. Data hasil perhitungan %CV waktu retensi dan nilai resolusi kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes

  ®

  DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Struktur Kloramfenikol (D-treo-(-)-2,2-Dikloro-N-

  (β- hidroksi- α-(hidroksimetil)-p)nitrofenetilasetamida) ............. 5

  Gambar 2. Struktur Lidokain Hidroklorida (2-(Dietilamino)- 2’,6’- aetoksilidida monohidroklorida monohidrat) .......................

  6 Gambar 3. Instrumentasi KCKT .............................................................

  9 Gambar 4. Mekanisme pemisahan kromatografi partisi fase terbalik ...... 13 Gambar 5. Perhitungan bilangan lempeng teoritik .................................. 14 Gambar 6. Difusi Eddy .......................................................................... 15 Gambar 7. Transfer massa pada fase diam .............................................. 17 Gambar 8. Transfer massa pada fase gerak ............................................. 17 Gambar 9. Pemisahan dua senyawa ........................................................ 18 Gambar 10. Penentuan Peak Asymmetry dan Peak Tailing Factor ............ 20 Gambar 11. Distribusi analit dalam fase diam dan fase gerak ................... 20 Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom pada kloramfenikol ............ 37 Gambar 13. Gugus kromofor dan auksokrom pada lidokain hidroklorida . 37 Gambar 14. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 13 ppm (A) dan lidokain hidroklorida 300 ppm (B) .................. 37 Gambar 15. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 19,5 ppm (A) dan lidokain hidroklorida 450 ppm (B) ................. 38 Gambar 16. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 26

  Gambar 17. Interaksi kloramfenikol dengan fase diam C

  18

  (oktadesilsilan) melalui interaksi Van Der Waals................. 41 Gambar18. Interaksi lidokain hidroklorida dengan fase diam C

  18

  (oktadesilsilan) melalui interaksi Van Der Waals dan interaksi ion-dipol ............................................................... 41 Gambar 19. Interaksi hidrogen antara kloramfenikol dengan fase gerak metanol:aquabides ............................................................... 42 Gambar 20. Interaksi hidrogen antara lidokain hidroklorida dengan fase gerak metanol:aquabides ..................................................... 42 Gambar 21. Kromatogram kloramfenikol (A.1), lidokain hidroklorida

  (A.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow

  rate 0,8 mL/menit ............................................................... 46

  Gambar 22. Kromatogram kloramfenikol (B.1), lidokain hidroklorida (B.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow

  rate 1,0 mL/menit................................................................ 47

  Gambar 23. Kromatogram kloramfenikol (C.1), lidokain hidroklorida (C.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow

  rate 1,2 mL/menit................................................................ 48

  Gambar 24. Kromatogram kloramfenikol (A.1), lidokain hidroklorida (A.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 85:15 dan flow

  rate 0,8 mL/menit................................................................ 50

  Gambar 25. Kromatogram kloramfenikol (B.1), lidokain hidroklorida (B.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 85:15 dan flow

  rate 1,0 mL/menit ................................................................. 51

  Gambar 26. Kromatogram kloramfenikol (C.1), lidokain hidroklorida (C.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 85:15 dan flow

  rate 1,2 mL/menit ................................................................. 52

  Gambar 27. Kromatogram kloramfenikol (A.1), lidokain hidroklorida (A.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 95:5 dan flow

  rate 0,8 mL/menit ................................................................. 54

  Gambar 28. Kromatogram kloramfenikol (B.1), lidokain hidroklorida (B.2), baku campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida (B.3) dengan fase gerak metanol:aquabides 95:5 dan flow rate 1,0 mL/menit ........................................... 55

  Gambar 29. Kromatogram kloramfenikol (C.1), lidokain hidroklorida (C.2), baku campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida (C.3) dengan fase gerak metanol:aquabides 95:5 dan flow rate 1,2 mL/menit ........................................... 56

  Gambar 30. Kromatogram kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam

  ®

  sediaan tetes telinga Colme pada replikasi 1, replikasi 2, dan replikasi 3 dengan komposisi fase gerak dan flow rate hasil optimasi........................................................................ 62

  DAFTAR LAMPIRAN

  Halaman Lampiran 1. Sertifikat analisis kloramfenikol ......................................... 69 Lampiran 2. Sertifikat analisis lidokain hidroklorida .............................. 70 Lampiran 3. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerak metanol:aquabides (75:25) ................................................. 71 Lampiran 4. Nilai Asymmetry Factor (AF) peak kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides

  (75:25) dan contoh perhitungannya .................................... 77 Lampiran 5. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerak metanol:aquabides (85:15) ................................................. 79 Lampiran 6. Nilai Asymmetry Factor (AF) peak kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides

  (85:15) dan contoh perhitungannya .................................... 85 Lampiran 7. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerak metanol:aquabides (95:5) ................................................... 87 Lampiran 8. Nilai Asymmetry Factor (AF) peak kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides

  (95:5) dan contoh perhitungannya ...................................... 95 Lampiran 9. Nilai resolusi dan HETP pada fase gerak metanol:aquabides (95:5) dan contoh perhitungannya ........ 97 Lampiran 10. Reprodusibilitas: Kromatogram baku kloramfenikol, baku

  lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides (95:5) flow rate 1,0 mL/menit ............................................ 100

  Lampiran11. Reprodusibilitas: Kromatogram kloramfenikol dan

  ®

  lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme .. 127 Lampiran 12. Data hasil uji reprodusibilitas sistem dan perhitungan

  %CV .................................................................................. 130

  

INTISARI

  Kloramfenikol dan lidokain hidroklorida merupakan zat aktif yang

  ®

  terdapat dalam sediaan tetes telinga Colme . Dalam produk tetes telinga perlu adanya penjaminan mutu terkait kadar senyawa aktifnya sehingga semakin terjamin keamanan dan khasiatnya. Pada penelitian ini digunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik sebagai metode analisis

  ® kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme .

  Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum dari KCKT sehingga dapat digunakan sebagai penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain

  ®

  hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme . Sistem KCKT fase terbalik menggunakan kolom C18 dengan fase gerak metanol:aquabides. Optimasi dilakukan dengan mengubah-ubah komposisi fase gerak metanol:aquabides (75:25), (85:15) dan (95:5) serta mengubah-ubah flow rate yaitu 0,8; 1,0; dan 1,2 mL/menit dengan detektor ultraviolet pa da λmaks 265 nm. Kondisi optimum sistem KCKT yang didapatkan adalah fase gerak metanol:aquabides (95:5) pada flow rate 1,0 mL/menit. Kondisi optimum ini telah memenuhi parameter pemisahan yang baik yaitu peak yang simetri, t R kurang dari 10 menit, nilai r esolusi ≥ 1,5 yaitu 3,1819, dan nilai HETP yang paling kecil yaitu 0,0128.

  Kata kunci: kloramfenikol, lidokain hidroklorida, tetes telinga, optimasi metode, KCKT fase terbalik

  

ABSTRACT

  Chloramphenicol and lidocaine hydrochloride is the active substances

  ®

  contained in preparations Colme ear drops. Ear drops needs the quality assurance of products related to levels of the active compounds, so security is ensured and usability. In this study using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) reverse phase as a method of analysis of chloramphenicol and lidocaine

  ® hydrochloride in the preparation Colme ear drops.

  This study aims to determine the optimum conditions for HPLC can be used as a test of lidocaine hydrochloride and chloramphenicol in the preparation

  ®

  Colme ear drops. Reverse phase HPLC system using C

  18 column with mobile

  phase methanol:aquabidest. Optimization is done by changing the composition of mobile phase methanol:aquabidest (75:25), (85:15) and (95:5) and varying the flow rate of 0,8; 1,0; and 1,2 mL/min with an ultraviolet detector at λmaks 265 nm.

  The optimal conditions obtained by HPLC system is the mobile phase methanol: aquabidest (95:5) at flow rate of 1,0 mL/min. Optimal conditions in accordance with the parameters of a good separation of the peak of the symmetry, t

  R

  less than 10 minutes, the value of resolution ≥ 1,5 is 3,1819, and the lowest HETP is 0,0128. Key words: chloramphenicol, lidocaine hydrochloride, ear drops, optimization methods, reversed-phase HPLC

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Guttae auricularies atau obat tetes telinga adalah bahan obat berbentuk

  cairan yang cara penggunaanya dengan meneteskan ke dalam saluran telinga,

  ®

  kecuali dibuat dengan pembawa bukan air (Dirjen POM RI, 1974). Colme adalah

  ®

  salah satu jenis obat tetes telinga yang beredar di Indonesia. Colme mengandung senyawa antibiotik yaitu kloramfenikol 10% dan obat pemati rasa yaitu lidokain hidroklorida 4% (Anonim, 2006).

  Kloramfenikol memiliki kelarutan 1 bagian di dalam 400 bagian air dan 1 bagian didalam 2,5 bagian etanol, sangat larut di eter dan kloroform (Clarke, 1969). Menurut Farmakope Indonesia edisi IV (1995), tetes telinga kloramfenikol adalah larutan steril kloramfenikol dalam pelarut yang sesuai, mengandung tidak kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 130% C

  11 H

  12 Cl

  2 N

  2 O 5 dari jumlah yang tertera pada etiket.

  Lidokain hidroklorida (Otopain) adalah obat pemati rasa yang bekerja di dalam kulit dan selaput lendir dengan menghilangkan rasa nyeri, rasa terbakar, dan gatal pada telinga (Tan dan Rahardja, 2010). Lidokain berbentuk bubuk kristal putih dan memiliki sifat larut 1 bagian dalam 0,7 bagian air, 1 bagian didalam 1,5 bagian etanol, dan 1 bagian didalam 40 bagian kloroform dan tidak larut dalam eter (Clarke, 1969). Larutan oral-topikal lidokain hidroklorida mengandung lidokain hidroklorida tidak kurang dari 95,0

  % dan tidak lebih dari 105,0% dari jumlah yang tertera pada etiket (Dirjen POM RI, 1995).

  ®

  Dalam rangka menjamin kandungan mutu dari bentuk sediaan Colme , dibutuhkan suatu metode yang sensitif dan selektif sehingga khasiat dan keamanannya benar-benar dapat dipertanggungjawabkan. Oleh karena itu, metode yang dipilih sebagai metode analisis dalam pemisahan kloramfenikol dan lidokain

  ®

  hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme adalah metode KCKT fase terbalik. Metode KCKT ini sering digunakan sebagai metode analisis kuantitatif atau penetapan kadar suatu senyawa tertentu di dalam suatu matriks yang kompleks atau terdapat banyak komponen lain di dalam matriks sampel (Khopkar, 1990). Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena kloramfenikol dan lidokain hidroklorida memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet.

  Kloramfenikol di dalam metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet yaitu pada 272 nm ( ) dan lidokain hidroklorida di dalam metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet pada 263 nm ( ) dan 271 nm ( ) (Dibbern, Muller and Wirbitzki, 2002).

  Penetapan kadar kloramfenikol dan benzokain dalam suatu bentuk sediaan dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik pernah dilakukan oleh Sadana dan Ghogare (1990). Fase diam yang digunakan adalah kolom µBondapak C

  18 (300 mm x 3,9 mm i.d; ukuran partikel 5µ m) dan fase

  gerak metanol:aquabides (36:65 v/v). Hal yang membedakan penelitian ini dengan penelitian Sadana dan Ghogare adalah senyawa yang akan dipisahkan, yaitu pada penelitian ini adalah Kromasil sedangkan Sadana dan Ghogare adalah kolom µBondapak. Adanya perbedaan tersebut maka diperlukan adanya suatu penelitian optimasi pemisahan kedua senyawa tersebut untuk mendapatkan kondisi optimal.

  Optimasi metode KCKT bertujuan untuk mengetahui kondisi yang optimum pada metode KCKT sehingga dapat digunakan sebagai metode penetapan kadar campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada obat

  ®

  tetes telinga Colme . Kondisi yang optimum yang diharapkan adalah bentuk peak yang simetri, waktu retensi (t R ) < 10 menit , nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat, dan nilai HETP yang semakin kecil (Synder, Kirkland, and Glajh, 1997).

  Optimasi yang dilakukan adalah dengan mengubah komposisi fase gerak dan kecepatan alir atau flow rate sehingga parameter-parameter yang telah disebutkan tersebut dapat terpenuhi.

1. Permasalahan

  Berdasarkan latar belakang, permasalahan yang diperoleh adalah bagaimanakah komposisi fase gerak dan flow rate yang optimum yang dapat menghasilkan pemisahan dengan peak yang simetri, waktu retensi (t R ) < 10 menit, nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat, dan nilai HETP yang semakin kecil untuk penetapan kadar campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada

  ®

  obat tetes telinga Colme dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik? 2.

   Keaslian penelitian

  Penelitian terkait pernah dilakukan oleh Sadana dan Ghogare (1990), yaitu penetapan kadar kloramfenikol dan benzokain dalam suatu bentuk sediaan diam yang digunakan adalah kolom µBondapak C

  18 (300 mm x 3,9 mm i.d;

  ukuran partikel 5µ m) dan fase gerak metanol:aquabides (36:65 v/v). Akan tetapi, penelitian berupa optimasi campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik belum pernah dilakukan sebelumnya.

3. Manfaat penelitian

  a. Manfaat metodologis. Menjadi sumbangan karya ilmiah tentang metode penelitian dalam melakukan optimasi alat KCKT untuk penetapan kadar campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan topikal.

  b. Manfaat praktis. Dapat digunakan sebagai metode awal untuk validasi dan penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang nantinya dapat memberikan informasi bagi masyarakat mengenai penjaminan mutu pada obat tetes telinga yang mengandung kedua obat tersebut.

B. Tujuan Penelitian

  Berdasarkan latar belakang dan permasalahan di atas, maka penelitian ini bertujuan untuk mengetahui komposisi fase gerak dan flow rate yang optimum yang dapat menghasilkan pemisahan dengan peak yang simetri, waktu retensi (t R ) < 10 menit

  , nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat, dan nilai HETP yang semakin kecil untuk validasi dan penetapan kadar campuran kloramfenikol dan

  ®

  lidokain hidroklorida pada obat tetes telinga Colme dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Kloramfenikol Kloramfenikol adalah senyawa antimikroba yang bekerja dengan cara

  menghambat sintesis protein mikroba. Penghambatan yang terjadi yaitu pada enzim peptidil transferase yang berperan sebagai katalisator dalam pembentukan ikatan peptida ketika sintesis protein. Kloramfenikol bersifat bakteriostatik, dan dapat bersifat baktersid pada konsentrasi yang tinggi (Setiabudy dan Kurnadi, 1995).

  Gambar 1. Struktur Kloramfenikol (D-treo-(-)-2,2-Dikloro-N- (β-hidroksi-α-(hidroksimetil)-

p)nitrofenetilasetamida) (Hutt and O’Grady, 1996)

Kloramfenikol memiliki berat molekul (BM) 323,13 g/mol.

  Kloramfenikol mengandung tidak kurang dari 97,0% dan tidak lebih dari 103,0% C

  11 H

  12 Cl

  2 N

  2 O 5 . Namun, untuk tetes telinga kloramfenikol mengandung tidak

  kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 130,0% C H Cl N O dari jumlah yang

  11

  12

  2

  2

  5

  tertera pada etiket. Kloramfenikol memiliki hablur halus, berbentuk jarum atau lempeng memanjang, berwarna putih kelabu atau putih kekuningan, dan sifatnya stabil dalam larutan netral atau larutan agak asam, serta sukar larut dalam air, mudah larut dalam etanol, dalam propilenglikol, aseton, etil asetat (Dirjen POM

  ( ) (Dibbern et al., 2002). Kloramfenikol memiliki pH antara 4,5 dan 7,5 (Dirjen POM RI, 1995), dan pKa 5,5 (Clarke, 1969).

B. Lidokain Hidroklorida

  Lidokain memiliki daya kerja yang cepat dan merupakan obat anestesi lokal yang paling sering digunakan karena lebih stabil dalam pemanasan dan jarang menimbulkan reaksi hipersensitivitas (Sutedjo, 2008).

  Gambar 2. Struktur Lidokain Hidroklorida (2-(Dietilamino)- 2’,6’-aetoksilidida

monohidroklorida monohidrat) (British Pharmacopeia Comission, 2009)

  Lidokain hidroklorida memiliki berat molekul (BM) 270,80 g/mol, berbentuk serbuk hablur putih, tidak berbau dan rasa sedikit pahit dan sifatnya mudah larut dalam air, dalam etanol dan dalam kloroform, tetapi tidak larut dalam eter. Larutan oral-topikal lidokain hidroklorida mengandung lidokain hidroklorida tidak kurang dari 95,0% dan tidak lebih dari 105,0% dari jumlah yang tertera pada etiket (Dirjen POM RI, 1995). Lidokain di dalam metanol memiliki

  λmaks pada 263 nm ( ) dan 271 nm ( ) (Dibbern et al., 2002).

  Lidokain hidroklorida memiliki pH antara 5,0 dan 7,0 (Dirjen POM RI, 1995), dan pKa 7,9 (25°) (Clarke, 1969).

C. Obat Tetes Telinga

  Tetesan (guttae) adalah sediaan cair yang mengandung bahan obat atau ditakar berdasar jumlah tetesan, digunakan untuk diminum dan diisikan ke dalam wadah bertakaran ganda. Untuk tetesan tertentu yang digunakan di telinga, dinamakan tetes telinga (otoguttae) (Voigt, 1994).

  Menurut Farmakope Indonesia edisi IV, obat tetes telinga (guttae

  

auriculares ) adalah obat tetes yang digunakan dengan cara meneteskan ke dalam

telinga. Kecuali dinyatakan lain, dibuat dengan menggunakan pembawa bukan air.

  Pembawa pada obat tetes telinga harus mempunyai kekentalan yang cocok hingga obat mudah menempel. Pada umumnya digunakan gliseril dan propilenglikol, selain itu dapat juga menggunakan etanol, heksilenglikol, dan minyak lemak nabati (Dirjen POM RI, 1995).

D. Spektrofotometer UV

  Teknik spektroskopik merupakan salah satu teknik analisis fisiko-kimia yang mengamati interaksi atom atau molekul dengan suatu radiasi elektromagnetik (REM) (Mulja dan Suharman, 1995). Metode analisis spektrofotometri ultraviolet didasarkan pada substitusi pada daerah panjang gelombang sekitar 190-380 nm (Khopkar, 1990).

  Absorbansi cahaya ultraviolet mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi elektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi yang lebih tinggi. Panjang gelombang ultraviolet bergantung pada mudahnya promosi elektron. Molekul-molekul yang memerlukan banyak energi untuk promosi elektron akan menyerap pada panjang gelombang yang

  Ada empat tipe transisi elektronik yang mungkin terjadi yaitu σ  σ*, n 

  Pada t σ*, n  π*, dan π π* (Mulja dan Suharman, 1995). ransisi σ  σ*, elektron pada suatu orbital σ tereksitasi ke orbital σ*, dengan mengabsorbsi radiasi. Anti-ikat Transisi n 

  σ* terjadi dalam senyawa-senyawa jenuh dengan elektron tidak berpasangan. Transisi tersebut memerlukan energi yang lebih kecil dan terjadi dalam daerah 150- 250 nm dengan є = 100-3000. Transisi n  π* dan π π*mencakup sebagian besar senyawa organik. Energi yang diperlukan untuk transisi menghasilkan absorbsi maksimum dalam daerah 200-700 nm. Dengan adanya orbital π berarti terdapat gugus fungsi tidak jenuh. Transisi n  π* memiliki є = 10-100 L/cm/mol sedangkan transisi π π* memiliki є = 1000- 10.000 L/cm/mol (Khopkar, 1990).

  Kromofor merupakan suatu gugus fungsional tidak jenuh yang menyediakan orbital π yang dapat menyerap pada daerah ultraviolet (Skoog, 1985). Sedangkan auksokrom merupakan gugus jenuh yang bila terikat pada kromofor mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum, cirinya adalah heteroatom yang langsung terikat pada kromofor (Sastrohamidjojo, 2001).

  Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Sehingga, spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi yang ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang (Khopkar, 1990).

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 1. Pengenalan dan instrumentasi KCKT

  Kromatografi cair kinerja tinggi atau yang dikenal dengan HPLC (High

  

Performance Liquid Chromatography ) mulai dikembangkan akhir tahun 1960 dan

  awal tahun 1970 (Rohman, 2009). Penggunaan High Performance Liquid

  

Chromatography (HPLC) tidak terbatas untuk sampel yang bersifat volatil atau

  stabilitasnya yang mudah dipengaruhi oleh suhu. HPLC dapat memisahkan makromolekul, spesies ion, produk alami yang bersifat labil, polimer, dan lain- lain (Willard, Merrit, Dean, and Settle, 1988).

  Pemisahan dengan KCKT dapat dilakukan dengan fase normal atau fase terbalik. Fase normal apabila fase diamnya lebih polar dibandingkan dengan fase geraknya dan fase terbalik apabila fase diamnya lebih non polar daripada fase geraknya. Dengan adanya kedua pemisahan ini, sering kali KCKT dikelompokkan menjadi KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik (Gritter, 1991).

  

Gambar 3. Instrumentasi KCKT(Christian, 2004) Bagian yang harus diperhatikan pada kromatografi partisi fase terbalik adalah kolom, fase gerak, dan detektor.

  a. Kolom. Oktadesil silika (ODS atau C

  18 ) adalah fase diam yang paling

  umum digunakan pada KCKT fase terbalik karena mampu memisahkan senyawa dengan kepolaran rendah, sedang dan tinggi (Rohman, 2009).

  Panjang kolom KCKT biasanya sekitar 5-25 cm, dengan tekanan yang sangat tinggi yaitu sampai 6000 psi (Gritter, 1991). Standar diameter kolom HPLC sekitar 4-5 mm. Diameter partikel berada pada kisaran 4 sampai 7 µ m untuk kolom pada umumnya (Dean, 1995).

  b. Fase gerak. Selain susunan kimiawi dari fase gerak, ada empat hal pada fase gerak yang harus diperhatikan yakni harus murni secara kimia, harus bebas partikel yang dapat menyumbat kolom, harus bebas gas yang terlarut, dan jika dilakukan pencampuran, maka saat pencampuran harus dicampur dengan benar (Gritter, 1991).

  Komposisi fase gerak yang digunakan dapat mempengaruhi variasi retensi analit untuk pemisahan yang optimal. Sehingga fase gerak disesuaikan komposisinya agar diperoleh kepolaran relatif yang mirip dengan sampel untuk memperoleh pemisahan yang optimal (Willard et al., 1998).

  Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT (Synder et al., 1997)

  Dalam pemilihan fase gerak yang sesuai, parameter yang dilihat berdasarkan kepolaran campuran pelarut yang semakin linier dengan pelarut murni. Tingkat kepolaran suatu pelarut menunjukkan kemampuan pelarut dalam mengelusi suatu senyawa. Besarnya polaritas dapat dihitung dengan cara seperti dibawah ini:

  (1) P’camp: Ф1 P’1 + Ф2 P’2 + ........ + Фn P’n

  Keterangan: P’= indeks polaritas Ф = fraksi volume pelarut (Gritter, 1991).

  Semakin besar nilai indeks polaritas campuran maka fase gerak yang digunakan semakin polar (Synder et al., 1997).

  c. Detektor. Secara umum suatu detektor harus memiliki karakteristik tertentu yaitu memiliki respon cepat terhadap solut, reprodusibel, memiliki sensitifitas tinggi, stabil dalam pengoperasian, signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut, tidak dipengaruhi suhu dan kecepatan alir fase gerak (Rohman, 2009).

  Secara umum detektor dibagi menjadi 2 kategori, yaitu:

  1) Bulk property detectors Detektor ini merupakan detektor yang mengukur perubahan sifat fisik fase gerak dan solut. Detektor ini cenderung relatif tidak sensitif dan menghendaki suhu yang terkendali. Contohnya yaitu detektor indeks bias. 2) Solute Property detectors

  Detektor ini hanya dapat mengukur sifat fisik solut dan 1000 kali lebih sensitif serta mampu mengukur solut sampai satuan nanogram atau lebih kecil lagi.

  Contohnya yaitu detektor fluoresensi, detektor penyerapan (UV-Vis), dan detektor elektrokimia (Munson, 1991).

2. Kromatografi partisi fase terbalik

  Konsep dasar kromatografi partisi yaitu perlakuan sampel dalam kondisi cair-cair tergantung pada kelarutannya di dalam kedua cairan yang terlibat (Gritter, Bobbit, and Schwarting, 1991). Partisi analit di antara dua fase yang tidak saling campur, karena adanya perbedaan koefisien distribusi dari masing-masing senyawa. Jika solut ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri dari dua pelarut tidak saling campur dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang, maka solut akan tersebar di antara kedua fase menurut persamaan:

  (2)

  K = koefisien distribusi C s = konsentrasi solut dalam fase diam C = konsentrasi solut dalam fase gerak (Johnson dan Stevenson, 1978). _m

  Mekanisme pemisahan pada kromatografi partisi fase terbalik dapat digambarkan sebagai berikut:

  Gambar 4. Mekanisme pemisahan kromatografi partisi fase terbalik (Munson, 1991) 3. Pemisahan puncak dalam kromatografi

  Parameter pemisahan dengan sistem KCKT sebagai ukuran kemampuan kolom untuk memisahkan senyawa dari suatu campuran. Batasan yang digunakan adalah efisiensi kolom, waktu retensi (t ), dan faktor resolusi (Munson, 1991).

  R

  a. Efisiensi Kolom. Salah satu karakteristik sistem kromatografi yang paling penting adalah efisiensi atau jumlah lempeng teoritis (N) (Rohman, 2009).

  Ada dua teori mengenai pemisahan puncak dalam kromatografi,yaitu lempeng teoritik dan teori laju.

  Pada teori Lempeng (Plate theory) dijelaskan bahwa ukuran efisiensi kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis (Rohman, 2009). Jumlah lempeng (N) dihitung dengan persamaan (Willard et al., 1988):

  (3) Nilai w adalah lebar alas, w 1/2 adalah lebar alas puncak pada setengah tinggi puncak, dan t adalah waktu retensi (Sastrohamidjojo, 2001). Persamaan

  R

  dibawah ini menggambarkan hubungan anatra panjang kolom (L) dengan efisiensi kolom (H):

  L H HETP

  (4)

  N

  Jumlah lempeng (N) yang tinggi disyaratkan untuk pemisahan yang baik yang nilainya sebanding dengan semakin panjang kolom (L) dan semakin kecilnya nilai H. H adalah tinggi ekivalen lempeng teoritis atau HETP (High

  

Equivalent Theoritical Plate ), merupakan panjang kolom yang dibutuhkan untuk

  menghasilkan suatu lempeng teoritis. Kolom yang baik seharusnya memiliki jumlah plat teoritis (N) yang tinggi dan nilai H yang rendah. Ukuran partikel merupakan suatu hal yang berpengaruh pada nilai H, dimana semakin kecil ukuran partikel maka semakin tinggi bilangan lempeng teoritis (Rohman, 2009).

  Gambar 5. Perhitungan bilangan lempeng teoritik (Willard et al., 1988)

  Pada teori laju dapat diketahui adanya pengaruh variabel-variabel lain yang menyebabkan pelebaran peak, sedangkan teori lempeng hanya transfer pada fase diam dan fase gerak berkali-kali, solut bergerak bersama fase gerak sehingga migrasi di dalam kolom tidak teratur yang mengakibatkan laju rata-rata solut relatif terhadap fase gerak juga sangat bervariasi. Laju rata-rata solut relatif terhadap fase gerak bervariasi sehingga mengakibatkan pelebaran

  peak solut (Noegrohati, 1994).

  Berdasarkan teori laju yang ada, efisiensi kolom dinyatakan dengan persamaan Van Deemter yang dinyatakan sebagai berikut: (5) (6)

  Keterangan: λ = tetapan ukuran ketidakteraturan kemasan dp = diameter rata-rata partikel penyangga D = kedifusian linarut dalam fase gerak k’ = Faktor kapasitas µ = kecepatan alir γ = faktor koreksi kelikuan saluran dalam kolom (Willard et al., 1988).

  Berdasarkan persamaan Van Deemter di atas, hal-hal yang mempengaruhi efisiensi kolom yaitu Difusi Eddy, Difusi Longitudinal, dan Transfer Massa (Willard et al., 1988).

  Difusi Eddy disebabkan oleh banyak kemungkinan pada kemasan kolom yang kurang baik.