Formulasi Beads Alginat Gastroretentif yang Mengandung Ekstrak Kunyit (Curcuma domestica Val.) dan Uji Efek Penyembuhan Terhadap Lesi Lambung pada Tikus Chapter III V

BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmasi Fisik Fakultas Farmasi
Universitas

Sumatera

Utara,

Laboratorium

Penelitian

Fakultas

Farmasi

Universitas Sumatera Utara, dan Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara.

3.2 Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental yang
meliputi pembuatan beadsalginat yang mengandung ekstrak kunyit,evaluasi dan
karakterisasi sediaan, uji in vitro dan uji in vivo.

3.3 Alat
Alat-alat yang digunakan adalah alat disolusi metode dayung (Erweka),
beaker glass (Pyrex), cawan porselen, erlenmeyer (Pyrex), gelas arloji, gelas ukur
(Pyrex), jangka sorong (Tricle), mikrometer sekrup, labu tentukur (Pyrex),
lumpang dan alu, magnetic stirrer, mat pipet (MBL), neraca analitis (Ohaus
Pionner), oral sonde, oven, stopwatch, pipet volum (MBL), pH meter
(Hanna),rotary evaporator, spektrofotometer (Shimadzu UV 1800), spuit 10 ml
dengan jarum ukuran 21G, 23G, dan 25G (Terumo),Tabletop microscope 3000
(Hitachi), vial, dan alat-alat laboratorium yang biasa digunakan.

29

Universitas Sumatera Utara

3.4 Bahan
Bahan-bahan

yang

digunakan

adalah

rimpang

kunyit

(Curcuma

domesticaVal.), etanol 96%, Akua DM (Brataco), Kurkumin baku (Sigma
Aldrich), Tween 80 (Merck), Natrium alginat 80-120 cP dan 500-600 cP (Wako
pure chemical industries, Ltd. Japan), dan bahan-bahan yang berkualitas pro
analysis (Merck): kalsium klorida dan asam klorida. Akuades diperoleh dari
laboratorium Farmasi Fisik, Fakultas Farmasi, USU.

3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1 Penyiapan bahan tumbuhan
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengambilan, identifikasi, dan
pengolahan bahan.
3.5.1.1 Pengambilan bahan tumbuhan
Metode pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu
diambil dari satu daerah saja tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama
di daerah lain. Bahan tumbuhan diperoleh dari Pasar Sentral, Kota Medan,
Provinsi Sumatera Utara.
3.5.1.2 Identifikasi bahan tumbuhan
Identifikasi bahan tumbuhan (rimpang) dilakukan di Herbarium
Medanense (MEDA), Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.5.1.3 Pengolahan bahan tumbuhan
Rimpang dibersihkan dari kotoran yang melekat, disortasi basah lalu
dicuci dengan air sampai bersih. Ditiriskan, dirajang dengan ketebalan 3-5 mmdan

30

Universitas Sumatera Utara

ditimbang. Dikeringkan dalam lemari pengering sampai bahan tumbuhan rapuh
(dapat dipatahkan) kemudian simplisia ditimbang.
3.5.2 Pemeriksaan karakteristik simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik
dan mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut air, penetapan
kadar sari larut etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu yang
tidak larut asam (Depkes RI, 1989; WHO, 1992).
3.5.2.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, ukuran,
warna, dan bau rimpang kunyit.
3.5.2.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia rimpang
kunyit. Serbuk simplisia ditaburkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan
larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati dengan
mikroskop. Untuk melihat bentuk butir pati ditetesi dengan akuades.
3.5.2.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi, yang meliputi:
a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu

alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2
jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan mendingin selama 30 menit, kemudian
volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,01 ml.

31

Universitas Sumatera Utara

b. Penetapan kadar air simplisia
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama dimasukkan
ke dalam labu yang berisi toluen yang telah dijenuhkan, dipanaskan secara hatihati selama 15 menit. Kecepatan tetesan diatur 2 tetes per detik setelah toluen
mendidih sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi
dinaikkan sampai 4 tetes per detik. Bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen
setelah semua air terdestilasi. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, tabung
penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Volume air dibaca setelah air
dan toluen memisah sempurna dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air
yang dibaca sesuai dengan kadar air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa.
Kadar air dihitung dalam persen (WHO, 1992).
3.5.2.4 Penetapan kadar sari larut air
Sebanyak 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air kloroform (2,5 ml kloroform dalam akuades sampai 1 liter) dengan menggunakan

botol bersumbat warna coklat sambil sekali-kali dikocok selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18-24 jam dan disaring, sejumlah 20 ml filtrat
pertama diuapkan hingga kering dalam cawan yang telah dipanaskan dan ditara.
Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 1050C sampai diperoleh bobot tetap.
Kadar sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan
diudara (Depkes RI, 1989).
3.5.2.5 Penetapan kadar sari larut etanol
Sebanyak 5 g serbuk dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96%
dengan menggunakan botol bersumbat berwarna coklat sambil sekali-kali dikocok
selama

6

jam

pertama,

kemudian

dibiarkan

32

selama

18-24

jam

dan

Universitas Sumatera Utara

disaring.Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan hingga kering dalam cawan
yang telah dipanaskan dan ditara. Residu dipanaskan dalam oven pada suhu 1050C
sampai diperoleh bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap
bahan yang telah dikeringkan diudara (Depkes RI, 1989).
3.5.2.6 Penetapan kadar abu total
Lebih kurang 2 g zat yang telah digerus dan ditimbang seksama,
dimasukkan kedalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian

diratakan. Krus porselen bersama isinya dipijarkan perlahan–lahan hingga arang
habis, didinginkan, ditimbang sampai diperoleh bobot yang tetap. Kadar abu
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara (Depkes RI, 1989).
3.5.2.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut asam
Abu yang diperoleh pada penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25
ml asam klorida encer selama 5 menit, dikumpulkan bagian yang tidak larut
dalam asam, disaring dengan kertas saring, lalu dicuci dengan air panas.
Kemudian residu dan kertas saring dipijarkan sampai diperoleh bobot tetap,
didinginkan dan ditimbang beratnya. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara (Depkes, 1989).
3.5.3Pembuatan pereaksi
3.5.3.1 Pembuatan larutan kalsium klorida 0,15 M
Kalsium klorida ditimbang 22,053 gram kemudian dilarutkan dengan akua
bebas CO2 secukupnya sampai 1000 ml (Ditjen POM, 1995).
3.5.3.2 Pembuatan medium lambung buatan (medium pH 1,2)
Natrium klorida 2 gram ditambahkan asam klorida pekat sebanyak 7 ml
ditambahkan air suling hingga 1000 ml (Ditjen POM, 1995).

33

Universitas Sumatera Utara

3.5.4 Pembuatan kurva serapan dan kurva kalibrasi kurkumin
3.5.4.1 Pembuatan larutan induk baku kurkumin
Dilarutkan 10 mg kurkumin baku dengan etanol hingga larut sempurna di
dalam labu 10 ml, kemudian dicukupkan HCl 0,1 N(LIB I= 1000 ppm).
Kemudian dipipet 5 ml ke dalam labu 50 ml (LIB II= 100 ppm).
3.5.4.2 Pembuatankurva serapankurkumin dalam medium lambung
pH 1,2
Dipipet 1 ml dari LIB II ke dalam labu 10 ml, dicukupkan dengan HCl 0,1
N. Diukur pada λ 400-800 nm.
3.5.4.3 Pembuatan kurva kalibrasi kurkumin dalammediumlambung
pH 1,2
Dipipet 2,5, 5, 7, 10, 12,5 ml dari LIB II, dimasukkan ke dalam labu 50
ml, dicukupkan dengan HCl 0,1 N (konsentrasi 5, 10, 15, 20, 25 ppm). Diukur
pada λmaksimum (λ= 428 nm).
3.5.5 Pembuatan ekstrak kunyit
Dihaluskan simplisia rimpang kunyit, kemudian ditimbang. Dimaserasi
serbuk kunyit (750 gram) dengan etanol 96% (5 liter) selama 5 hari, kemudian di
remaserasi selama 3 hari dengan etanol 96% (3 liter). Kemudian diuapkan dengan

rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kental dan diuapkan dengan
waterbathhingga ekstrak bebas dari pelarut.
3.5.6 Pembuatan beadsalginat
R/

Ekstrak kunyit

5, 10, 15%

Tween 80

5%

Natrium alginat

1,5%

Akua DM ad.

50 ml

34

Universitas Sumatera Utara

Timbang seksamaNatrium Alginat, didispersikan ke sejumlah akua DM
dan didiamkan selama 24 jam. Ekstrak kunyit digerus dengan etanol secukupnya
hingga larut, kemudian ditambahkan Tween 80. Natrium alginat dimasukkan dan
dihomogenkan. Kemudian diteteskan ke dalam larutan kalsium klorida (CaCl2)
0,15 M dengan curing time 4-5 menit. Beads dibilasdengan akua DM,
dikumpulkan dan dikeringkan di suhu ruangan selama 2 hari.Beads disimpan
dalam desikator hingga waktu pemakaian.
3.5.7 Karakterisasi beads
3.5.7.1 Penentuan berat beads
Dilakukan penimbangan 20 beads sebanyak 6 kali.
3.5.7.2 Penentuan ukuran beads
Dilakukan pengukuran sebanyak 6 beads dari 3 sisi diameter, dirataratakan diameter untuk memperolah diameter beads.
3.5.8 Penentuan PenjerapanBeads
Ditimbang ±50 mg beads, diekstrak dengan etanol 96% secukupnya
sampai

larutan

tidak

menghasilkan

absorbansi

pada

spektrofotometer.

Dimasukkan hasil ekstrak ke labu tentukur 50 ml, dicukupkan dengan medium
lambung buatan pH 1,2. Dipipet 1 ml ke dalam labu 20 ml, kemudian dipipet
kembali 1 ml ke dalam labu 10 ml. Diukur pada λ 428 nm.
3.5.9 Studi pelepasan in-vitro
Medium disolusi

: medium lambung buatan (pH 1,2)

Kecepatan Pengadukan

: 50 rpm

Volume medium

: 900 ml

Metode

: dayung

Sampel

: beadsalginat dari ekstrak kunyit

35

Universitas Sumatera Utara

Ditimbang beadsalginat dan dimasukkan ke apparatus disolusi tipe dayung
berisi 900 ml medium lambung buatan, suhu 37±0,5oC dengan kecepatan 50 rpm.
Sampel diambil pada interval waktu 5 menit, 10 menit, 15 menit, 30 menit, 45
menit, 60 menit, lalu sampel selanjutnya diambil pada interval 30 menit. Diambil
aliquot sebanyak 5 ml dan dijaga volume nya tetap 900 ml. Pengambilan
dilakukan pada tempat yang sama yaitu pertengahan antara permukaan medium
disolusi dan bagian atas dari dayung tidak kurang dari 1 cm dari dinding wadah
(Ditjen POM, 1995). Sampel dianalisis dengan Spektrofotometer pada λmaks
untuk menentukan konsentrasi obat.
3.5.10 Uji bioadhesi
Dipilih formula dengan pelepasan paling bagus dan dilakukan uji
bioadhesif in vitro. Mukosa lambung tikus dibersihkan, dan direndam dalam NaCl
fisiologis. Mukosa lambung ditempelkan ke kaca objek dengan bagian muka
menghadap ke atas. Dimiringkan kaca objek dengan sudut 450. Sebanyak 20
beads ditempelkan di atas mukosa lambung, kemudian ditetesi cairan lambung
buatan dan dibiarkan 1 menit. Mukosa dialiri dengan cairan lambung buatan suhu
37 ± 0,50C dengan kecepatan 22 ml/ menit. Dihitung jumlah beads yang tertinggal
pada 5 menit dan 10 menit. Dihitung nomor adhesi dengan rumus:

Na =
Keterangan:

�N�No�
100

Na =nomor adhesi; N = jumlah beads setelah pengaliran;
No = jumlah beadsawal (20 butir).

36

Universitas Sumatera Utara

3.5.11 Induksi luka lambung dengan larutan HCl 1 M dan penyembuhan
lesi lambung menggunakan beads alginat dari ekstrak kunyit
Tikus yang dipakai berjenis kelamin jantan dengan berat 150-200 g.
Semua tikus diaklimatisasi selama 1 minggu sebelum perlakuan. Tikus
dipuasakan selama 36 jam, kemudian diinduksi dengan 1 ml larutan HCl 1 M
untuk membuat luka lambung (Bangun, et al., 2016). Setelah 1 jam induksi, 3
tikus dikorbankan dengan dislokasi, kemudian lambung dibuka dan dicuci dengan
larutan NaCl 0,9%, dan luka diamati secara makroskopik dan mikroskopik
(histopatologi).
Tikus yang tersisa dibagi ke dalam 2 grup, tiap grup terdiri atas 12 tikus.
Grup I: kontrol normal (hanya diberikan akuades per oral tiap hari); grup II: Grup
uji (diberikan beads alginat ekstrak kunyit sebanyak 100 mg/kgBB tikus per oral
setiap hari). Tikus diberikan pelet standar dan air minum adlibitum. Kemudian,
masing – masing 3 tikus dikorbankan dengan dislokasi leher pada hari ke-2, 4, 6
dan 8. Mukosa lambung diamati secara makroskopik jumlah lesi dan luas luka.
Panjang dan lebar tiap-tiap ulkus diukur dengan menggunakan jangka sorong
(area ulkus) (mm2). Untuk pengamatan mikroskopik, mukosa lambung direndam
dalam larutan formalin 10% untuk histopatologi. Sampel diproses secara histologi
dengan

pewarnaan

haematoxylin-eosin

dan

diamati

secara

mikroskopis

menggunakan mikroskopik cahaya dengan perbesaran 40 dan 100.

37

Universitas Sumatera Utara

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi yang dilakukan oleh Herbarium Medanense (MEDA)
terhadap tumbuhan yang diteliti adalah tumbuhan Curcuma domestica Val. suku
Zingiberaceae. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 4.

4.2 Karakteristik Simplisia
Hasil karakterisasi simplisia rimpang kunyit dapat dilihat pada Tabel 4.1.
Tabel 4.1 Hasil karakterisasi simplisia rimpang kunyit
No.
1
2
3
4
5

Pemeriksaan karakteristik
simplisia
Kadar air
Kadar sari larut etanol
Kadar sari larut air
Kadar abu total
Kadar abu tidak larut asam

A (%)

B (%)

11,95
20,81
17,31
7,185
0,44

8-13,7
> 10
> 15