Efek penambahan 2,4- Diclorophenoxyacetic Acid (2,4-D) terhadap perubahan genetik organogenesis dari kultur suspensi kelapa sawit berdasarkan marka Simple Sequence Repeats (SSR)

36

Lampiran 1. Pembuatan Larutan Stok dan Buffer
A. Pembuatan Larutan Stok


Tris HCL 1 M pH 8.0 (100 ml) : Timbang Tris sebanyak 12,114 g.
Masukkan Tris ke dalam Erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades.
Aduk campuran larutan sampai homogen, selanjutnya ditambah 4,2 ml
HCL pekat sedikit demi sedikit sampai pH mencapai 8, kemudian volume
ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan
autoklaf.



EDTA 0,5 M pH 8.0 (100 ml) : Timbang EDTA sebanyak 18,612 g dan
NaOH 2.0 g. Masukkan kedalam Erlenmeyer dan ditambah 80 ml aquades.
Selanjutnya, ditambahkan HCL pekat sedikit demi sedikit sampai pH 8,
kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml. Larutan
disterilkan dengan autoklaf.



NaCl 5 M (100 ml) : Timbang NaCl sebanyak 29,22 g. Masukkan
kedalam Erlenmeyer dan ditambahkan aquades hingga larutan mendekati
100 ml dan diaduk. Kemudian volume ditepatkan dengan dengan aquades
hingga 100 ml. Larutan disterilkan dengan autoklaf.

B. Pembuatan Larutan Bufer


CTAB 2 % (100 ml)
CTAB 2 %

= 2 g CTAB

20 mM EDTA

= 8 ml EDTA 0,5 M pH 8.0

100 mM Tris-HCl = 10 ml Tris-HCl 1 m pH 8.0

1,4 M NaCl

= 56 ml NaCl 5 M

0,2 % PVP

= 2 g PVP

0,2 % β-merkaptotanol


Buffer TAE 50 X (100 ml)
Tris

= 24,2 g

Asam Asetat Glacial

= 5,7 ml

EDTA 0,5 M pH 8.0

= 10 ml

Aquades ditambahkan hingga volume larutan 100 ml

Universitas Sumatera Utara

37



Buffer TAE 1 X (1000 ml)
Buffer TAE 50 X = 20 ml
Aquades



= 980 ml

Kloroform Isoamilalkohol 24:1 (50 ml)
Kloroform

= 48 ml

Isoamilalkohol

= 2 ml

Universitas Sumatera Utara

38

Lampiran 2. Komposisi Medium Y3 yang Digunakan
Bahan Unsur Kimia

Konsentrasi (mg/L)

Makro Elemen
NH4Cl

535,000

KNO3

2020,000

MgSO4.7H2O

247,000

CaCl2. 2H2O

294,000

KCL

1492,000

NaH2PO4

312,000

Mikro Elemen
KI

8,300

H3BO3

3,100

MnSO4. 4H2O

11,200

ZnSO4. 7H2O

7,200

CuSO4. 5H2O

0,160

CoCl2. 6H2O

0,240

NaMoO4. H2O

0,240

NiCl2

0,024

Fe2SO4. 7H2O

27,800

NaEDTA

37,300

Vitamin
Myoinositol

100.000

Piridixin HCl

0,050

Tiamin HCl

0,500

Glisin

2,000

Asam Amino
Glutamin

100,000

Gula

45000,000

Agar

8000

pH

6,0

Universitas Sumatera Utara

39

Lampiran 3. Data Pengamatan Waktu Terbentuknya Organ (HST)

Konsentrasi 2,4-D

Ulangan
1

2

3

4

5

-

-

-

-

-

100 mg/L

105

-

-

-

-

115 mg/L

-

-

153

-

-

120 mg/L

-

-

120

-

-

135 mg/L

-

-

134

-

-

140 mg/L

114

-

-

-

-

0 mg/L

Universitas Sumatera Utara

40

Lampiran 4. Matriks kemiripan genetik berdasarkan coefficient dice

Sampel
P0
P1
P2
P3
P4
P5

P0
1.00
0.55
0.58
0.32
0.58
0.50

P1

P2

P3

P4

P5

1.00
0.73
0.64
0.82
0.64

1.00
0.61
0.79
0.73

1.00
0.70
0.58

1.00
0.70

1.00

Universitas Sumatera Utara

41

Lampiran 5. Proses Isolasi DNA

Eksplan 0,4 g digerus dalam lumpang porselin dengan
bantuan nitrogen cair

Eksplan ditambah kedalam tabung yang berisi 1 ml buffer
ekstrasi, 2% β-merkaptoetanol dan 1% PVP

Eksplan ditambah KIAA (24:1) dan disentrifus
dengankecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 5 menit

Supernatan ditambah 1ml isopropanol dan diinkubasi pada suhu
-20oC selama 1 malam

DNA diendapkan dengan penambahan 1/10 kali volume sodium
asetat dan dihomogenkan.

Supernatan dibuang sedangkan pelet diambil dan dibersihkan
dengan alkohol 70% sebanyak 2 kali

DNA divakum pada suhu 37oC selama 10 menit. DNA yang telah
kering dilarutkan dengan aquabides (ddH2O) steril

Untuk menghilangkan kontaminan RNA dari DNA dengan
menambahkan µL RNase (20 mg/ml) pada suhu 37oC selama 90 menit

RNase dinonaktifkan pada suhu 70oC selama 3 menit dan disimpan
pada suhu -20oC untuk digunakan selanjutnya

Universitas Sumatera Utara

42

Lampiran 6. Uji Kualitas DNA
Agarose 1% ditambahkan dengan 100 ml buffer
TAE 1x

Campuran dipanaskan dengan hot plate

Campuran ditambahkan 5 µl EtBr

Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah
dipasang sisir

Gel yang telah mengeras dipindahkan kedalam chamber berisi
buffer TAE 1x

Sample dan loading dye dimasukkan kedalam sumur gel dengan
perbandingan (5:1)

Alat elektroforesis dihubungkan dengan power
supply 80 volt

Proses running dimulai selama 45 menit

Universitas Sumatera Utara

43

Lampiran 7. Proses PCR – SSR

Komposisi Master Mix Volume 10 µl :
Go Taq® Green 5 µl
DNA template 1 µl
Primer R (10 pmol/ µl) 1 µl
Primer F (10 pmol/ µl) 1 µl
Nuclease free water 2 µl

Running PCR sebanyak 35 siklus :
Denaturasi awal 95oC 30 detik
Denaturasi 95oC 1 menit
Annealing (Suhu optimum primer) 55oC dan 58oC 30 detik
Extension 72oC 1 menit
Post Extension 72oC 5 menit
Kondisi akhir PCR 4oC Tak terbatas (∞)

Proses running dimulai selama ± 3 jam

Universitas Sumatera Utara

44

Lampiran 8. Proses Hasil PCR – SSR
Agarose 2 gram ditambahkan dengan 100 ml buffer
TAE 1x

Campuran dipanaskan dengan hot plate

Campuran ditambahkan 5 µl EtBr

Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang
sisir

Gel yang telah mengeras dipindahkan ke dalam chamber
berisi buffer TAE 1x

Sampel hasil PCR dan marker dimasukkan ke dalam
sumur gel dengan perbandingan (10:5)

Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supplay
pada tegangan 70 V, 100 mA pada suhu ruang.

Proses running dimulai selama 90 menit

Universitas Sumatera Utara