MATERI DAN METODE dalam praktek

MATERI DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi
Nutrisi, Laboratorium Terpadu dan Laboratorium Ilmu Ternak Perah, Departemen Ilmu
Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Waktu penelitian
ini berlangsung dari bulan Februari sampai Juni 2011.
Materi
Bahan
Bahan yang digunakan untuk pembuatan sampel ransum perlakuan adalah hijauan
segar (rumput lapang), pakan penguat, ekstrak lerak, dan cairan rumen. Bahan-bahan lain
yang dibutuhkan dalam penelitian adalah larutan McDougall, larutan HgCl2 jenuh, gas CO2,
media BHI (Brain Heart Infusion), media tumbuh yang spesifik, media pengencer, agar bacto,
aquades, larutan buffer fosfat NaCl 0,005 M pH 7,2. Bahan untuk uji VFA antara lain larutan
NaOH 0,5N, larutan HCl 0,5N, H2SO4 15%, NaCl 1%, HCl 1%, HCl 10% dan mineral (Ca,
P, Mg, dan S). Bahan yang digunakan untuk uji NH3 antara lain asam borat (H3BO3), vaselin,
indikator phenolphthalien (PP), Na2CO3 jenuh, H2SO4 0,005 N dan Na2SO4. Bahan yang
digunakan untuk pengukuran pH rumen adalah alat pengukur pH meter.
Cairan Rumen
Cairan rumen yang digunakan berasal dari sapi potong yang dipasang fistula pada
bagian rumen yang dipelihara di Laboratoriun Lapang Fakultas Peternakan, Institut Pertanian
Bogor, Bogor.

Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain neraca analitik, eksikator,
tabung film, botol plastik ukuran sedang counting chamber , kain penyaring, shaker
waterbath, autoclave, penangas air, roller tube, termos, kain belacu, karet berventilasi, cawan

Conway, sentrifus, vakum, labu penyuling, labu Erlenmeyer , tabung Hungate, tanur, gegep,
magnetic stirrer, destilator, timbangan digital, buret, kondensor, tabung fermentor, tabung
reaksi, tutup karet, pipet volumetik, mikroskop, bulp dan cawan porselen.
Metode

Ekstraksi Lerak
Ekstraksi lerak diperoleh dengan cara mengekstraksi buah lerak dengan metanol.
Buah lerak dibersihkan, dikeringkan selama 30-36 jam (45oC), setelah itu dikeringkan dengan
menggunakan oven (60oC). Buah lerak yang sudah kering digiling lalu dimaserasi dengan
perbandingan tepung lerak dan metanol 1 : 4. Hasil maserasi disaring dengan menggunakan
kertas saring, kemudian supernatan yang dihasilkan dikeringbekukan agar menjadi bubuk
menggunakan alat freezer dryer (Wina et al., 2006).
Pengukuran KCBK dan KCBO
Analisis KCBK dan KCBO pada penelitian ini menggunakan metode (Tilley & Terry, 1963).
Pembuatan Larutan Pepsin. Sebanyak 2,8 gram pepsin (1:7000) dilarutkan dalam 850 ml

air bebas ion, kemudian ditambahkan 17,8 ml HCl pekat dan campuran dimasukkan ke dalam
labu takar. Air ditambahkan hingga permukaan mencapai tanda tera.
Pengukuran KCBK dan KCBO. Sampel dalam tabung fermentor yang sudah diinkubasi 48
jam dan ditetesi HgCl2 disentrifusi dengan kecepatan 2500 rpm selama 20 menit. Supernatan
dan endapan dipisahkan, kemudian endapan yang terbentuk ditambahkan 50 ml larutan
pepsin-HCl 0,2%. Campuran tersebut diinkubasi selama 48 jam tanpa tutup karet. Setelah 48
jam campuran endapan-pepsin disaring menggunakan kertas saring whatman No.41 dengan
bantuan pompa vacum. Hasil saringan (residu) dimasukkan ke cawan porselen yang
sebelumnya sudah diketahui bobot kosongnya. Bahan kering diperoleh dengan cara
mengeringkan sampel dalam oven 105oC selama 24 jam. Selanjutnya bahan dalam cawan
dipijarkan atau diabukan dalam tanur listrik selama 6 jam pada suhu 450-600oC. Sebagai
blanko digunakan residu asal fermentasi tanpa sampel ransum perlakuan.
Koefisien Cerna Bahan Kering (KCBK) dan Koefisien Cerna Bahan Organik (KCBO)
dihitung dengan rumus:
BK sampel (BK residu – BK blanko) x 100%
% KCBK =
BK sampel
BO sampel (BO residu – BO blanko) x 100%
% KCBO =
BO sampel

Pengukuran Konsentrasi NH3 (Metode Mikrodifusi Conway)

Pengukuran konsentrasi NH3 menggunakan metode Mikrodifusi Conway (General
Laboratory Procedures, 1966). Sebelum digunakan bibir cawan Conway diolesi dengan
vaselin. Supernatan yang dihasilkan dari proses fermentasi dengan inkubasi 4 jam diambil 1
ml, kemudian ditempatkan pada salah satu ujung alur cawan Conway, pada ujung satunya
dimasukkan 1 ml Na2CO3 jenuh. Antara supernatan dan NaCO3 tidak boleh bercampur.
Larutan asam borat berindikator sebanyak 1 ml ditempatkan dalam cawan kecil yang terletak
di tengah cawan Conway, kemudian cawan Conway langsung ditutup rapat hingga kedap
udara. Setelah itu cawan Conway digoyang-goyangkan hingga supernatan dan NaCO 3
tercampur rata, dan dibiarkan dalam suhu ruang selama 24 jam. Setelah 24 jam asam borat
berindikator dititrasi dengan H2SO4 0,005 N sampai terjadi perubahan warna dari biru
menjadi merah.
Konsentrasi NH3 dihitung dengan rumus:
NH3 (Mm) = Volume H2SO4 x N. H2SO4 x 1000
Berat sampel x BK sampel
Prosedur Pengukuran Konsentrasi VFA
Pengukuran konsentrasi VFA dengan menggunakan metode steam destilasi (General
Laboratory Procedures, 1966). Prosedur pengukuran VFA, pertama dipersiapkan alat destilasi
yaitu dengan mendidihkan air dan mengalirkan air ke kondensor atau pendingin. Kemudian

masukkan 5 ml sampel yang diinkubasi pada jam ke-4 dan 1 ml H2SO4 15% ke dalam tabung
destilasi. Kemudian dilanjutkan dengan proses destilasi, proses destilasi dilakukan dengan
cara menghubungkan tabung dengan labu yang berisi air mendidih. Uap air panas akan
mendesak VFA dan akan terkondensasi di dalam pendingin. Destilasi ditampung dengan labu
Erlenmeyer 500 ml yang telah terisi 5 ml NaOH 0,5 N. Proses destilasi selesai pada jumlah
destilasi yang tertampung ditambahkan indikator phenolphthalein (PP) sebanyak 2-3 tetes,
lalu dititrasi dengan HCl 0,5 N sampai terjadi perubahan warna dari merah jambu menjadi
bening. Konsentrasi VFA dapat diukur dengan rumus :
Konsentrasi VFA total (mM) =

(a-b) x N.HCL X 1000/5ml
Berat sampel x BK sampel

a = volume titrasi blanko
b = volume titrasi contoh
Pengujian proporsi molar VFA menggunakan metode gas kromatografi dengan
salicilic acid sebagai standar. Pengujian dilakukan di Pusat Penelitian Pengembangan Ternak,
Bogor.

Menghitung Populasi Protozoa

Perhitungan populasi protozoa dilakukan dengan menggunakan counting chamber
dengan larutan garam formalin (formalin salin) yang dibuat dari campuran formalin dengan
NaCl fisiologis (Ogimoto salin) 0,9% dalam 100 ml larutan (Ogimoto dan Imai, 1981).
Sebanyak 1 ml larutan formalin salin dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dicampur
dengan cairan rumen segar atau rumen yang telah mengalami inkubasi 4 jam, dengan
perbandingan 1 : 1 atau sebanyak 1 ml cairan rumen ditambah 1 ml larutan garam formalin,
kemudian diaduk secara merata. Sampel cairan diteteskan pada counting chamber sebanyak 2
tetes dan ditutup dengan cover glass sampai rata. Counting chamber yang digunakan
mempunyai ketebalan 0,1 mm, dengan luas kotak terkecil 0,0625 mm yang terdapat 16 kotak
dan kotak yang dibaca sebanyak 5 kotak. Populasi protozoa diamati dengan mikroskop lensa
obyektif dengan pembesaran 40x dan okuler 10x.
Populasi protozoa dihitung dengan rumus :
Populasi protozoa =

1

x 1000 x C x Fp

0,1 x 0,0625 x 16 x 5
Keterangan:

C

= jumlah koloni yang dihitung

Fp

= faktor pengencer

Perhitungan Populasi Bakteri Total
Populasi bakteri dihitung dengan metode pencacahan koloni bakteri hidup. Prinsip
perhitungannya adalah cairan rumen diencerkan secara serial, lalu disimpan dalam tabung
Hungate. Media tumbuh yang digunakan untuk menghitung populasi bakteri total adalah

media BHI (Brain Heart Infusion). Pembuatan media BHI yaitu dengan cara mencampurkan
bahan-bahan seperti BHI powder, glukosa, sellulobiosa, pati, cystein, hemin dan resazurin,
kemudian dimasukkan ke dalam botol yang telah disterilkan dengan autoclave. Campuran
tersebut dipanaskan sampai terjadi perubahan warna dari coklat kekuningan menjadi coklat
kemerahan dan berubah kembali menjadi coklat kekuningan, setelah itu didinginkan dan
dialiri dengan gas CO2. Media BHI anaerob dimasukkan ke dalam tabung Hungate yang

sebelumnya telah diisi bacto agar sebanyak 0,150 gram dengan volume masing-masing 4,9
ml.

Sampel (cairan rumen yang telah mengalami perlakuan dan inkubasi 4 jam) dipipet
0,05 ml dimasukkan ke dalam media pengencer. Pengenceran dilakukan sebagai berikut: 0,05
ml kultur bakteri dimasukkan ke dalam 4,95 ml media pengencer. Selanjutnya dari media
pengencer diambil kembali sebanyak 0,05 ml, lalu dimasukka ke dlam 4,95 ml media
pengencer berikutnya, sehingga terdapat pengenceran 10 -2, 10-4, 10-6 dan 10-8. Dari masingmasing seri tabung pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml, kemudian dimasukkan ke media
agar dan diputar sambil dialiri air pada roller, agar media dapat menjadi padat secara merata.
Selanjutnya bakteri diinkubasi selama 24 jam.
Perhitungan populasi bakteri dilakukan dengan rumus:

Populasi bakteri = Jumlah Koloni
0,05 x 10-x x 0,1
Keterangan : x = tabung seri pengenceran ke-x
Perhitungan Sintesis Protein Bakteri
Perhitungan Sintesis Protein Bakteri menggunakan metode Makkar et al., (1981)
(Biochemistry Laboratory Procedures), dilanjutkan dengan menggunakan metode Lowry’s
(Lowry’s et al., 1951). Adapun tahapan pekerjaan sebagai berikut :

1.) Pembuatan Reagen pembentukan kompleks
Reagen pembentukan kompleks dibuat dengan cara terlebih dahulu membuat tiga
jenis larutan. Larutan A yaitu 2%b/v Na2CO3 dalam akuades. Larutan B yaitu 1%b/v
CuSO4.5H2O dalam akuades. Dan larutan C yaitu 2%b/v Kalium Natrium tartrat dalam
akuades. Ketiga larutan-larutan tersebut kemudian dicampur menjadi satu dengan
perbandingan 100:1:1.
2.) Larutan NaOH 2N
3.) Pembuatan Reagen Folin-Ciocalteu
Reagen Folin-Ciocalteu dibuat dengan cara 100 g sodium tungstate dimasukkan ke
dalam labu erlemeyer berukuran 500 ml, ditambah 25 g sodium molibdate, 700 ml akuades,
50 ml asam phosphate, dan 100 ml HCl. Campuran direfluks selama 10 jam, tambahkan 150
ml lithium sulfat, 50 ml akuades dan beberapa tetes bromine (Br 2). Campuran (tanpa
pendingin) didihkan sekitar 15 menit (hingga kelebihan bromine habis). Campuran dinginkan

kembali, lalu diencerkan dengan akuades hingga 1 L, dan campuran disaring (filtrat berwarna
kehijauan). Sebelum digunakan, campuran diencerkan 1 bagian filtrat dengan 5 bagian
akuades.
Prosedur pengukuran sintesis protein mikroba, mula-mula dipersiapkan alat destilasi
yaitu dengan memasukkan cairan rumen sebanyak 20 ml, didestiler dengan kecepatan 400
rpm selama 45 detik. Hal ini bertujuan untuk memisahkan antara bakteri dengan sampel.

Sampel kemudian disentrifuse pada 408 gravitasi selama 5 menit, yang bertujuan untuk
menurunkan jumlah populasi protozoa dalam cairan rumen dan juga untuk menghilangkan
partikel pakan yang masih tersisah.
Aliquot (cairan rumen yang telah disentrifuse pada 408 gravitasi, dengan penururnan
jumlah populasi proptozoa yang juga terpisah dari partikel pakan) diambil sebanyak 10 ml
dan ditambahkan TCA (tricloro acetic acid ) 64,5% sebanyak 2,5 ml pada masing-masing
sampel. Sampel kemudian disentrifuse 15.000 rpm selama 20 menit, setelah itu supernatan
dibuang dan diperoleh sel/endapan yang diambil dan dicuci dengan air destilasi. Sel/endapan
kemudian disentrifuse kembali dengan 15.000 rpm selama 20 menit. Hasil yang diperoleh
berupa supernatan dan sel/endapan, supernatan dibuang kembali yang dibutuhkan hanya
sel/endapan saja, endapan tersebut ditambahkan larutan NaOH 0,25N sebanyak 30 ml.
Endapan dipanaskan dengan air mendidih selama 10 menit. Supernatan yang dihasikan
diambil untuk dikoleksi dari masing-masing sampel sebanyak 1 ml untuk analisis protein
mikroba dilanjutkan dengan metode Lowry’s.
Sampel yang diambil dari masing-masing perlakukan sebanyak 1 ml masih dalam
bentuk endapan, maka terlebih dahulu diencerkan dengan NaOH 2N sebanyak 1 ml,
kemudian dihidrolisis pada 100o C selama 10 menit pada penangas air. Sampel lalu dinginkan
pada suhu ruangan, tambahkan 5 ml reagen pembentukan kompleks. Biarkan larutan selama
10 menit pada suhu kamar. Tambahkan 0,5 ml reagen Folin-Ciocalteu, lalu homogenkan
dengan vortex, biarkan selama 30-60 menit (jangan sampai lebih dari 60 menit). Kemudian

baca absorbansi pada 660 nm jika konsentrasi protein di bawah 500 µg/ml atau 550 nm jika
konsentrasi protein antara 100-2000 µg/ml.
Rancangan Percobaan
Perlakuan Penelitian
Penelitian dilakukan secara in vitro, dengan pakan yang digunakan dalam bentuk
campuran antara rumput gajah dan pakan penguat. Masing-masing perbandingan rasio
hijauan dan pakan penguat adalah 30:70, 50:50 dan 70:30. Setiap perbandingan rasio hijauan

dan pakan penguat mendapatkan perlakuan yaitu 0 (sebagai kontrol), penambahan ekstrak
lerak (1 mg/ml) dan ekstrak lerak (1 mg/ml) yang difortifikasi dengan mineral mix (Ca, P,
Mg, dan S). Kandungan masing-masing mineral mix (Ca, P, Mg, dan S) berturut-turut adalah
0,54%, 0,37%, 0,23%, dan 0,1%, berdasarkan acuan NRC 1994. Susunan ransum percobaan
adalah sebagai berikut:
0
R : K = 70 : 30

ekstrak lerak (1 mg/ml)
ekstrak lerak (1 mg/ml) plus mineral mix
0

R : K = 50 : 50

ekstrak lerak (1 mg/ml)
ekstrak lerak (1 mg/ml) plus mineral mix

0
R : K = 30 : 70

ekstrak lerak (1 mg/ml)
ekstrak lerak (1 mg/ml) plus mineral mix

Ket :
R
K
mineral mix

: Rumput
: Kosentrat
: Mineral (Ca, P, Mg, dan S) yang difortifikasi dalam ekstrak
lerak

Model
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok
(RAK) pola faktorial 3x3 denga 4 ulangan dan masing-masing sampel dibuat duplo. Faktor
pertama adalah rasio rumput dengan pakan penguat (70:30, 50:50, 30:70), dan faktor kedua
adalah jenis pemberian supleman (0, ekstrak lerak 1 mg/ml dan ekstrak lerak 1 mg/ml +
mineral mix). Model matematika yang digunakan adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie,
1991).
Yijk = µ + τi + ßj+ (τß)ij + ρk + εijk
Keterangan :
Yij

= Nilai pengamatan pada faktor A taraf ke-i faktor B taraf ke-j dan kelompok ke-k

µ

= Nilai rataan umum

i

= Efek perlakuan ke-i

βj

= Efek kelompok ke-j

( ß)ij

= Komponen

interaksi dari faktor A dan faktor B

ρk

ijk

= Pengaruh

aditif dari kelompok dan diasumsikan bersifat aditif

= pengaruh acak yang menyebar normal (0,

2
 )

Perubahan yang Diamati
Perubahan yang diamati selama penelitian ini adalah sebagai berikut :
1) Kecernaan bahan kering dan kecernaan bahan organik yang dianalisis dengan
menggunakan metode (Tilley and Terry, 1963)
2) Konsentrasi NH3 (Amonia) yang diukur dengan menggunakan metode Mikrodifusi
Conway (General Laboratory Procedures, 1966)

3) Konsentrasi VFA (Volatile Fatty Acids) yang diukur dengan menggunakan Teknik
Destilasi Uap (General Laboratory Procedures, 1966)
4) Populasi protozoa total yang dihitung dengan metode Ogimoto dan Imai (1981)
5) Populasi bakteri total yang dihitung dengan menggunakan metode Ogimoto dan Imai
(1981)
6) Sintesis protein bakteri yang diukur dengan menggunakan metode Makkar et al., (1981)
(Biochemistry Laboratory Procedures), dilanjutkan dengan menggunakan metode
Lowry’s (Lowry’s et al., 1951)