Optimasi dan validasi metode penetapan kadar bisfenol A. dalam ekstrak air dan ekstrak botol air minum menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik - USD Repository
OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR BISFENOL A DALAM EKSTRAK AIR DAN EKSTRAK BOTOL AIR MINUM MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi Oleh:
Ina Juni Natasia NIM : 098114023
FAKULTAS FARMASI
OPTIMASI DAN VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR BISFENOL A DALAM EKSTRAK AIR DAN EKSTRAK BOTOL AIR MINUM MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)
Program Studi Farmasi Oleh:
Ina Juni Natasia NIM : 098114023
FAKULTAS FARMASI
HALAMAN PERSEMBAHAN
Bila gunung di hadapanku tak jua berpindah
Kau berikanku kekuatan untuk mendakinya
Kulakukan yang terbaikku, Kau yang selebihnya
Tuhan selalu punya cara
Membuatku menang pada akhirnya
- Lirik Lagu Tuhan Selalu Punya Cara- Karya ini aku persembahkan untuk orang tua, keluarga, sahabat, dan almamaterku tercinta
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus karena berkat kasih karunia- Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul
“Optimasi dan Validasi Metode Penetapan Kadar Bisfenol A dalam Ekstrak Air dan Ekstrak Botol Air Minum Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik
” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Dalam pelaksanaan penelitian hingga penyusunan skripsi ini, penulis banyak mendapatkan bantuan dan dukungan dari banyak pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1.
Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. C.M. Ratna Rini Nastiti, M.Pharm., Apt., selaku Ketua Program Studi Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta yang turut memberikan saran dan masukan untuk penulis selama tahap penelitian.
3. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt., selaku dosen pembimbing yang telah memberikan pengarahan, bantuan, tuntunan, kritik, dan saran sejak awal penelitian hingga akhir penyusunan skripsi ini.
4. Jeffry Julianus, M.Si. dan Lucia Wiwid Wijayanti, M. Si., selaku dosen penguji atas segala masukan dan bimbingannya.
6. Pak Sanjaya, atas segala ilmu dan bantuan yang diberikan selama proses penelitian.
7. Segenap dosen yang telah berkenan membagikan ilmu kepada penulis selama belajar di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
8. Teman seperjuangan skripsi, Topan dan Leo, untuk kerja sama, tawa, canda, dan air mata yang dirasakan bersama.
9. Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto, Mas Kethul, Mas Ottok dan seluruh staf laboratorium Fakultas Farmasi serta staf keamanan dan kebersihan Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas bantuan dan kerja samanya.
10. Teman satu bimbingan skripsi, Jimmy, Yuli, Rachel, Nety, dan Jo.
11. Teman seperjuangan di laboratorium Kimia Analisis Instrumental, Novia, Agnes, Victor, Shinta, Shasya, Metri, Teti, Febrin, Wisnu, dan Ozy.
12. Teman-teman FST A 2009 dan seluruh angkatan 2009 atas dukungan dan suka duka yang diberikan, semoga pengalaman yang telah kita lalui bersama bisa menjadi bekal untuk perjuangan hidup kita kelak.
13. Teman sepermainan, Raisa, Ree, Ningsih, Chissa, Kenny, Wanda, Atin, Nopes, Listya, Bee, Melisa, Agnes, Eva, Adit, Ana Boy, Frisca, dan Nonny.
14. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis dalam pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini karena keterbatasan dari kemampuan penulis. Oleh karena semua pihak. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan berguna bagi dunia ilmu pengetahuan.
Yogyakarta, 17 Juli 2013 Penulis
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ..................................................................... iii PERNYATAAN KEASLIAN PENULIS ................................................... iv LEMBAR PERNYATAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ......... v HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. vi PRAKATA .................................................................................................. vii DAFTAR ISI ............................................................................................... x DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xvi DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xix
INTISARI .................................................................................................... xxi ABSTRACT............................................ .................................................... xxii BAB I PENGANTAR .................................................................................
1 A. Latar Belakang .....................................................................................
1 1. Permasalahan ................................................................................
6 2. Keaslian Penelitian........................................................................
6 3. Manfaat Penelitian ........................................................................
8 B. Tujuan Penelitian .................................................................................
8 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA..........................................................
9
C.
11 Metode untuk Analisis Bisfenol A .......................................................
1.
12 Liquid chromatography – ultraviolet ............................................
2.
12 Liquid chromatography – fluorescence ........................................
3. Liquid chromatography – mass spectrometry atau Liquid
chromatography
12 – tandem mass spectrometry .............................
4.
12 Gas chromatography – MS ...........................................................
D.
13 Spektrofotometri Ultraviolet ................................................................
E.
14 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .......................................................
1.
14 Definisi dan Instrumentasi ............................................................
2.
21 Pemisahan Puncak dalam Kromatografi .......................................
F.
33 Validasi Metode Analisis .....................................................................
G.
35 Landasan Teori .....................................................................................
H.
38 Hipotesis ..............................................................................................
BAB III METODOLOGI PENELITIAN....................................................
39 A.
39 Jenis dan Rancangan Penelitian ...........................................................
B.
39 Variabel Penelitian ...............................................................................
1.
39 Variabel bebas ...............................................................................
2.
39 Variabel tergantung .......................................................................
3.
39 Variabel pengacau terkendali ........................................................
C.
40 Definisi Operasional ............................................................................
D.
40 Bahan Penelitian ..................................................................................
1.
41 Penyiapan fase gerak asetonitril : air ............................................
2.
42 Pembuatan seri larutan baku bisfenol A .......................................
3.
43 Penyiapan sampel..........................................................................
4.
43 Optimasi KCKT fase terbalik .......................................................
5. Validasi Penetapan Kadar Bisfenol A dengan KCKT Fase Terbalik .........................................................................................
44 G.
46 Analisis hasil ........................................................................................
1.
46 Analisis Hasil Optimasi ................................................................
2.
49 Analisa Hasil Validasi...................................................................
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................
52 A.
52 Preparasi Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ...........................
1.
52 Penetapan Panjang Gelombang Maksimum Bisfenol A................
2.
56 Pembuatan Fase Gerak ..................................................................
3.
59 Pembuatan Larutan Kerja untuk Optimasi ....................................
B.
Optimasi Komposisi Fase Gerak dan Kecepatan Alir pada KCKT untuk Penetapan Kadar Bisfenol A .....................................................
60 C.
82 Validasi Metode Penetapan Kadar Bisfenol A ....................................
1.
82 Selektifitas .....................................................................................
2.
83 Pembuatan Kurva Baku dan Linearitas .........................................
3.
87 Akurasi...........................................................................................
4.
90 Presisi.............................................................................................
BAB V KESIMPULAN ..............................................................................
97 A. Kesimpulan ..........................................................................................
97 B. Saran ....................................................................................................
97 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................
98 LAMPIRAN ................................................................................................ 101 BIOGRAFI PENULIS ............................................................................... 173
DAFTAR TABEL
Tabel I. Nilai indeks polaritas beberapa pelarut pada KCKT fase terbalik.................................................................................
16 Tabel II. Data yang diperlukan untuk uji validasi ..............................
34 Tabel III. Komposisi optimasi fase gerak ............................................
41 Tabel IV. Persen perolehan kembali yang dapat diterima pada beberapa tingkat konsentrasi analit berdasarkan Gonzales and Herrador........................................................................
50 Tabel V. Persen perolehan kembali yang dapat diterima pada beberapa tingkat konsentrasi analit berdasarkan Horwitz and AOAC PVM .................................................................
51 Tabel VI. Serapan baku bisfenol A dalam pelarut metanol pada panjang gelombang maksimum...........................................
54 Tabel VII. Komposisi fase gerak, indeks polaritas, dan pH ..................
56 Tabel VIII. Waktu retensi baku bisfenol A, sampel air, dan sampel botol dengan beberapa komposisi fase gerak pada kecepatan alir 1 mL/menit ...................................................
62 Tabel IX. Nilai tailing factor, resolusi, jumlah lempeng (N), HETP, ∝, dan k’ pada berbagai komposisi fase gerak dan kecepatan alir ......................................................................
64 Tabel X. Nilai koefisien variasi AUC dan waktu retensi baku
Tabel XII. Hasil persamaan regresi linier baku bisfenol A ...................
84 Tabel XIII. Perhitungan perolehan kembali baku adisi pada sampel air
88 Tabel XIV. Perhitungan perolehan kembali baku adisi pada sampel botol .....................................................................................
89 Tabel XV. Persen perolehan kembali yang dapat diterima pada beberapa tingkat konsentrasi analit berdasarkan Gonzales and Herrador ........................................................................
89 Tabel XVI. Persen koefisien variasi baku bisfenol A dan bisfenol A dalam sampel air ..................................................................
91 Tabel XVII. Persen koefisien variasi baku bisfenol A dan bisfenol A dalam sampel botol ..............................................................
92 Tabel XVIII. Persen perolehan kembali yang dapat diterima pada beberapa tingkat konsentrasi analit berdasarkan Horwitz and AOAC PVM .................................................................
92 Tabel XIX. Persen perolehan kembali dan persen koefisien korelasi adisi bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol setelah proses ekstraksi ....................................................................
94
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur bisfenol A ..............................................................10 Gambar 2. Proses kromatografi .............................................................
15 Gambar 3. Diagram sistem KCKT ........................................................
20 Gambar 4. Kromatogram yang menunjukkan waktu retensi (t R ), waktu kosong (t ), lebar dasar puncak (W b ), dan tinggi puncak (h) ........................................................................................
22 Gambar 5. Pengaruh k’, ∝, dan N pada pemisahan...............................
24 Gambar 6. Diagram yang menunjukkkan perhitungan tailing factor (Tf) serta diagram yang menunujukkan fronting dan
tailing ..................................................................................
27 Gambar 7. Kurva persamaan van Deemter yang menunjukkan hubungan antara HETP lawan kecepatan linear rata-rata ...
29 Gambar 8. Kurva persamaan van Deemter dengan tiga kolom kemas ukuran partikel 10, 5, dan 3 µm ..........................................
30 Gambar 9. H ubungan log k’ vs % organic solvent modifier untuk metanol, asetonitril, dan tetrahidrofuran .............................
31 Gambar 10. Difusi Eddy ..........................................................................
31 Gambar 11. Distribusi aliran ..................................................................
32 Gambar 12. Pelebaran pita oleh difusi longitudinal ................................
32 Gambar 13. Transfer massa .....................................................................
33
Gambar 16. Kurva absorbansi pada panjang gelombang maksimum vs konsentrasi baku bisfenol A ................................................
56 Gambar 17. Bentuk bisfenol A pada berbagai pH ...................................
57 Gambar 18. Bagian polar dan polar pada bisfenol A ..............................
61 Gambar 19. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (75 : 25) dan kecepatan alir 0,5 mL/menit ................................................
68 Gambar 20. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (75 : 25) dan kecepatan alir 0,8 mL/menit ................................................
69 Gambar 21. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (75 : 25) dan kecepatan alir 1 mL/menit ...................................................
70 Gambar 22. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (80 : 20) dan kecepatan alir 0,5 mL/menit ................................................
72 Gambar 23. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (80 : 20) dan kecepatan alir 0,8 mL/menit ................................................
73 Gambar 24. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (80 : 20) dan kecepatan alir 1 mL/menit ...................................................
74 Gambar 25. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (70 : 30) dan kecepatan alir 0,5 mL/menit ................................................
76 Gambar 26. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (70 : 30) dan kecepatan alir 0,8 mL/menit ................................................
77 Gambar 27. Kromatogram pada fase gerak asetonitril : air (70 : 30) dan
Gambar 28. Perbandingan peak bisfenol A dari sampel air dengan komposisi fase gerak (70 : 30) pada berbagai kecepatan alir .......................................................................................
80 Gambar 29. Perbandingan peak bisfenol A dari sampel botol dengan komposisi fase gerak (70 : 30) pada berbagai kecepatan alir .......................................................................................
80 Gambar 30. Kurva hubungan AUC vs konsentrasi bisfenol A menggunakan program Powerfit (Utrecht University
Faculteit Scheikunde ), dengan tarap kepercayaan 95% ......
85 Gambar 31. Kurva hubungan AUC vs konsentrasi bisfenol A menggunakan program Powerfit (Utrecht University
Faculteit Scheikunde ), dengan tarap kepercayaan 95%
pada rentang bawah (0,01
- – 0,8 µg/mL) ............................. 85 Gambar 32. Kurva hubungan AUC vs konsentrasi bisfenol A menggunakan program Powerfit (Utrecht University
Faculteit Scheikunde ), dengan tarap kepercayaan 95% pada rentang atas (1 - 11 µg/mL) ........................................
86
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Label standar bisfenol A (E. Merck) ................................... 102 Lampiran 2. Spektrum baku bisfenol A ................................................... 103 Lampiran 3. Absorbansi dan panjang gelombang maksimum bisfenol A pada beberapa tingkat konsentrasi ...................................... 106 Lampiran 4. Kurva absorbansi vs konsentrasi bisfenol A ....................... 106 Lampiran 5. Perhitungan indeks polaritas fase gerak .............................. 107 Lampiran 6. Kromatogram baku bisfenol A dan bisfenol A pada ekstrak air dan ekstrak botol air minum .......................................... 107 Lampiran 7. Nilai tailing factor, resolusi, N, HETP,
∝, dan k’
pada berbagai komposisi fase gerak dan kecepatan alir .............. 117 Lampiran 8. Contoh perhitungan resolusi, tailing factor, N, HETP,
∝, dan k’ ................................................................................... 119 Lampiran 9. Koefisien variasi AUC dan waktu retensi baku bisfenol A . 121 Lampiran 10. Rata-rata resolusi puncak bisfenol A pada baku, ekstrak air, dan ekstrak botol ........................................................... 121 Lampiran 11. Kromatogram bisfenol A untuk pembuatan kurva baku, penentuan linearitas, dan rentang, menggunakan fase gerak dan kecepatan alir hasil optimasi .............................. 122
Lampiran 12. Konsentrasi dan AUC bisfenol A untuk kurva baku ........... 135 Lampiran 13. Perhitungan LOD................................................................. 140
Lampiran 15. Kromatogram bisfenol A dalam ekstrak air dengan adisi baku untuk penentuan akurasi, presisi, dan LOQ ............... 142 Lampiran 16. Perhitungan persen perolehan kembali (recovery), persen
CV, dan LOQ untuk ekstrak air .......................................... 151 Lampiran 17. Kromatogram bisfenol A dalam ekstrak botol dengan adisi baku untuk penentuan akurasi, presisi, dan LOQ ............... 155 Lampiran 18. Perhitungan persen perolehan kembali (recovery), persen
CV, dan LOQ untuk sampel botol ...................................... 165 Lampiran 19. Akurasi dan presisi adisi bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol sebelum diinjek ke KCKT ............................. 169
INTISARI
Bisfenol A merupakan monomer dari polikarbonat, bahan pembuat botol minum, yang dapat terlepas dari botol akibat hidrolisis karena peningkatan suhu dan degradasi oleh sinar ultraviolet. Bisfenol A dapat menghalangi aktivitas hormon estrogen yang penting dalam sistem imunitas dan reproduksi. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui kondisi optimum dan validitas dari metode KCKT sehingga dapat digunakan untuk penetapan kadar bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol yang telah diberi perlakuan dengan sinar matahari.
Jenis rancangan penelitian ini adalah eksperimental deskriptif. Sistem KCKT fase terbalik dalam penelitian ini menggunakan fase diam C-18, detektor UV pada
λ 278 nm. Optimasi dilakukan pada komposisi fase gerak asetonitril : air serta kecepatan alir. Kondisi optimum yang diperoleh, yaitu komposisi fase gerak asetonitril : air (70 : 30) dengan kecepatan alir 1 mL/menit yang memenuhi kriteria untuk resolusi, tailing factor, N, HETP,
∝, dan k’. Metode ini pada kondisi yang optimum dapat memenuhi parameter validasi yang baik dengan selektifitas yang baik (resolusi > 1,5); linearitas dengan r > 0,98; recovery 80,13
- – 104,34%; CV 0,72 – 10,13%; rentang 0,3 – 5 µg/mL; LOD 0,0473 µg/mL; LOQ untuk ekstrak air dan ekstrak botol, masing-masing 0,0063 µg/mL dan 8,4701 µg/g.
Kata kunci: bisfenol A, optimasi metode, validasi metode, KCKT fase terbalik
ABSTRACT
Bisphenol A is a monomer of polycarbonate, material for drinking bottle, which can be released from the bottle because of the increased temperature due to hydrolysis and degradation by ultraviolet ray. Bisphenol A can block the activity of the hormone estrogen which is important in the immune and reproductive systems. The purpose of this study is to determine the optimum conditions and the validity of the HPLC method that can be used for the determination of bisphenol A in water extract and bottle extract that had been treated with sunlight.
This research design is experimental descriptive. Reversed-phase HPLC system in this study uses a C- 18 stationary phase, UV detector at λ 278 nm.
Optimization is done on the mobile phase composition of acetonitrile : water and flow rate.
The optimum conditions are obtained where mobile phase composition of acetonitrile : water (70: 30) with a flow rate of 1 mL/minute those meet the criteria for resolution, tailing factor, N, HETP,
∝, and k’. This method at optimum conditions has a good validation parameters with good selectivity (resolution > 1,5); linearity with r > 0,98; recovery 80,13
- – 104,34%; CV 0,72 – 10,13%; range of 0,3 - 5 µg/mL; LOD 0,0473 µg/mL; LOQ for water extract and bottle extract, each of 0,0063 µg/mL and 8,4701 µg/mL.
Keywords: bisphenol A, method optimization, method validation, reversed-phase HPLC
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Wadah dari bahan plastik sangat luas digunakan pada saat ini, terutama
sebagai wadah makanan dan minuman. Bahan plastik diminati karena sifatnya yang kuat, ringan, dan harganya yang relatif terjangkau. Biasanya bahan plastik ini banyak digunakan sebagai bahan pembuat botol minum, karena sifatnya yang ringan sehingga mudah dibawa. Namun tidak semua wadah plastik penyusun botol minum itu aman. Jika tidak berhati-hati, materi yang berasal dari komponen penyusun plastik akan berdampak buruk bagi kesehatan.
Plastik terdiri atas berbagai bahan kimia. Dalam kondisi tertentu, kontak antara plastik dan makanan bisa menyebabkan migrasi bahan-bahan kimia dari wadah ke makanan. Migrasi terjadi akibat pengaruh suhu panas makanan, penyimpanan, atau proses pengolahannya. Semakin tinggi suhu maka semakin tinggi kemungkinan terjadi migrasi. Lamanya waktu penyimpanan makanan juga berpengaruh terhadap perpindahan materi berbahan kimia ini. Semakin lama kontak antara minuman dengan kemasan plastik, semakin tinggi jumlah bahan kimia yang bermigrasi ke minuman (Staples, et al., 1998).
Bisfenol A merupakan monomer dari polikarbonat yang biasa digunakan sebagai bahan pembuat botol minum. Paparan bisfenol A pada manusia dapat bisfenol A). Bisfenol A memiliki struktur mirip dengan ekstrogen dalam tubuh dan dapat mengganggu aktifitas hormon ekstrogen yang penting dalam sistem imunitas dan reproduksi. Bisfenol A adalah endocrine discrupting chemical (EDC) yang mengganggu produksi, pelepasan, transportasi, metabolisme, pengikatan, aksi, dan eliminasi hormon alami manusia (US-FDA, 2008).
Pemejanan bisfenol A pada manusia salah satunya terjadi melalui minuman yang mengandung bisfenol A yang terlepas dari botol. Lepasnya suatu monomer bisfenol A dapat terjadi akibat hidrolisis yang disebabkan peningkatan suhu dan degradasi oleh sinar ultraviolet. Matahari merupakan sumber panas dan dapat memancarkan sinar ultraviolet yang diduga dapat menyebabkan lepasnya monomer bisfenol A dari botol ke minuman di dalam botol.
Indonesia merupakan salah satu negara dengan iklim tropis di dunia. Hal ini menyebabkan matahari bersinar sepanjang tahun dengan intensitas yang relatif tinggi dibandingkan dengan negara-negara lainnya. Botol minum plastik yang biasa dibawa ke mana pun orang-orang beraktifitas, memiliki kemungkinan besar terpapar oleh radiasi sinar matahari, terutama jika beraktifitas di luar ruangan. Paparan ini dapat menyebabkan putusnya ikatan polimer penyusun plastik. Putusnya ikatan polimer ini menyebabkan monomer-monomer penyusunnya meluruh dan bermigrasi menuju ke minuman yang ada di dalamnya dan terjadilah pemaparan zat berbahaya tersebut ke dalam minuman.
Deteksi bisfenol A pada lingkungan, air minum, dan produk makanan
European Commission sebagai zat yang berasal dari luar tubuh dengan efek yang
berbahaya bagi kesehatan manusia. Beberapa studi toksikologi dan biokimia menegaskan bahwa bisfenol A memiliki sifat estrogenik dan efek agonis terhadap reseptor estrogen. Dalam studi terbaru, bisfenol A diklasifikasikan sebagai xenobiotik yang mengganggu keseimbangan hormonal pada manusia dan hewan lainnya, sehingga disebut pengganggu endokrin. Bisfenol A terbukti memiliki
- 1
aktifitas estrogenik bahkan pada konsentrasi di bawah 1 ng L (Rykowska and Wasiak, 2006). Dosis perhari yang diperbolehkan (Tolerable daily intake/TDI) dari bisfenol A telah ditetapkan oleh European Food Safety Authority adalah sebesar 0,05 mg/kgBB/hari (EFSA, 2013). Negara besar lainnya juga menetapkan TDI untuk bisfenol A, seperti Eropa 0,01 mg/kgBB/hari (SCF, 2012); Amerika Serikat dan Kanada 0,025 mg/kgBB/hari (Health Canada, 2008); dan Jepang 0,05 mg/kgBB/hari (AIST, 2007). Oleh karena itu, perlu dilakukan penetapan kadar bisfenol A pada air dalam botol plastik plikarbonat dan dari botol itu sendiri.
Penetapan kadar bisfenol A pada air telah pernah dilakukan oleh Olmo,
- – Gonzakez-Casado, Navas, dan Vilchez (1997) menggunakan kromatografi gas spektra massa dengan ektraksi air menggunakan diklormetan dalam medium asam. Penetapan kadar bisfenol A dalam botol minum polikarbonat, makanan kaleng, dan air menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dengan detektor fluoresence, fase gerak metanol : air (65 : 35) dan fase diam C-18 pernah dilakukan oleh Chong, Aung, dan Leong (2011). Rykowska and Wasiak (2006)
Pada penelitian ini, peneliti akan melakukan penetapan kadar bisfenol A pada ekstrak air dalam botol dan ekstrak botol air minum yang diberi pengaruh penyinaran matahari tropis Indonesia dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik dengan fase gerak asetonitril : air dan fase diam C-
18. KCKT dipilih untuk analisis bisfenol A karena mampu memisahkan dari suatu campuran sekaligus menentukan kadarnya, mudah, cepat, sensitif, serta bisfenol A dapat dianalisis menggunakan KCKT secara langsung tanpa derivatisasi terlebih dahulu. Detektor UV dipilih karena bisfenol A memiliki kromofor yang dapat memberikan serapan di daerah UV.
ow
Bisfenol A yang memiliki log K 3,40 merupakan senyawa yang cenderung hidrofobik. Oleh karena itu, digunakan KCKT fase terbalik dimana fase diam lebih non polar dibandingkan dengan fase geraknya sehingga bisfenol A ini dapat berinteraksi dengan fase diam. Digunakan fase diam C-18 yang cocok untuk menganalisis senyawa dengan kepolaran rendah, sedang, dan tinggi, serta memiliki pH di antara 2,5-7,5. pH bisfenol A adalah ± 5 – 6. Fase diam C-18 ini cocok digunakan untuk senyawa yang memiliki log K ow lebih dari 2, seperti bisfenol A yang memiliki log K ow 3,40. Interaksi pada C-18 didasarkan pada interaksi hidrofobik atau van der Waals. Bagian cincin benzen dari bisfenol A merupakan bagian hidrofobik yang akan berinteraksi dengan fase diam. Untuk karena memiliki kekuatan elusi yang cukup besar pada fase diam C-18. Bisfenol A juga memiliki bagian polar (-OH) yang dapat berinteraksi dengan fase gerak yang polar sehingga bisfenol A dapat terelusi melalui kolom. Diperlukan fase gerak dengan kekuatan yang optimal agar dapat membuat bisfenol A tertahan pada fase diam, kemudian dapat terpisah dari senyawa lainnya di dalam matrik, dan kemudian dapat terelusi. Oleh karena itu, diperlukan optimasi komposisi fase gerak yang digunakan agar dapat memisahkan bisfenol A pada matrik.
Ekstraksi bisfenol A dari air dilakukan dengan ekstraksi fase padat atau
solid phase extraction (SPE). SPE digunakan untuk clean-up sampel-sampel yang
kotor, misalnya sampel-sampel yang mempunyai kandungan matrik yang tinggi seperti garam-garam, protein, polimer, resin, dan lain-lain (Watson, 2007).
Sementara itu, ekstraksi bisfenol A dari dalam botol dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan diklormetan dan aseton. Ekstraksi ini dilakukan untuk mengurangi pengotor pada matrik.
Adanya perbedaan perlakuan dan cara ekstraksi pada penelitian ini dari penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya, menyebabkan perlunya dilakukan optimasi dan validasi untuk penetapan kadar bisfenol A pada ekstrak air dalam botol plastik dan ekstrak botol air minum yang diberi pengaruh penyinaran matahari tropis Indonesia karena metode yang dilakukan sebelumnya belum tentu memberikan hasil yang optimal pada penelitian ini. Optimasi dilakukan juga untuk memperoleh komposisi fase gerak dan kecepatan alir yang optimal sehingga
Metode KCKT fase terbalik untuk penetapan kadar bisfenol A pada air minum dalam botol plastik dan botol air minum yang diberi pengaruh penyinaran matahari tropis Indonesia dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dengan fase gerak asetonitril : air dan fase diam C-18 yang telah optimum perlu dilakukan validasi metode analisis agar hasil yang diperoleh dapat dipertanggungjawabkan serta memberikan jaminan bahwa metode telah memenuhi persyaratan analisis. Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis anatara lain selektifitas, linearitas, akurasi, presisi, rentang, Limit of Detection (LOD), dan Limit of Quantitation (LOQ).
Penelitian ini merupakan penelitian pendahulu dari penelitian lain mengenai penetapan kadar bisfenol A pada air dalam botol dan botol air minum yang diberi pengaruh penyinaran matahari tropis Indonesia dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dengan fase gerak asetonitril : air dan fase diam C-18.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut.
a.
Berapakah perbandingan fase gerak asetonitril : air dan kecepatan alir yang optimal dalam pemisahan bisfenol A dari matrik sampel untuk penetapan kadar bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol air minum dengan b.
Apakah metode KCKT fase terbalik menggunakan fase diam C-18 dengan komposisi fase gerak asetonitril : air dan kecepatan alir yang optimal dalam penetapan kadar bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol air minum memiliki validitas yang baik dilihat dari selektifitas, linearitas, akurasi, presisi, rentang, LOD, dan LOQ yang dihasilkan? 2.
Keaslian Penelitian
Sejauh pengamatan peneliti, penelitian mengenai penetapan kadar bisfenol A dalam air maupun botol air minum telah pernah dilakukan sebelumnya.
Penetapan kadar bisfenol A pada air telah pernah dilakukan oleh Olmo,
- – Gonzakez-Casado, Navas, dan Vilchez (1997) menggunakan kromatografi gas spektra massa dengan ektraksi air menggunakan diklormetan dalam medium asam. Penetapan kadar bisfenol A dalam botol minum polikarbonat, makanan kaleng, dan air menggunakan KCKT fase terbalik dengan detektor fluoresence, fase gerak metanol : air (65 : 35) dan fase diam C-18 pernah dilakukan oleh Chong, Aung, dan Leong (2011). Rykowska and Wasiak (2006) pernah melakukan analisis bisfenol A yang terlepas dari botol susu bayi ke dalam air dan susu akibat pemanasan dengan KCKT fase terbalik dengan fase gerak asetonitril : air (75:25, v/v) dan fase diam C-18. Namun, penelitian mengenai optimasi dan validasi penetapan kadar bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol air minum yang diberi pengaruh penyinaran matahari tropis Indonesia dengan metode KCKT fase terbalik dengan fase gerak asetonitril : air dan fase diam C-18 belum pernah
3. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini nantinya diharapkan mempunyai manfaat sebagai berikut.
a.
Manfaat Teoritis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai optimasi perbandingan fase gerak asetonitril : air dan kecepatan alir serta parameter-parameter validitas dalam penetapan kadar bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol air minum dengan metode KCKT fase terbalik dengan fase diam C-18.
b.
Manfaat Praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan bagi ilmu pengetahuan mengenai optimasi perbandingan fase gerak asetonitril : air dan kecepatan alir serta parameter-parameter validitas dalam penetapan kadar bisfenol A dalam ekstrak air dan ekstrak botol air minum dengan metode KCKT fase terbalik dengan fase diam C-18.
B. Tujuan Penelitian
1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum KCKT pada pemisahan bisfenol A dalam matrik sampel (ekstrak air dan ekstrak botol air minum) dilihat dari resolusi, N, ∝, k’, HETP, dan tailing factor yang dihasilkan.
2. Penetapan kadar bisfenol A dengan sistem KCKT yang optimal dapat memenuhi parameter validasi metode analisis, yaitu selektifitas, linearitas, akurasi, presisi, rentang, LOD, dan LOQ.
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Plastik Polikarbonat Plastik polikarbonat merupakan plastik yang ringan, kuat, jernih, tahan
terhadap suhu tinggi dan tahan terhadap pengaruh listrik. Karena sifat-sifat tersebut, polikarbonat digunakan dalam berbagai produk seperti peralatan elektronik, media digital (misalnya CD, DVD), mobil, kaca konstruksi, peralatan kesehatan olahraga, dan alat kesehatan. Daya tahannya terhadap panas dan sifatnya yang tidak mudah pecah menyebabkan polikarbonat menjadi pilihan ideal untuk peralatan makan termasuk botol yang dapat digunakan kembali dan wadah penyimpanan makanan yang dapat digunakan untuk penyimpanan di dalam kulkas dan microwave (Polycarbonate/BPA Global Group, 2013).
Menurut penelitian oleh para peneliti dari Harvard School of Public Health, ditemukan adanya bisfenol A dalam urin partisipan yang selama seminggu minum dari botol polikarbonat. Hal ini menunjukkan bahwa wadah minum polikarbonat dapat melepaskan bahan kimia penyusunnya ke dalam minuman sehingga dapat ditemukan bisfenol A pada urin manusia (Harvard School of Public Health, 2009).
B. Bisfenol A
berdasarkan IUPAC 4-[2-(4-hydroxyphenyl)propan-2-yl]phenol (Chemaxon,
15
16
2
2013). Bisfenol A memiliki rumus C H O ; berat molekul 228,29 g/mol; C 78,92%; H 7,06%; O 14,02%. Diproduksi dari fenol dan aseton. Berbentuk kristal
o o
atau serpihan. Berbau fenolik ringan. Titik leleh 150-155
C. Ttitik didih 220 C. Praktis tidak larut dalam air. Larut dalam larutan basa, alkohol, aseton. Sedikit larut dalam karbon tertraklorida (The Merck Index, 2001). Menurut Cousins et al.
3,40 ow
(cit., WHO, 2006), bisfenol A memiliki koefisien partisi oktanol/air (K ) 10 sehingga merupakan senyawa yang hidrofobik, namun sedikit polar karena
a
memiliki dua gugus hidroksil. Bisfenol A memiliki pK 9,59-11,30. Kelarutan
o
bisfenol A dalam air adalah 120-300 mg/L pada 20-25 C (Staples, Dorn, Klecka, O’Block, and Harris, 1998).
Gambar 1. Struktur bisfenol A (Wasiak and Rykowska, 2006)
Bisfenol A merupakan komponen penyusun yang penting pada plastik polikarbonat. Sejumlah penelitian menunjukkan bahwa bisfenol A merupakan pengganggu endokrin pada hewan, termasuk pada permulaan kedewasaan seksual dini, merubah perkembangan dan organisasi jaringan kelenjar susu pada mamalia dan menurunkan produksi sperma pada keturunannya. Bisfenol A dapat bermigrasi ke dalam makanan dan minuman yang disimpan dalam wadah yang bisfenol A ini dapat diakibatkan degradasi oleh sinar ultraviolet, pengaruh pH, turbulensi, dan sinar matahari (Staples, Dorn, Klecka, O’Block, and Harris, 1998).
Paparan bisfenol A pada manusia dapat terjadi karena mengkonsumsi makanan atau minuman yang tercemar bisfenol A akibat penggunaan wadah polikarbonat (atau yang mengandung monomer bisfenol A). Bisfenol A memiliki struktur mirip dengan ekstrogen dalam tubuh dan dapat mengganggu aktifitas hormon ekstrogen. Bisfenol A adalah endocrine discrupting chemical (EDC) yang mengganggu produksi, pelepasan, transportasi, metabolisme, pengikatan, aksi, dan eliminasi hormon alami manusia (US-FDA, 2008).
Dosis perhari yang diperbolehkan (Tolerable daily intake/TDI) dari bisfenol A telah ditetapkan oleh European Food Safety Authority adalah sebesar 0,05 mg/kgBB/hari (EFSA, 2013). TDI di beberapa negara besar seperti Eropa 0,01 mg/kgBB/hari (SCF, 2012); Amerika Serikat dan Kanada 0,025 mg/kgBB/hari (Health Canada, 2008); dan Jepang 0,05 mg/kgBB/hari (AIST, 2007).
C. Metode untuk Analisis Bisfenol A
Bisfenol A dapat dianalisis menggunakan kromatografi cair secara langsung tanpa derivatisasi terlebih dahulu saat preparasi sampel. Kromatografi cair merupakan teknik yang paling banyak digunakan untuk analisis bisfenol A pada makanan dan sampel biologis. Berbagai macam detektor, termasuk UV, fluorosen, MS, dan tandem mass spectrometry (MS/MS), telah digunakan untuk
1. Liquid chromatography – ultraviolet
Bisfenol A memiliki kromofor sehingga dapat dideteksi menggunakan detektor UV. LOD pada analisis menggunakan detektor UV paling kecil 15 kali lebih besar daripada yang dihasilkan menggunakan detektor fluoresen (Cao, 2010).
2. Liquid chromatography – fluorescence
Detektor fluoresen sering digunakan untuk analisis bisfenol A dalam makanan dan sampel biologis dengan metode kromatografi cair. Bisfenol A dapat dideteksi menggunakan detektor fluoresen karena memiliki elektron π terkonjugasi pada dua cincin benzen (Cao, 2010).
3. Liquid chromatography – mass spectrometry atau Liquid chromatography – tandem mass spectrometry
LC-MS atau LC-MS/MS juga sering digunakan untuk analisis bisfenol A dalam makanan dan sampel biologis. Dengan kedua metode ini dapat diketahui spektrum massa analit sehingga dapat membantu dalam identifikasi puncak analit (Cao, 2010).
4. Gas chromatography – MS
GC-MS juga merupakan salah satu metode yang biasa digunakan untuk analisis bisfenol A dalam makanan dan sampel biologis karena resolusinya lebih besar dan LOD yang dihasilkan lebih kecil dibandingkan dengan metode LC-MS, namun diperlukan derivatisasi terlebih dahulu (Cao, 2010).
D. Spektrofotometri Ultraviolet
Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm. Jika suatu molekul dikenai suatu radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga energi molekul tersebut ditingkatkan ke level yang lebih tinggi, maka terjadi peristiwa penyerapan (absorpsi) energi oleh molekul. Untuk mengukur banyaknya radiasi yang diserap oleh suatu molekul sebagai fungsi frekuensi radiasi. Spektrum absorpsi merupakan suatu grafik yang menghubungkan antara banyaknya sinar yang diserap dengan frekuensi (dengan panjang gelombang) sinar. Allowed transtition untuk suatu molekul dengan struktur kimia yang berbeda adalah tidak sama sehingga spektra absorpsinya juga berbeda. Dengan demikian, spektra dapat digunakan sebagai bahan informasi yang bermanfaat untuk analisis kualitatif. Banyaknya sinar yang diabsorpsi pada panjang gelombang tertentu sebanding dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi, sehingga spektra absorpsi juga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Gandjar dan Rohman, 2007).
Serapan cahaya molekul dalam daerah spektrum ultraviolet dan visibel tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Spektrofotometri ultraviolet dan visibel dari senyawa-senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi diantara tingkatan-tingkatan tenaga elektronik. Terdapat keuntungan yang selektif dari serapan ultraviolet, yaitu gugus-gugus karakteristik dapat dikenal dalam molekul yang sangat kompleks. Spektrum ultraviolet menggambarkan hubungan
Kromofor merupakan ikatan rangkap terkonjugasi yang dapat menyerap radiasi pada daerah UV dan visibel. Auksokrom merupakan gugus jenuh yang terikat pada kromofor yang dapat mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum. Ciri auksokrom adalah gugus heteroatom yang langsung terikat pada kromofor, seperti
3 ,
2 . Pergeseran- –OCH –Cl, –OH, dan –NH batokromik merupakan pergeseran serapan ke arah panjang gelombang yang lebih panjang karena substitusi atau pengaruh pelarut, sedangkan pergeseran hipsokromik merupakan pergeseran serapan ke arah panjang gelombang yang lebih pendek karena substitusi atau pengaruh pelarut. Auksokrom dapat menyebabkan pergeseran batukromik (Sastrohamidjojo, 2001).
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 1.
Definisi dan Instrumentasi