Optimasi Clean Up ekstrak metanol, air teh hijau dengan menggunakan metode Solid Phase Extraction (SPE) untuk mendukung penetapan kadar kuersetin dalam teh hijau dengan kromatografi cair kinerja tinggi - USD Repository

  

OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU

DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION

(SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN

DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

  

TINGGI

SKRIPSI

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

  Program Studi Farmasi Oleh:

  Adi Wirasaputra NIM : 088114059

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2012

  Persetujuan Pembimbing OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION (SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

  Skripsi yang diajukan oleh: Adi Wirasaputra

  NIM : 088114059 telah disetujui oleh : Pembimbing Utama Prof. Dr. Sri Noegrohati Apt. tanggal...................................................

  Pengesahan Skripsi Berjudul OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION (SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

  oleh: Adi Wirasaputra

  NIM : 088114059 Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

  Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Pada tanggal:............................

  Mengetahui Fakultas Farmasi

  Universitas Sanata Dharma Dekan Ipang Djunarko, M. Sc., Apt.

  Panitia Penguji Tanda tangan : 1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. ...............

  2. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. ...............

  3. Jeffry Julianus, M. Si. ..............

  “Ketika jiwaku letih lesu di dalam aku, teringatlah aku kepada TUHAN, dan sampailah doaku kepada-Mu, ke dalam bait-Mu yang kudus.

  ” (Yunus 2:7)

  “Usaha yang sedang

• – sedang saja membuahkan hasil yang sedang
• – sedang saja. Tetapi usaha yang luar biasa membuahkan hasil yang luar biasa pula.

  ” (Toyotomi Hideyoshi)

  “Terbayangkan berarti terjangkau.” (Toyotomi Hideyoshi)

  Skripsi ini aku persembahkan kepada : Bapak, Mama, Bagus, dan Candra,

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

  Penulis menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang ditulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

  Apabila dikemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah ini, maka penulis bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang- undangan yang berlaku.

  Yogyakarta, 8 Juli 2012

  (Adi Wirasaputra)

  

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH UNTUK

KEPENTINGAN AKADEMIS

  Yang bertandatangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

  Nama : Adi Wirasaputra No Mahasiswa : 088114059

  Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

  

OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU

DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION

(SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN

DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI

  Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikan di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

  

PRAKATA

  Segala pujian dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan karena hanya dengan anugerah, berkat, cinta, kasih, dan pertolongan-Nya, penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul ”Optimasi Clean

  

Up Ekstrak Metanol Air Teh Hijau dengan Menggunakan Metode Solid

Phase Extraction (SPE) untuk Mendukung Penetapan Kadar Kuersetin

dalam Teh Hijau dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

  ”. Skripsi ini disusun guna memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi (S.Farm).

  Terselesaikannya penulisan laporan akhir ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak, karena itu penulis mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan dan segenap staf serta karyawan Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  2. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan petunjuk, saran, arahan, dan bimbingan kepada penulis dalam proses penyusunan skripsi ini.

  3. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. dan Bapak Jeffry Julianus, M. Si. selaku Dosen Penguji skripsi yang telah memberikan saran dan masukan demi kesempurnaan skripsi ini.

  4. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma : Mas Bimo, Mas Kunto, Pak Parlan, dan Pak Kethul yang telah banyak

  5. Pak Sanjaya dan Pak Acang atas bantuan selama menghadapi masalah dalam penelitian dan mau membagi ilmu yang tidak didapatkan selama kuliah.

  6. Keluarga Wirasaputra tercinta Bapak, Mama, Bagus, dan Candra terima kasih atas dukungan doa yang selalu membanjir tulus untukku yang membuatku berani bangkit lagi di kala terpuruk.

  7. Keluarga Mbah Putri yang selalu mendoakan segala perjuanganku Mbah Putri, Bulik Etik, Mas Hagai, Heraldi, Kezia, dan Brian.

  8. Alfonsus Rosario Heppy Dwiyoga, Paulus Setya Dharma dan Anastasia Filipa Veritas da Silva teman seperjuangkanku yang telah dengan sabar menghadapi semua kemalasanku, mendukung dan menyemangati aku selama masa-masa terpuruk di lab.

  9. Kawan-kawan seperjuangan di lab dan grup antistress: Eka Riusinta Wati, Melisa Dharmawan, Vinsensia Vica, M.G. Rosita Secoadi, Dhimas B.K., Novi Imoliana, Meiske Munda, Wilfrida Maria Dua, Margaretha Efa Putri, Yuni Rogan, dan Elisa atas kerja sama dan kebersamaan, dukungan dan keceriaan di lab selama penelitian ini.

  10. Monica Satya Resmi Yunita untuk momen

• – momen kebersamaan kita dulu dan terima kasih atas dukungan doa selama ini.

  11. Teman

• – teman FST 2008 yang selalu memberi bantuan, dukungan, dan berbagi keceriaan : Theresia Wijayanti, Anastasia Mardilla, Helena Angelina Kurniawan, Margareth Henrika Silow, Elya Findawati, Laurensius Widi Andhika Putra, Sari Tambunan, Aldo Sahala, Valentinus Widyawan, Edward

  12. Antonius Pandu W., Albertus Djanu Rombang, Alexius Ario P.W., dan Yosef Himawan Yudha terima kasih atas keluangan waktu untuk bersama pergi sejenak dari penatnya skripsi.

  13. Teman

• – teman FKK 2008 yang mau membantu dan selalu memberi dukungan untuk selesainya skripsi ini : Adityawarman, Perthy Melati Kasih, Ellen Sinaga, Paulina Marcellina, Pratiwi Setyaningsih, Gina Vinrensia, Marsyani, dan Tia.

  14. Serta semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

  Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan dan kelemahan karena keterbatasan pikiran, tenaga, dan waktu penulis. Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir kata semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca semua.

  Penulis

  

DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL .......................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................. iii HALAMAN PERSEMBAHAN .......................................................... iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................. v HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................... vi PRAKATA ......................................................................................... vii DAFTAR ISI ...................................................................................... x DAFTAR TABEL .............................................................................. xiii DAFTAR GAMBAR .......................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................... xvi

  INTISARI ........................................................................................... xvii

  

ABSTRACT ......................................................................................... xviii

BAB I PENGANTAR .........................................................................

  1 A. Latar Belakang ..............................................................................

  1 1. Permasalahan ..........................................................................

  3 2. Keaslian penelitian ..................................................................

  4 3. Manfaat penelitian ...................................................................

  4 B. Tujuan Penelitian ..........................................................................

  4 BAB II PENELAHAAN PUSTAKA ..................................................

  5

  B. Flavonoid .....................................................................................

  14 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ....................................................

  17 3. Skrining metode clean up ........................................................

  2. Ekstraksi denga menggunakan metode sokhlet sekaligus hidrolisis

  17

  17 1. Pembuatan serbuk daun teh .....................................................

  16 F. Tata Cara Penelitian .....................................................................

  15 E. Alat Penelitian .............................................................................

  15 D. Bahan Penelitian ..........................................................................

  14 C. Definisi Operasional..........................................................................

  14 B. Variabel Penelitian............................................................................

  13 BAB III METODE PENELITIAN ......................................................

  5 C. Kuersetin .....................................................................................

  12 I. Hipotesis..........................................................................................

  12 H. Landasan Teori ............................................................................

  10 2. Kromatografi partisi fase terbalik.................................................

  10 1. Definisi dan instrumentasi KCKT................................................

  9 G. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ..................................

  7 2. Fase SPE......................................................................................

  7 1. Prosedur SPE ...........................................................................

  7 F. Solid Phase Extraction (SPE) .......................................................

  7 E. Soxhlet..............................................................................................

  6 D. Ekstraksi ......................................................................................

  17

  5. Optimasi volume fase gerak (eluen) .........................................

  44 F. Penentuan kapasitas kolom SPE ...................................................

  52 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................

  50 LAMPIRAN .......................................................................................

  49 DAFTAR PUSTAKA .........................................................................

  49 B. Saran ............................................................................................

  49 A. Kesimpulan ..................................................................................

  46 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN...............................................

  29 E. Optimasi volume fase gerak (eluen) .............................................

  20 6. Penentuan kapasitas kolom SPE ..............................................

  27 D. Optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE................................

  24 C. Skrining metode clean up .............................................................

  24 B. Ekstraksi denga menggunakan metode sokhlet sekaligus hidrolisis

  24 A. Pembuatan Serbuk Daun Teh .......................................................

  22 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................

  21 G. Analisis Hasil Optimasi ................................................................

  72

  

DAFTAR TABEL

  Halaman Tabel I. Indeks polaritas larutan kimia .................................... .....

  10 Tabel II. SPE 28 – KLT densitometri.................................................... Tabel III. Ekstraksi cair

  28 – cair............................................................ Tabel IV. Rata

  42 – rata resolusi............................................................. Tabel V. Optimasi volume eluen........................................................

  44

  

DAFTAR GAMBAR

  Halaman Gambar 1. Kuersetin ........................................................................

  1 Gambar 2. Sisi aktif kuersetin ..........................................................

  6 Gambar 3. Interaksi antara kuersetin dengan pelarut metanol-air(90:10) ..........................................................

  26 Gambar 4. Reaksi hidrolisis pada suatu kuersetin glikon ..................

  27 Gambar 5. Kromatogram baku kuersetin 65 ppm .............................

  32 Gambar 6. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (silika)...........

  32 Gambar 7. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (silika)...........

  33 Gambar 8. Kromatogram hasil elusi dengan metanol.........................

  33 Gambar 9. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (diol) ...........

  36 Gambar 10. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (diol) ............

  36 Gambar 11. Kromatogram hasil elusi dengan metanol (diol) ..............

  37 Gambar 12. Kromatogram baku kuersetin 14 ppm (C18) ...................

  39 Gambar 13. Kromatogram hasil elusi dengan HCl 0,002 N (C18) ......

  39 Gambar 14. Kromatogram hasil elusi dengan metanol .......................

  40 Gambar 15. Kromatogram baku kuersetin 10 ppm .............................

  41 Gambar 16. Kromatogram fraksi metanol ..........................................

  41 Gambar 17. Kromatogram sampel sebelum SPE ................................

  43 Gambar 18. Kurva volume eluen vs AUC ..........................................

  45 Gambar 19. Kromatogram fraksi HCl 0,002 N pada pengisian 0,05 ml

  Gambar 20. Kromatogram fraksi HCl 0,002 N pada pengisian 0,1 ml sampel.................................................... ..........................

  47 Gambar 21. Kromatogram fraksi HCl 0,002 N pada pengisian 0,2 ml sampel ............................................................................

  47

  

DAFTAR LAMPIRAN

  Lampiran 1. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam C18 ..............................................................................

  53 Lampiran 2. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam diol...............................................................................

  55 Lampiran 3. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam silika ............................................................................

  58 Lampiran 4. Kromatogram optimasi volume ....................................

  61 Lampiran 5. Kromatogram kapsitas ..................................................

  64 Lampiran 6. Contoh cara perhitungan resolusi ..................................

  70 Lampiran 7. Contoh cara perhitungan efisiensi clean up ...................

  70 Lampiran 8 Contoh cara perhitungan t-test ......................................

  70

  

INTISARI

  Kuersetin merupakan senyawa berkhasiat yang terdapat dalam daun teh (Camelia sinensis). Senyawa flavonoid golongan flavonol ini dikenal memilki khasiat sebagai antioksidan kuat. Di dalam daun teh terdapat bermacam

• – macam senyawa dari golongan fenolik, tanin, pektin, katekin, dan vitamin. Tentunya ekstrak metanol air dari teh hijau mengandung senyawa
• – senyawa lain yang bisa mengganggu determinasi kuersetin dalam teh hijau. Oleh karena itu dalam penelitian ini digunakan metode Solid Phase Extraction (SPE) untuk mengurangi berbagai senyawa yang ikut terekstraksi agar kuersetin dapat dideterminasi tanpa adanya gangguan dari senyawa – senyawa tersebut.

  Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan sistem SPE optimal yang bisa mengurangi berbagai senyawa yang ikut terekstraksi sehingga dapat digunakan untuk determinasi kuersetin dalam ekstrak teh hijau. Optimasi dilakukan dengan pemilihan jenis fase diam (diol, silika, dan C18) dan fase gerak (aquabidest, metanol, etil asetat, n-heksana) serta volume fase gerak untuk mengelusi kuersetin.

  Sistem SPE terpilih adalah SPE kolom C18 dengan larutan pencuci 6 ml HCl 0,002 N dan larutan pengelusi 5

• – 10 ml metanol. Kondisi tersebut cukup efisien dalam memisahkan kuersetin dari koekstraktan dengan nilai resolusi 2,994 dan nilai efisiensi clean up 37,5 – 43,75%.

  Kata kunci : kuersetin, teh hijau, clean up, SPE

  

ABSTRACT

Quercetin is a pharmacologic component in green tea (Camelia sinensis).

  This flavonol flavonoid has a potential antioxidant effect. There are many components in green tea leaves such as phenolic components, tannin, pectin, cathecin, and vitamin. Aqueous methanolic green tea extract has many other components which can disturb the determination of quercetin in green tea sampel. Therefore Solid Phase Extraction is used in this study to reduce the number of co- extractants so it can support the determination of quercetin.

  This study is to determine the optimum conditions of Solid Phase Extraction system that fit for purpose. Optimation could be done by choosing the type of stationary phase (diol, silica, and C18) and the mobile phase (aquabidest, methanol, aethyl acetic, n-hexane) and the volume of mobile phase to eluting quercetin.

  The chosen SPE system is SPE C18 coloumn with 6 ml HCl 0,002 N as the washing solvent and 5

• – 10 ml methanol as the eluting solvent. That condition is enough efficient to separate quercetin from co-extractants which resolution value 2,994 and clean up efficiency value 37,5 – 43,75%.

  Keywords : quercetin, green tea, clean up, SPE

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Teh sudah tak asing lagi bagi masyarakat Indonesia. Menikmati teh bisa

  dengan dijadikan teh seduh, teh celup, hingga teh siap saji dalam kemasan. Teh hijau memiliki banyak kandungan di dalamnya, di antaranya adalah pektin, tanin, vitamin, dan termasuk di dalamnya adalah flavonoid. _{OH OH}

  HO O _OH OH O Gambar 1. Kuersetin Kuersetin merupakan salah satu turunan flavonoid golongan flavonol.

  Kuersetin memiliki khasiat sebagai antioksidan yang poten (Phani, Vinaykumar, Rao, and Sindhuja, 2010). Kuersetin sebagai senyawa antioksidan diperlukan oleh tubuh untuk menetralkan radikal bebas dan mencegah kerusakan sel normal oleh adanya radikal bebas. Senyawa antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan mendonorkan protonnya untuk berpasangan dengan elektron yang dimiliki radikal bebas sehingga reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas dapat dihambat.

  Kandungan flavonoid golongan lain dalam daun teh hijau (Camellia adalah epigalokatekin galat (log P = 2,38), epigalokatekin (log P = 1,2), epikatein galat, epikatekin (log P = 1,02), dan katekin (log P = 1,02). Epigalokatekin galat juga mempunyai aktivitas antioksidan (Kodama, Goncalves, Lajolo, and Genovese, 2010).

  Upaya mendapatkan fraksi analit yang bersih dari senyawa lain (clean

  up ) bisa ditempuh dengan cara Liquid

• – Liquid Extraction (LLE) maupun Solid

  Phase Extraction (SPE). LLE berdasarkan pada koefisien distribusi analit pada

  suatu pelarut dengan prinsip partisi. Pelarut yang digunakan untuk menghilangkan senyawa lain selain analit tidak boleh bercampur. SPE merupakan kromatografi kolom, dimana senyawa yang memiliki kepolaran mirip dengan fase diam atau dapat berinteraksi dengan fase diam akan tertahan sedangkan senyawa yang lain akan ikut terelusi. Dengan mempertimbangkan log P dari senyawa

• – senyawa selain kuersetin dan log P kuersetin sendiri (log P = 1,82), maka fase gerak SPE yang dipilih juga diharapkan mampu mengelusi kuersetin dengan sedikit mengelusi senyawa – senyawa lain.

  Adapun langkah dalam metode SPE adalah dengan pemilihan pelarut yang mampu menahan semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan, sementara senyawa

• – senyawa penganggu akan terelusi. Analit yang dituju (yang tertahan pada penjerap ini) selanjutnya dielusi dengan sejumlah kecil pelarut organik yang akan mengambil analit yang tertahan ini. Langkah lain adalah dengan mengusahakan supaya analit yang tertuju keluar (terelusi), sementara senyawa penganggu tertahan pada penjerap (Rohman, 2009). Selanjutnya analit

diinjeksikan pada alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang metodenya telah dioptimasi oleh Dwiyoga (2012).

  Pemilihan fase diam (C18, diol, dan silika) dan komposisi pelarut dalam metode SPE perlu dioptimasi untuk mendapatkan hasil yang optimum. Kondisi metode SPE dikatakan optimum jika memenuhi parameter

• – parameter berikut yaitu berkurangnya jumlah peak senyawa
• – senyawa lain yang terikut dalam ekstraksi yang dinyatakan dengan nilai efisiensi clean up, Area Under Curve (AUC) kuersetin terbesar dan didapatkan nilai Rs ≥ 1,5.

  Telah dilakukan penelitian tentang pemisahan kuersetin menggunakan metode SPE fase terbalik dalam tablet Ginkgo biloba (Mokgadi, Mmualefe, and Torto, 2009), namun bukan dalam teh hijau. Dengan tetap mengacu pada penelitian tersebut, optimasi dilakukan dengan mengubah

• – ubah komposisi atau jenis pelarut dan pemilihan fase diam (C18, diol, dan silika) serta menentukan
• – volume pengelusi. Ketiga faktor tersebut dapat mempengaruhi parameter parameter clean up yang optimum.

1. Permasalahan

  Berdasarkan latar belakang di atas, permasalahan yang dapat diuraikan sebagai berikut: bagaimanakah jenis fase diam dan fase gerak serta volume eluen yang sesuai supaya diperoleh efisiensi clean up yang baik, nilai resolusi

  ≥ 1,5 dan (AUC) kuersetin terbesar untuk mendukung penetapan kadar

  Area Under Curve

  kuersetin dalam ekstrak metanol air teh hijau?

  2. Keaslian penelitian

  Penelitian terhadap kuersetin dengan metode SPE telah dilakukan dalam suatu sediaan obat. Penelitian dengan judul “SampliQ OPT Solid Phase

  

Extraction Sorbent in the Cleanup of Flavonoids in Ginkgo Biloba by HPLC-

DAD

  ” dilakukan dengan menggunakan fase diam C18 dan larutan pengelusi metanol:air (5:95 v/v) serta metanol:amonium asetat (30:70 v/v) untuk memisahkan kuersetin dalam tablet Ginkgo Biloba (Mokgadi, Mmualefe, and Torto, 2009). Demikian, maka dapat dipastikan bahwa optimasi metode SPE kuersetin dalam teh hijau ini belum pernah dilakukan sebelumnya.

  3. Manfaat penelitian

  a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai penggunaan metode SPE pada proses ekstraksi kuersetin untuk penetapan kadar kuersetin dalam ekstrak metanol air teh hijau.

  b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terkait dengan pemilihan jenis fase diam, jenis fase gerak, dan volume eluen SPE yang terbaik untuk proses ekstraksi kuersetin untuk penetapan kadar kuersetin dalam ekstrak metanol air teh hijau.

B. Tujuan Penelitian

  Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan jenis fase diam dan fase gerak serta volume eluen yang sesuai supaya diperoleh efisiensi clean up yang baik, nilai resolusi

  ≥ 1,5 dan Area Under Curve (AUC) kuersetin terbesar untuk

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Kandungan Daun Teh Hijau (Camellia sinensis L.) Daun teh hijau (Camellia sinensis L.) mengandung substansi fenol dan

  substansi bukan fenol. Substansi fenol terdiri dari katekin yang punya empat turunan, yaitu epikatekin (EC), epikatekin galat (ECG), epigalokatekin (EGC) dan epigalokatekin galat (EGCG) serta flavonol terdiri dari kaempferol, kuersetin, dan mirisetin. Subtansi bukan fenol terdiri dari pektin, alkaloid, karbohidrat, klorofil, mineral, protein, dan asam amino (Soraya, 2007).

  Flavonol utama yang ada di dalam daun teh adalah kuersetin, kaempferol dan myrycetin. Flavonol ini, terutama terdapat dalam bentuk glikosidanya (berikatan dengan molekul gula) dan sedikit dalam bentuk aglikonnya (Hartoyo, 2003).

B. Flavonoid

  Aglikon flavonoid adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi bila dibiarkan dalam larutan basa, dan di samping itu terdapat oksigen, banyak yang akan terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih, atau suatu gula, flavonoid merupakan senyawa polar, maka umunya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetil

  Adanya gula yang terikat pada flavonoid, cenderung menyebabkan falvonoid mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut di atas dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).

C. Kuersetin

  Kuersetin merupakan senyawa berwarna kuning dan menjadi anhidrat pada suhu 95 - 97° C. Kelarutan : larut dalam asam asetat glasial, dalam larutan

  

aqueous alkaline dan praktis tidak larut dalam air (The Merck Index, 1989).

  Kuersetin memiliki gugus fungsi karbonil dan hidroksil sehingga dapat membentuk kompleks dengan beberapa ion logam (Makasheva, 2005).

  Kuersetin memiliki aktivitas antioksidan yang kuat karena memiliki tiga ciri pada strukturnya, yaitu 3’,4’-dihidroksi pada cincin B; 2,3-ikatan rangkap pada cincin C dan sebuah gugus 5-hidroksil pada cincin A. Ketiga ciri ini secara umum ditunjukkan pada gambar di bawah ini (Sibuea, 2006). _OH

  3 _{OH OH}

  2

  4 B _{HO O}

  8

  5

  2

  7 A C

  3

6 OH

  

4

_{OH O}

  5

D. Ekstraksi

  Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (DirJen POM, 1995).

  Ekstraksi adalah proses pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu campuran homogen menggunakan pelarut cair (solven) sebagai separating agent (Harborne, 1987). Pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat dapat dipermudah dengan mengetahui terlebih dahulu zat aktif yang dikandung simplisia (DirJen POM, 1986).

E. Soxhlet

  Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Penyarian dengan alat soxhlet menggunakan larutan yang dipanaskan terus menerus sehingga zat aktif yang tidak tahan pemanasan kurang cocok (DirJen POM, 2010).

F. Solid-Phase Extraction (SPE) 1. Prosedur SPE

  Ada dua strategi untuk melakukan penyiapan sampel menggunakan SPE

• – semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan, sementara senyawa senyawa penganggu akan terelusi. Analit yang dituju (yang tertahan pada penjerap ini) selanjutnya dielusi dengan sejumlah kecil pelarut organik yang akan mengambil analit yang tertahan ini. Strategi ini beramanfaat jika analit yang dituju berkadar rendah. Strategi lain adalah dengan mengusahakan supaya analit yang tertuju keluar (terelusi), sementara senyawa penganggu tertahan pada penjerap (Rohman, 2009).

  Tahap pertama menggunakan SPE adalah dengan mengkondisikan penjerap dengan pelarut yang sesuai. Penjerapa nonpolar seperti C

  18 dan penjerap

  penukar ion dikondisikan dengan mengalirinya menggunakan metanol lalu dengan akuades. Pencucian yang berlebihan dengan air akan mengurangi recovery analit.

  Penjerap

• – penjerap polar seperti diol, siano, amino, dan silika harus dibilas dengan pelarut nonpolar seperti metilen klorida (Rohman, 2009).

  Ada empat tahap dalam prosedur SPE, yaitu:

  a. Pengkondisian

  Cartridge (penjerap) dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi

  permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga perubahan

• – perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan dapat dihindari.

  b. Retensi (tertahannya) sampel Larutan sampel dilewatkan ke cartridge baik untuk menahan analit yang dituju, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan komponen yang c. Pembilasan Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.

  d. Elusi Tahap ini merupakan tahap terakhir untuk mengambil analit yang dituju jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Rohman, 2009).

2. Fase SPE

  Suatu penjerap SPE harus dipilih sedemikian rupa sehingga mampu menahan analit secara kuat selama pemasukan sampel ke dalam cartridge. Untuk sampel

• – sampel yang bersifat ionik atau yang dapat terionisasi, digunakan penjerap penukar ion. Fraksi analit yang keluar dari SPE dapat langsung diinjeksikan ke sistem kromatografi atau dilakukan pengaturan pH untuk meminimalkan ionisasi sehingga dapat dipisahkan dengan kolom fase terbalik pada KCKT (Rohman, 2009).

  

Tabel I. Indeks polaritas larutan kimia (Snyder, 1978)

  Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak di dalam fase diam, yaitu lapisan berpori karena ada gaya kapiler (Stahl, 1985).

G. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi 1. Definisi dan instrumentasi KCKT

  Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah teknik pemisahan campuran senyawa berdasarkan interaksi dengan fase diam di bawah aliran fase gerak, dimana fase gerak dialirkan dengan bantuan tekanan menuju kolom secara cepat dan dideteksi dengan detektor yang sesuai (Hendayana, 2006). Ada dua fase dalam kromatografi, yaitu fase normal dan fase terbalik. Fase normal apabila fase diam lebih polar dari fase gerak, sedangkan fase terbalik, yaitu apabila fase diam lebih non polar dari fase geraknya (Munson, 1991).

  Kromatografi merupakan teknik yang mana solut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut

• – solut ini melewati suatu kolom kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2009).

  a. Fase diam

  Oktadesil silika (ODS atau C ) merupakan fase diam yan paling banyak

  18

  digunakan karena mampu memisahkan senyawa

• – senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar (Gandjar dan Rohman, 2009).

  b. Fase gerak Kemampuan KCKT dalam memisahkan banyak senyawa terutama tergantung pada jenis fase gerak. Fase gerak dapat mempengaruhi pemisahan komponen dalam campuran (Munson, 1991).

  Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril (Gandjar dan Rohman, 2009).

  c. Detektor Detektor UV-Vis didasarkan pada adanya penyerapan ultraviolet (UV) dan sinar tampak (Vis) pada kisaran panjang gelombang 190

• – 800 nm oleh spesies oleh spesies solut yang mempunyai struktur
• – struktur atau gugus – gugus kromoforik (Gandjar dan Rohman, 2009).

  Detektor spektrofotometri UV dapat berupa detektor dengan panjang gelombang tetap (merupakan detektor yang paling sederhana) serta detektor

2. Kromatografi partisi fase terbalik

  Konsep dasar kromatografi partisi, yaitu perlakuan sampel dalam kondisi cair-cair tergantung pada kelarutannya di dalam kedua cairan yang terlibat (Gritter

  

et al ., 1991). Partisi analit di antara dua fase yang tidak saling campur, karena

  adanya perbedaan koefisien distribusi dari masing-masing senyawa (Munson, 1991).

H. Landasan Teori

  Kuersetin merupakan turunan flavonoid golongan flavonol. Kuersetin adalah aglikon yang terlepas dari gugus glikosidanya sehingga kepolarannya menurun namun larut dalam pelarut metanol.

  Salah satu kandungan ekstrak teh hijau adalah flavonoid. Kandungan flavonoid dalam ekstrak teh hijau tidak hanya kuersetin, namun masih ada turunan flavonoid golongan lain ataupun polifenol lain yang larut dalam pelarut ekstrak yang sama. Oleh karena itu, diperlukan Solid Phase Extraction (SPE) dengan harapan didapatkan ekstrak teh hijau yang bersih dari turunan flavonoid lain ataupun polifenol lain.

  Solid Phase Extraction merupakan teknik pemisahan analit dari

  koekstraktan. Proses pemisahannya, yaitu kuersetin diikatkan pada fase diam C18 dan pengotornya dipisahkan dengan dialiri larutan pengelusi yang lebih polar dari fase diam. Lalu hasilnya dibandingkan dengan langkah yang berbeda yaitu koekstrakstan diikatkan pada fase diam diol dan kuersetin dipisahkan dengan dengan SPE dilakukan untuk memperoleh ekstrak yang bersih dari senyawa lainnya (selain kuersetin) dan didaptkan kandungan kuersetin terbanyak. Hasil ekstraksi diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik yang sudah teroptimasi dan dilihat kromatogramnya. Parameter pemisahan dengan SPE yang menunjukkan hasil optimum yaitu berkurangnya puncak

• – puncak senyawa selain kuersetin,

  Area Under Curve (AUC) kuersetin

  yang terbesar, dan resolusi tercapai ≥ 1,5 pada kromatogram.

I. Hipotesis

  Dengan menggunakan jenis fase diam C18 dan fase gerak HCl 0,002 N dan metanol serta menggunakan jenis fase diam diol dan silika dan fase gerak n- heksana, etil asetat, dan metanol akan menghasilkan kromatogram yang baik, yakni efisiensi clean up yang baik dengan berkurangnya puncak

• – puncak senyawa selain kuersetin, Area Under Curve (AUC) yang terbesar, dan nilai resolusi tercapai ≥ 1,5.

BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Jenis dan rancangan penelitian ini adalah eksperimental karena terdapat perlakuan terhadap subjek uji. B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah : a. Fase diam C18 dengan fase gerak HCl 0,002 N dan metanol.

  b. Fase diam diol dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol.

  c. Fase diam silika dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol.

  d. Volume eluen yang digunakan 2.

   Variabel tergantung

  Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah nilai efisiensi clean up, nilai resolusi, dan AUC kuersetin.

3. Variabel pengacau terkendali

  Kemurnian pelarut yang digunakan, dapat diatasi dengan menggunakan pelarut pro analysis yang memiliki kemurnian tinggi.

C. Definisi Operasional

  1. Kuersetin yang dianalisis merupakan senyawa aktif yang berada dalam sampel ekstrak teh hijau.

  2. Sistem SPE yang digunakan adalah seperangkat alat SPE menggunakan fase diam C18 dengan fase gerak aquabidest HCl 0,002 N, dan metanol; fase diam diol dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol; serta fase diam silika dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol.

  3. Optimasi jenis fase diam dan fesa gerak dilakukan dengan menggunakan fase diam yang berbeda dan fase gerak yang berbeda pada tiap fase diam, optimasi volume fase gerak dilakukan dengan mengubah volume fase gerak, dan optimasi kapasitas kolom dilakukan dengan mengubah volume sampel yang masuk pada kolom SPE.

  4. Parameter pemisahan komponen dengan metode SPE dilanjutkan dengan KCKT fase terbalik adalah kromatogram dengan jumlah impurities yang sedikit dan AUC kuersetin terbesar.

D. Bahan Penelitian

  Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah baku kuersetin (Pcode:100910390), metanol p.a. (E, Merck), aquabidest, etil asetat p.a. (E,

  , n-heksana p.a. (E, Merck), akuades yang disaring yang diperoleh dari

  Merck)

  Laboratorium Farmasi USD, metanol teknis (PT.Brataco), BHT (PT.Brataco), asam klorida yang telah dibakukan dengan natrium karbonat dan diperoleh konsentrasinya adalah 11,32 M, teh hijau dengan merk ”Sigma” yang diperoleh dari PT. Pagilaran Samigaluh, Kulon Progo.

E. Alat Penelitian

  Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat soxhlet 100 ml dan refluks, waterbath (merk “Marius” dan “Hedolph), termometer, kantong sokhlet, rotary evaporator, neraca analitik (OHAUS Carat Series PAJ

  1003, max 60/120 g, min 0,001 g, d = 0,01/0,1 mg, e = 1 mg), densitometer (CAMAG TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No. 160602), autosampler (Linomat 5 No. 170610), perangkat lunak WinCats (V.1.4.4), bejana kromatografi, seperangkat alat KCKT fase terbalik dengan sistem gradien dan isokratik dengan detektor ultraviolet, Shimadzu LC-2010C, kolom C-18 merek KNAUER C-18 (No. 25EE181KS (B115Y620), Dimensi 250 x 4,6 mm), seperangkat komputer (merk Dell B6RDZ1S Connexant Sistem RD01-D850 A03- 0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625730), alat ultrasonikasi (Retsch tipe T640 No.935922013), kertas saring Whatman

  0,45 μm, alat vacuum, hair dryer “Q2 External Beauty”, milipore, seperangkat cartridge

  

Solid Phase Extraction (SPE) dengan fase diam C18, diol, silika merek E-Merck,

dan alat-alat gelas yang biasa digunakan dalam laboratorium.

F. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan serbuk daun teh

  Sejumlah tujuh bungkus kemasan teh hijau yang diambil dari PT Pagilaran dengan nomor batch yang sama dicampur menjadi satu kemudian dihomogenkan, lalu diserbuk dan disaring. Hasil serbuk kemudian disimpan dalam wadah yang kering, kemudian diberi silika gel.

  2. Ekstraksi dengan menggunakan metode Soxhlet sekaligus hidrolisis

  Serbuk daun teh ditimbang 8 gram kemudian dimasukkan ke dalam tea

  

bag . Tea bag dimasukkan ke dalam tabung soxhlet kemudian disoxhlet dengan

  240 ml larutan metanol : aquabidest (90:10) yang mengandung HCl 1,85 M dan

  O Butyl Hidroxy Toluene (BHT) 0,1% b/v pada suhu 90

  C. Proses soxhletasi dihentikan setelah mencapai 18 kali sirkulasi larutan penyari. Hasil soxhlet atau ekstrak didiamkan selama beberapa saat pada suhu kamar hingga suhunya kurang lebih sama dengan suhu kamar. Ekstrak dipindahkan ke dalam labu takar 250 ml lalu diencerkan dengan ditambahkan larutan metanol : aquabides (90:10) hingga tanda. Sejumlah 25 ml ekstrak diuapkan dengan rotary evaporator hingga 5 ml.

  3. Skrining metode clean up

  Dilakukan skrining metode clean up dengan SPE cartridge diol, silika, dan C18 dengan fase gerak metanol, etil asetat, toluen, n-heksana, kloroform, etanol, aseton. Kemudian fraksi

• – fraksi tersebut ditotolkan pada KLT- densitometri yang telah dioptimasi oleh Dharma (2012).

Dilakukan metode clean up dengan cara partisi, yaitu ekstraksi cair

• – cair antara larutan metanol:air (90:10) dengan n-heksana, air dengan etil asetat. Fraksi – fraksi tersebut ditotolkan pada KLT-densitometri yang telah dioptimasi.

4. Optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE

  a. Pembuatan HCl 0,002 N. Sejumlah 2,21 ml HCl 32% dimikropipet dan dipindahkan pada labu takar 25 ml, diencerkan dengan aquabidest hingga batas tanda menjadi HCl 1 N. Sejumlah 200 µl larutan HCl 1 N dimikropipet dan dipindahkan ke labu takar 100 ml, diencerkan dengan aquabidest hingga batas tanda menjadi HCl 0,002 N.

  b. Fase diam diol 1) Pengkondisian (conditioning). Sejumlah 2 ml metanol p.a. dialirkan pada kolom SPE diol kemudian tetesan ditampung pada tabung reaksi. Selanjutnya dialirkan berturut – turut 2 ml etil asetat p.a. dan 2 ml n-heksana p.a. ke dalam kolom SPE diol.

  2) Pengisian (loading) sampel. Sejumlah 0,3 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom SPE diol.

  3) Pengelusian (eluting). Sejumlah 4 ml n-heksana p.a.

• – dialirkan melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Berturut turut 4 ml etil asetat p.a. dan metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.

  4) Preparasi sampel. Fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol diuapkan dengan rotary evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a. Sejumlah dalam labu takar 5 ml dan diencerkan hingga batas tanda. Fraksi

• – fraksi tersebut di-milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.