AKTIVITAS EKSTRAK METHANOLIK DAUN SIRSAK (ANNONA MURICATA (LINN) SEBAGAI ANTI HIPERGLIKEMIA.

LAPORAN KEMAJUAN PENELITIAN

AKTIVITAS EKSTRAK METHANOLIK DAUN SIRSAK

(ANNONA MURICATA (LINN) SEBAGAI ANTI

HIPERGLIKEMIA

TIM PENGUSUL

Anak Agung Ngurah Subawa

Anak Agung Wiradewi Lestari

Ida Bagus Komang Ardana

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS UDAYANA

MARET 2015

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Salah satu penyakit yang prevalensinya meningkat dari tahun ke tahun dan menjadi ancaman masyarakat dunia adalah diabetes mellitus (DM) type 2. Penyakit ini termasuk kelompok gangguan yang berhubungan dengan karakteristik hiperglikemia, yaitu kadar glukosa puasa ≥126 mg/dl dan kadar glukosa darah sewaktu ≥ 200 mg/dl (WHO, 2005). Salah satu penyebab hiperglikemia adalah insufisiensi atau kegagalan fungsi sel β pancreas yang disebabkan oleh banyaknya radikal bebas dalam tubuh. Pengobatan penderita DM Type 2 dengan jenis-jenis obat diabetes modern cukup mahal dan sering menimbulkan efek samping. Oleh karena itu perlu diteliti obat – obat antidiabetes yang harganya murah, lebih potensial, mudah didapat dan tanpa efek samping. Dewasa ini tumbuhan herbal telah banyak diteliti khasiatnya, termasuk daun sirsak (Adeyemi et al., 2009).

Daun sirsak mudah didapat di lingkungan sekitar kita. Sebagai obat tradisional, daun sirsak lebih difokuskan sebagai obat kanker, (Adewole dan Ojewole, 2009), karena mengandung senyawa cytotoxic (yaitu acetogenin), saponin, polipenol, dan bioflavonoid yang berkhasiat sebagai antioksidan. Senyawa-senyawa tersebut mampu menghambat hingga membunuh sel-sel tubuh yang mengalami pertumbuhan tidak normal (sel kanker) (Adi Wicaksono, 2011). Kandungan antioksidan dalam daun sirsak tentu dapat menangkal radikal bebas dan mengatasi penyakit degeneratif seperti DM. .Penelitian daun sirsak sebagai obat DM masih sangat sedikit, khususnya dalam khasiatnya sebagai antihiperglikemik (Adi Wicaksono, 2011). Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian, untuk mengetahui aktivitas ekstrak daun sirsak sebagai anti hiperglikemia.

1.2 Rumusan Masalah

Dari penjelasan tersebut di atas, dapat disusun rumusan masalah sebagai berikut : “apakah pemberian ekstrak methanol daun sirsakdapat menurunkan kadar glukosa darah pada tikus?”

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui khasiat daun sirsak 1.3.2 Tujuan Khusus

Penelitian ini memiliki tujuan khusus yaitu untuk mengetahui apakah pemberian ekstrak methanol daun sirsak dapat menurunkan kadar glukosa darah pada tikus.

1.4 Manfaat Penelitian

Dengan mengetahui manfaat daun sirsak dalam menurunkan kadar glukosa darah pada tikus, maka diharapkan penggunaan tumbuhan herbal khususnya daun sirsak dalam upaya penanggulangan DM akan semakin meningkat. Sebelum sampai pada tahap tersebut, tentunya harus dilakukan penelitian lebih lanjut tentang manfaat daun sirsak dalam menurunkan kadar glukosa darah pada manusia.

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Diabetes Mellitus

Diabetes mellitus (DM) adalah penyakit metabolik yang ditandai dengan terjadinya hiperglikemi yang disebabkan oleh gangguan sekresi insulin dan atau kerja insulin,sehingga terjadi abormalitas metabolisme karbohidrat, lemak dan protein. Komplikasi DM meliputi aspek metabolik dan vaskuler yaitu hiperglikemia puasa atau sewaktu, aterosklerotik dan penyakit vaskuler mikroangiopati,( Harris 2004;Heuvel el.al.2012) DM berhubungan dengan peningkatan resiko terjadinya thrombosis, atherosclerosis dan penyakit cardiovascular (Adeyemi, et.al.2009).

Definisi DM menurut WHO (2005) adalah kadar glukosa darah puasa≥ 126 mg/dl, kadar glukosa darah 2 jam post prandial > 200 mg/dl dan kadar glukosa darah sewaktu ≥ 200 mg/dl, kadar glukosa darah antara 100–125 mg/dl (6,1-7,0 mmol/L) pre diabetes.

Klasifikasi DM antara lain DM tipe 1 dan DM tipe 2. DM tipe 2 dapat diterapi dengan menghambat kerja enzim α –glucosidase sebagai enzim kunci dalam metabolisme karbohidrat

yang berada dipermukaan membrane sel usus. Obat yang berkhasiat sebagai Inhibitor α –

glucosidase akan menghalangi aktivitas enzim tersebut sehingga jenis jenis karbohidrat seperti

oligosakarida dan disakarida yang dipecah menjadi monosakarida seperti glukosa akan dibatasi (Malathi et al.,2010).

2.2 Kadar Glukosa darah

Glukosa dalam darah akan dapat masuk ke dalam sel hati atau otot dengan bantuan insulin, yang diawali dengan ikatan insulin dengan reseptor yang terdapat dalam permukaan membran sel, kemudian menghasilkan signal intraseluler. Signal ini mengakibatkan translokasi transpoter glukosa (GLUT 4) yang berada pada pool membrane mikrosomal intraseluler bergerak menuju membrane plasma sel otot membentuk saluran tempat glukosa masuk ke dalam sel. Selanjutnya glukosa dikatabolisme menghasilkan energi untuk proses lebih lanjut.

Pada anjing penderita DM, glukosa tidak dapat dikatabolisme karena glukosa tidak dapat masuk ke dalam sel, akibat kekurangan atau tidak ada insulin dalam darah sehingga glukosa tidak dapat diubah menjadi glikogen atau lipid, dan kadar glukosa dalam darah .menjadi tinggi

atau hiperglikemik (Bush,1993). Kondisi hiperglikemik pada anjing ditunjukkan dengan kadar glukosa dalam darah 150 mg/dl satu jam setelah makan dan kadar ini menurun secara lambat. Pada hewan lain seperti tikus, kondisi hiperglikemik ditunjukkan oleh glukosa darah puasa > 127 mg/dl. Sedangkan pada babi kadar glukosa puasa berkisar 15–20 mmol/l. Rendahnya insulin dalam darah dapat disebabkan oleh disfungsi sel β pulau langerhan pancreas. Kondisi ini bisa dibuat dengan pemberian diabetogenik seperti streptozotocin (Adeyemi et.al.,2009) atau aloksan.

2.3 Streptozotosin

Streptozotosin (STZ) disebut juga N asetil glukosamin (GlcNAc) yang didapat dari Streptozotosin achromogenes digunakan untuk membuat hewan model diabetes, baik DM tipe 1 maupun DM tipe 2 (Adeyemi et.al. 2009, Heuvel et al, 2012; Lee et.al,2012; Larsen, 2009). Dosis STZ yang dibutuhkan untuk menginduksi DM tipe 2 pada tikus 80 mg/Kg berat badan secara intraperitonial, dalam 2- 4hari sudah terjadi hiperglisemia (Adeyemi et.al.,2009), Sedangkan dosis STZ yang dibutuhkan untuk babi untuk mengiduksi DM tipe 2 pada babi 130 mg/kg berat badan secara IV (Koopmans et.al. 2006) dengan kisaran 110 - 150 mg/kg (Heuvel etal.,2012).

STZ dalam pembuluh darah akan masuk ke dalam sel β pulau Langerhan pancreas melalui transporter glukosa GLUT 2 yang selanjutnya akan mengalami metabolisme menghasilkan Nitrit Oxide (NO) yang dapat menganggu atau merusak sel β pulau Langerhan pancreas melalui mekanisme peningkatan guanil siklase dan pembentukan cGMP dan aktifnya oksigen raktif.Injeksi STZ pada tikus menyebabkan degenerasi sel β pulau Langerhans pancreas yang pada gilirannya mengakibatkan penurunan sekresi insulin.Pada tikus yang diinjeksi STZ dosis 80 mg/kg berat badan dalam waktu 2- 4 hari telah menunjukan hiperglisemia (Adeyemi

et.al. 2009).

2.4 Daun Sirsak

Sirsak (Anona muricata Linn) berasal dari Amerika selatan dengan Taksonomi sebagai berikut : Kingdom : Plantae; Divisio : Spermatophyta; Sub Divisio : Angiospermae; Class : Dicotylledonae; Ordo : Polycarpiceaae; Famili : Annonaceae; Genus : Annona; Species : Annona muricata Linn. Daun sirsak mengandung senyawa citotoxic seperti acetogenin, polifenol, dan bioflavonoid.

Polifenol merupakan senyawa turunan penol yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan. Antioksidan fenolik digunakan untuk mencegah kerusakan jaringan akibat reaksi oksidasi pada makanan, kosmetik, farmasi dan plastik. Fungsi folifenol adalah mengangkap dan mengikat radikal bebas yang berasal dari kerusakkan ion-ion logam, sehingga tidak merusak sel tubuh (Hermani dan Mono Rahardjo, 2005). Bioflavonoid merupakan kelompok senyawa polifenol dengan aktivitas antioksidan yang tinggi, potensial untuk mencegah pembentukan radikal bebas. Pengobatan dengan daun sirsak dapat meningkatkan regenerasi sel β palau langerhan pancreas tikus DM, yang pada gilirannya akan meningkatkan sekresi hormone insulin (Adeyemi et.al.,2009).

3. MATERI DAN METODE

3.1 Tumbuhan yang diuji

Daun sirsak telah dikumpulkan dari Desa Dalung, Kecamatan Kuta Utara, Pemkab Badung, Bali pada Bulan Juli 2015. Pembuatan ekstrak daun sirsak dilakukan sesuai metode Christy and Norris -42362, England dari Departement Pharmacognosy Obafemi Awolowo University, Ile Ife, yang dikembangkan oleh Adeyemi et,al (2009). Daun sirsak dikeringkan pada suhu ruangan selama 4 minggu. Setelah kering, daun sirsak diblender sampai terbentuk tepung. Sebanyak 600 gram tepung daun sirsak direndam dalam 5 liter Methanol 70% selama 72 jam pada suhu kamar. Campuran tersebut kemudian disaring dan filtratnya dievaporasi pada suhu 60 % menggunakan vacuum rotary evaporator. Sisa sisa yang masih basah disimpan dalam freezer dan siap digunakan.

3.2 Hewan Model

Hewan model dalam penelitian DM type 2 adalah tikus. Tiga puluh ekor tikus berat badan berkisar antara 200- 250 gram digunakan sebagai hewan model dalam penelitian ini. Tikus dipelihara di kandang penelitian FK Unud. Tikus diberi makan sesuai strandar yaitu pakan ayam petelur dan diberi minum secara Add libitum. Ternak model tersebut dibagi menjadi 3 kelompok yaitu A, B dan C masing-masing 10 ekor. Kelompok A tikus kontrol yang tidak mengalami diabetes, kelompok B adalah tikus yang diinduksi menjadi diabetes tanpa diobati ekstrak methanol daun sirsak dan kelompok C adalah tikus yang dinduksi menjadi diabetes dan diobati ekstrak methanol daun sirsak.

3.3 Alur Penelitian

Tikus yang termasuk dalam kelompok B dan Kelompok C dibuat menderita DM type 2 dengan menyuntikkan streptozotosin (Sigma St, Louis, USA) yang dilarutkan dalam sodium citrate 0,1 M buffer Ph 6,3 dengan dosis tunggal pada tikus sebesar 80 mg/kg berat badan secara intraperitonial ( Adeyemi,2009 ). Kelompok A diinjeksi dengan sodium citrate buffer sebanyak volume sodium citrate buffer yang diberikan pada kelompok B dan kelompok C. Kadar glukosa darah diukur setiap minggu selama 4 minggu. Setelah 4 minggu, tikus kelompok C

diinjeksi ekstrak methanol daun sirsak yang dilarutkan dalam aquadest steril 100 mg/kg berat badan intraperitonial setiap hari selama 2 minggu. Kemudian kadar glukosa darah diukur setiap minggu selama 4 minggu.

3.4 Pengukuran Berat Badan dan Kadar Glukosa Darah

Berat badan tikus ditimbang menggunakan timbangan khusus tikus. Untuk pemeriksaan kadar glukosa darah puasa, tikus dipuasakan selama 16 jam. Pengambilan darah tikus dilakukan pada vena orbitalis mata dan kadar glukosa darah puasa diukur dalam mg/dl menggunakan alat glukometer Roche.

3.5 Analisis Statistik

Data dianalisis secara deskriptif dan statistik inferensial. Semua nilai ditunjukkan dengan nilai rata rata ± standar deviasi untuk 10 ekor tikus dari ketiga kelompok tersebut. Untuk mengetahui pengaruh perlakuan, digunakan uji Anova, dan bila terdapat perbedaan yang nyata maka dilanjutkan dengan uji Duncan untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan (Stell and Torrhie, 1988).

3.6 Biaya Penelitian

1. Honor

Honor Honor/jam

Waktu

(jam/minggu) Minggu Honor per tahun

Ketua 12.500 5 52 3.250.000

Anggota 1 11.500 3 52 1.794.000

Anggota 2 11.500 3 52 1.794.000

2. Peralatan / Bahan Habis Pakai Material Justifikasi Pemakaian Kuantitas Harga Satuan Biaya

Kandang perawatan 90 10.000 90.000

Tabung tanpa antikoagulan

Pengambilan

sampel 160 pcs 4.500 720.000

Kapas alkohol

Pengambilan

sampel 160 pcs 500 80.000

Plester

Pengambilan

sampel 160 pcs 500 80.000

Torniquet

Pengambilan

sampel 2 pcs 25.000 50.000

sonde

pemberian

ekstrak 140 1.250 175.000

kit glukosa

pemeriksaan

glukosa 250 tes 14.500 3.625.000

handschoon

Pengambilan

sampel 500 pcs 500 250.000

Streptozotosin Zat induksi DM 1 4.255.000 4.255.000

ekstrak daun sirsak

Pembuatan

ekstrak 1 5.300.000 5.300.000

Pakan tikus

standar makanan tikus 1 6.650.000 7.650.000

Spuit

pengambilan

sampel 160 pcs 2.500 400.000

obat anestesi eutanasia 1 1.000.000 1.000.000

3. Lain-lain (Pemeliharaan, Lokakarya, Penggandaan, Pelaporan, Publikasi)

Kegiatan Justifikasi Kuantitas

Harga

Satuan Biaya

Kertas

Pembuatan

laporan 3 rim 30.000 90.000

Cartridge tinta hitam HP Laserjet P1006 (refill)

Pembuatan laporan

1 618.000 618.000

Fotocopy

Pembuatan

laporan 500 200 100.000

Jilid

Pembuatan

laporan 10 5000 50.000

Pengolahan data

Pembuatan

laporan 1 1.000.000 1.000.000

Lokakarya Diseminasi hasil 1 2.629.000 2.629.000

Sub Total 4.487.000

3.7 Jadwal Penelitian

Kegiatan Triwulan I Triwulan II Triwulan III Triwulan IV Pengajuan proposal

penelitian Pengumuman pemenang Pelaksanaan penelitian Laporan

4. Laporan Kemajuan

Penelitian ini dimulai Bulan Desember 2015. Adapun kegiatan yang telah dilakukan adalah :

No Tanggal Kegiatan

1 29/12/2015 Membeli 30 ekor tikus

Memberi makan minum add libitum sampai mencapai berat 200-250 gram Perawatan kandang

2 5/1/2016 Memonitor pemberian makanan dan perawatan kandang Mengumpulkan daun sirsak

3 12/1/2016 Memonitor pemberian makanan dan perawatan kandang Mengumpulkan daun sirsak

4 26/1/2016 Memonitor pemberian makanan dan perawatan kandang Menjemur daun sirsak/persiapan pembuatan ekstrak

5 12/2/2016 Pembelian BHP : sonde, alat-alat sampling, streptozotosin, reagen pemeriksaan glukosa

5. Daftar Pustaka

Adi Wicaksono. 2011. Kalahkan Kanker dengan Sirsak. Edisi 1. Citra Media Mandiri. Adeyemi D.O.,Omobola Aderibigbe Komolafe, Olarinde Stephen Adewole, Efere

Martins Obuotor and Thomas Kenhinde Adenowo.2009.Anti Hypergycemic Activities of Annona Muricata (Linn).Afr. J Trandit Complement Altern Med.:6 (1):62-69.

Adewole Stephen O, and John A.O. Ojewole.2009. Protective Effects of Annona Muricata Linn.(Annonaceae) Leaf Aqueous Extract on Serum Lipid Profiles and Oxidative Stress in Hepatocytes of Streptozotocin-Treated Diabetic Rats. Afr. J Trandit Complement Altern Med.:6 (1): 30-41.

Bush B.M.1993. Interpretation of Laboratory Results for Small Animal Clinicians.Blakckwell Scientific Publications.London.

Heuvel M.van den, Oana Sorop , Sietse-Jan Koopmans , Ruud Dekker , René de Vries , Heleen M. M. van Beusekom , Etto C. Eringa , Dirk J. Duncker , A. H. Jan Danser , Willem J. van der Giessen 2012.Coronary microvascular dysfunction in a porcine model of early atherosclerosis and diabetes. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory PhysiologyPublished 1 Vol. 302 no. 85-94: 10.1152

Harris MI.2004. Definition and classification of diabetes mellitus and the criteria for diagnosis. In: Diabetes Mellitus: A Fundamental and Clinical Text. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. p 457–467

Hermani dan Mono Rahardjo.2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidan.Cetakan 1. Penebar Swadaya, Jakarta.

Lee M.S, Ki-Duk Song, Woon-Kyu Lee.2012 Development of a type II diabetic mellitus animal model using Micropig® .Lab Anim Res.Vol. 28(3): 205–208. Larsen MO. 2009. Beta-cell function and mass in type 2 diabetes. Dan Med Bull.

56(3):153-64.

Koopmans , Mroz Z, Dekker R, Corbijn H, Ackermans M, Sauerwein H. 2006. Association of insulin resistance with hyperglycemia in streptozotocin-diabetic pigs: effects of metformin at isoenergetic feeding in a type 2-like diabetic pig model. Metabolism.;55(7):960-71.

Malathi,V., Devi,S.S., Revathi, K. 2010. Anti diabetic activity by the in vitro alfa amylase and alfa-glucosydase inhibitory activity of Catharanthus roeus. J Life Sci The Biocan 5(4): 655-659.

World Health Organization , author.1994. Prevention of diabetes mellitus. Technical Report Series. 844 : 11-15

World Health Organization.2005. Prevention of Blindness from Diabetes Mellitus : a report of a WHO consultation. Switzerland.

2. Peralatan / Bahan Habis Pakai Material Justifikasi Pemakaian Kuantitas Harga Satuan Biaya

Kandang perawatan 90 10.000 90.000

Tabung tanpa antikoagulan

Pengambilan

sampel 160 pcs 4.500 720.000

Kapas alkohol

Pengambilan

sampel 160 pcs 500 80.000

Plester

Pengambilan

sampel 160 pcs 500 80.000

Torniquet

Pengambilan

sampel 2 pcs 25.000 50.000

sonde

pemberian

ekstrak 140 1.250 175.000

kit glukosa

pemeriksaan

glukosa 250 tes 14.500 3.625.000

handschoon

Pengambilan

sampel 500 pcs 500 250.000

Streptozotosin Zat induksi DM 1 4.255.000 4.255.000 ekstrak daun

sirsak

Pembuatan

ekstrak 1 5.300.000 5.300.000

Pakan tikus

standar makanan tikus 1 6.650.000 7.650.000

Spuit

pengambilan

sampel 160 pcs 2.500 400.000

obat anestesi eutanasia 1 1.000.000 1.000.000

3. Lain-lain (Pemeliharaan, Lokakarya, Penggandaan, Pelaporan, Publikasi)

Kegiatan Justifikasi Kuantitas

Harga

Satuan Biaya

Kertas

Pembuatan

laporan 3 rim 30.000 90.000

Cartridge tinta hitam HP Laserjet P1006 (refill)

Pembuatan laporan

1 618.000 618.000

Fotocopy

Pembuatan

laporan 500 200 100.000

Jilid

Pembuatan

laporan 10 5000 50.000

Pengolahan data

Pembuatan

laporan 1 1.000.000 1.000.000

Lokakarya Diseminasi hasil 1 2.629.000 2.629.000 Sub Total 4.487.000

3.7 Jadwal Penelitian

Kegiatan Triwulan I Triwulan II Triwulan III Triwulan IV Pengajuan proposal

penelitian Pengumuman pemenang Pelaksanaan penelitian Laporan

4. Laporan Kemajuan

Penelitian ini dimulai Bulan Desember 2015. Adapun kegiatan yang telah dilakukan adalah :

No Tanggal Kegiatan

1 29/12/2015 Membeli 30 ekor tikus

Memberi makan minum add libitum sampai mencapai berat 200-250 gram Perawatan kandang

2 5/1/2016 Memonitor pemberian makanan dan perawatan kandang Mengumpulkan daun sirsak

3 12/1/2016 Memonitor pemberian makanan dan perawatan kandang Mengumpulkan daun sirsak

4 26/1/2016 Memonitor pemberian makanan dan perawatan kandang Menjemur daun sirsak/persiapan pembuatan ekstrak

5 12/2/2016 Pembelian BHP : sonde, alat-alat sampling, streptozotosin, reagen pemeriksaan glukosa

5. Daftar Pustaka

Adi Wicaksono. 2011. Kalahkan Kanker dengan Sirsak. Edisi 1. Citra Media Mandiri. Adeyemi D.O.,Omobola Aderibigbe Komolafe, Olarinde Stephen Adewole, Efere

Martins Obuotor and Thomas Kenhinde Adenowo.2009.Anti Hypergycemic Activities of Annona Muricata (Linn).Afr. J Trandit Complement Altern Med.:6 (1):62-69.

Adewole Stephen O, and John A.O. Ojewole.2009. Protective Effects of Annona Muricata Linn.(Annonaceae) Leaf Aqueous Extract on Serum Lipid Profiles and Oxidative Stress in Hepatocytes of Streptozotocin-Treated Diabetic Rats. Afr. J Trandit Complement Altern Med.:6 (1): 30-41.

Bush B.M.1993. Interpretation of Laboratory Results for Small Animal Clinicians.Blakckwell Scientific Publications.London.

Heuvel M.van den, Oana Sorop , Sietse-Jan Koopmans , Ruud Dekker , René de Vries , Heleen M. M. van Beusekom , Etto C. Eringa , Dirk J. Duncker , A. H. Jan Danser , Willem J. van der Giessen 2012.Coronary microvascular dysfunction in a porcine model of early atherosclerosis and diabetes. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory PhysiologyPublished 1 Vol. 302 no. 85-94: 10.1152

Harris MI.2004. Definition and classification of diabetes mellitus and the criteria for diagnosis. In: Diabetes Mellitus: A Fundamental and Clinical Text. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. p 457–467

Hermani dan Mono Rahardjo.2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidan.Cetakan 1. Penebar Swadaya, Jakarta.

Lee M.S, Ki-Duk Song, Woon-Kyu Lee.2012 Development of a type II diabetic mellitus animal model using Micropig® .Lab Anim Res.Vol. 28(3): 205–208. Larsen MO. 2009. Beta-cell function and mass in type 2 diabetes. Dan Med Bull.

56(3):153-64.

Koopmans , Mroz Z, Dekker R, Corbijn H, Ackermans M, Sauerwein H. 2006. Association of insulin resistance with hyperglycemia in streptozotocin-diabetic pigs: effects of metformin at isoenergetic feeding in a type 2-like diabetic pig model. Metabolism.;55(7):960-71.

Malathi,V., Devi,S.S., Revathi, K. 2010. Anti diabetic activity by the in vitro alfa amylase and alfa-glucosydase inhibitory activity of Catharanthus roeus. J Life Sci The Biocan 5(4): 655-659.

World Health Organization , author.1994. Prevention of diabetes mellitus. Technical Report Series. 844 : 11-15

World Health Organization.2005. Prevention of Blindness from Diabetes Mellitus : a report of a WHO consultation. Switzerland.