Master Tesis Espanol VARIACION GENETICA
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA SISTEMA DE ESTUDIOS DE POSGRADO VARIACIÓN GENÉTICA ASOCIADA CON INTOLERANCIA A LA LACTOSA EN GRUPOS INDÍGENAS DE BAJA CENTROAMÉRICA Y SU POTENCIAL COMO PROBLEMA DE SALUD
Tesis sometida a la consideración de la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Antropología para optar al grado y título de Maestría Académica en Antropología
ANA YANCY MORALES ARCE
Ciudad Universitaria Rodrigo Facio, Costa Rica 2010
DEDICATORIA
A mis seres queridos.
AGRADECIMIENTOS
A los pueblos indígenas de Costa Rica y Panamá. Al Dr. Jorge Azofeifa por su invaluable guía y sus constantes consejos. Al Dr. Ramiro Barrantes y a la Dra. Silvia Salgado por su interés en el tema y su colaboración.
A la Universidad de Costa Rica, por el apoyo logístico, financiero e institucional por medio del proyecto “Variación genética y evolución de la región del gen de la lactasa LCT en la población de Costa Rica” No 111-A8-069 y el programa “Ecología, diversidad genética y salud de los amerindios de CR” No 742-93-903.
A aquellas personas que estuvieron en algún momento durante el proceso de laboratorio y mostraron interés y colaboración con el trabajo.
A mis amigos y familiares por su paciencia.
A la empresa Dos Pinos R.L. por apoyar financieramente parte de la investigación.
HOJA DE APROBACIÓN
“Esta tesis fue aceptada por la Comisión del Programa de Estudios de Posgrado en Antropología
de la Universidad de Costa Rica, como requisito parcial para optar al grado y título Maestría
Académica en Antropología”
____________________________________ Eric Fuchs Castillo, Ph.D Representante de la Decana Sistema de Estudios de Posgrado
______________________________________ Jorge Azofeifa Navas, Dr.sc.hum. Director de Tesis
______________________________________ Ramiro Barrantes Mesén, D.Sc. Asesor
_______________________________________ Silvia Salgado González, Ph.D. Asesora
_______________________________________ Dra. María del Carmen Araya Jiménez Directora Programa de Posgrado en Antropología
_______________________________________ Ana Yancy Morales Arce Candidata
RESUMEN
La documentación más antigua sobre el consumo de leche por adultos data desde hace unos 7000 años en la región de Libia. La práctica del consumo fue posible entre las poblaciones que domesticaron rumiantes entre ellas las de medio oriente, algunas africanas y europeas; que siglos más tarde se incorporó en otras regiones del mundo. Los cambios industriales globales relacionados con la comercialización de la leche y sus derivados se intensificaron desde 1960 dando pie a un incremento en su producción y consumo global. La disponibilidad y diversidad de productos lácteos, y en particular de leche fresca han puesto en evidencia que existen diferencias entre poblaciones e individuos para digerir dichos alimentos, debido principalmente a uno de los componentes de la leche: la lactosa, y se ha estimado que afecta a la mayoría de la población mundial. La ingestión de leche o productos lácteos no deslactosados, puede provocar intolerancia a lactosa que produce síntomas como distensión abdominal, cólicos, flatulencia, diarrea, nauseas y vómito. A nivel de ADN se han reportado marcadores genéticos (SNPs) corriente arriba del gen de la lactasa que se asocian con los fenotipos toleranciaintolerancia a lactosa en determinadas poblaciones, entre ellas, europeas (T -13910 y A -22018) y africanas (C -14010). El objetivo de este trabajo fue estimar la variación genética asociada con intolerancia a la lactosa en grupos amerindios
de Baja Centroamérica. Se utilizaron 214 muestras de ADN de las poblaciones amerindias repartidas entre los grupos Maleku, Ngöbe, Huetar, Bribri, Cabécar, Chorotega y Rama. Se amplificaron las regiones que contienen los SNPs y se obtuvieron los genotipos por medio de electroforesis capilar y enzimas de restricción. Se obtuvo una variación entre 0.01 y 0.99 en los diferentes SNPs a excepción de los SNPs 4 (C -14010) y 7 (A -22018) que mostraron fijación. Las mayores frecuencias de alelos europeos se encontraron en la población huetar mientras que la mayor frecuencia del alelo africano se encontró en las poblaciones de Rama Cay (rama) y Limoncito (ngöbe). Se estimaron 55, de los cuales el 2 y el 4 alcanzaron las mayores frecuencias. Los haplotipos asociados con tolerancia en Europa alcanzaron solamente un 3 en la población maleku y un 10 en la población huetar de Quitirrisí. El valor de F st (9.7) mostró un alto grado de diferenciación entre las poblaciones. La mayor diversidad haplotípica se presentó en las comunidades de Abrojo y Rama Cay, seguido de la comunidad huetar de Zapatón. Los grupos con menor diversidad haplotípica fueron el grupo maleku y el grupo ngöbe (Abrojo). Los resultados obtenidos podrían estar reflejando el efecto de la mezcla interétnica en las poblaciones. En total sería de esperar al menos un 80 de la población indígena sufra de intolerancia a lactosa. Considerando los procesos de multiculturalidad las políticas públicas deberían tomar en cuenta los diversos aspectos nutricionales antes de aplicar medidas que respectan a la salud y la nutrición. Las comunidades podrían verse más beneficiadas si se distribuyera leche deslactosada entre ellas, con lo que se mejoraría una política estatal a nivel nutricional.
ABSTRACT
The oldest documentation of milking dates around 7000 years ago in Lybia´s region. The consumption of cow`s milk was possible only in pastoralist populations such as the European, African, and Middle Easterner. Centuries later such practice was introduced in other regions worldwide. Dairy industries changes were intensified since 1960`s, increasing its global production and consumption. Availability and diversity of dairy products, mainly cow`s drinking milk have revealed that there are differences in the capability of digesting dairy products between individuals and populations, primarily because of lactose. Studies have shown that non lactose-free dairy products ingestion affects the majority of the world`s population; some of the symptoms are abdominal distension, cramping, gas, diarrhea, nauseas and vomit. The polymorphic trait has been attributed to single nucleotide polymorphisms in Europeans (C-13910T and A -22018) and Africans (C -14010) in an enhancer element 19 kb upstream of the lactase gene (LCT). This work`s aim was to estimate genetic variation associated with lactose intolerance in Amerindians of Lower Central America. A total of 214 DNA samples from different Amerindian populations: Maleku, Ngöbe, Huetar, Bribri, Cabécar, Chorotega and Rama were used. Most of the markers showed a variation between 0.01 and 0.99, with the exception of the SNP 4 (C -14010) and 7 (A -22018). Highest frequencies of European markers were shown in the huetar population and the highest frequency of the African marker was obtained in Rama Cay (rama) and Limoncito (ngöbe). It was estimated a total of 55 haplotypes, haplotype 2 and 4 reached the highest frequencies. Lactose tolerance associated haplotypes reached 3 in maleku and 10 in the huetar population (Quitirrisí). Fst measure showed high differenciation between populations (9.97) The highest haplotype diversity was obtained in Abrojo (ngöbe) and Rama Cay (rama) communities fallowed by Zapatón (huetar). Groups with the lowest haplotype diversity are maleku and Ngöbe (Abrojo). These results might be reflecting the admixture effect among populations with non indigenous groups. It is expected that at least 80 of the indigenous population might experience some degree of lactose intolerance. As consequence, due to multiculturality, public politics should consider different nutritional aspects before applying measures related to health and nutrition. Finally, both national’s nutrition politics will improve and communities might
be beneficiated if lactose-free milk instead of lactose contained milk is distributed.
1. Introducción
La documentación más antigua sobre el consumo de leche por adultos data desde hace unos 7000 años en la región de Libia (Davidson, 1999); dicho consumo fue posible solamente entre las poblaciones que domesticaron rumiantes. Esta práctica permaneció en poblaciones de medio oriente, algunas africanas y europeas hasta que fue incorporada en diferentes regiones del mundo como Asia alrededor de 3 200 años atrás y en el nuevo mundo por los conquistadores quinientos años atrás (Simoons, 1971;Wiley, 2008). Siglos más tarde la lechería se industrializó y su consumo se oficializó en políticas de ayuda alimentaria primero en los Estados Unidos y posteriormente al resto de países americanos (USDA, 2002). Los cambios industriales globales relacionados con la comercialización de la leche y sus derivados se intensificaron desde 1960 dando pie a un incremento en su producción y consumo global (IDOE, 2010; Wiley, 2008). Desde entonces la disponibilidad y diversidad de productos lácteos, y en particular de leche fresca han puesto en evidencia que existen diferencias entre poblaciones e individuos para digerir dichos alimentos debido principalmente a uno de los componentes de la leche: la lactosa (Harrison, 1975). Esta complicación asociada con el consumo de leche y sus derivados es conocida como intolerancia a la lactosa, hipolactasia de los adultos, o restricción de la lactasa, (MIM 223100) y se ha estimado que afecta a la mayoría de la población mundial (Johnson et al. 1981; Bloom Sherman, 2005).
1.1 Características de la lactosa y su relación con la lactasa
La lactosa (4-0-ß-D-galactopyranosyl-D-glucopyranose 4- β-galactosilglucosa), es un disacárido producto de un enlace β-1,4-glicosídico entre la glucosa y la galactosa que se sintetiza en el aparato de Golgi de las glándulas mamarias a partir de glucosa y UDP- galactosa en una reacción unidireccional catalizada por la enzima lactosa sintasa (E.C.
2.4.1.22 UDP-galactosa:D-glucosa 4 β-D-galactotransferasa) (Keller et al. 1993).
La lactosa está presente en forma natural en la leche de los mamíferos y su proporción varía dependiendo de la especie oscilando en distintas especies de mamíferos entre 6.8 La lactosa está presente en forma natural en la leche de los mamíferos y su proporción varía dependiendo de la especie oscilando en distintas especies de mamíferos entre 6.8
En humanos, la lactosa proporciona al menos la mitad de la energía calórica durante los primeros dos años de vida, a partir de ese momento, entre los 2 y los 20 años la digestión
de la lactosa disminuye hasta cantidades muy bajas y hasta nulas en la mayoría de las personas (Holden Mace, 1997; Aoki, 2001; Swallow, 2003). Este hecho se atribuye al proceso natural (Troelsen et al. 1994, Rings et al. 1992) de disminución gradual de la producción de lactasa después de la infancia, proceso que ocurre en todos los mamíferos, y que puede interpretarse en términos evolutivos como un evento que provoca al infante un rechazo por la leche materna, llevando a la madre a recuperar su fecundidad al dejar
de amamantar (Trivers, 1974). Esto a su vez podría explicar la variación en cuanto al contenido de lactosa en la leche de diferentes especies pues optimiza el tiempo y la tasa
de destete de cada una de ellas (Liberman, 1978).
Por otra parte la leche contiene, además de la lactosa, nutrientes tales como calcio, vitaminas A y D, riboflavina y fósforo (Inman-Felton, 1998), nutrientes que son necesarios también después de la infancia. En occidente se ha promovido a la leche como una de las principales fuentes de calcio. Es por esto que se recomienda el consumo
de leche y sus derivados en la adultez para prevenir enfermedades como la osteoporosis, hipertensión y ciertos tipos de cáncer (Inman-Felton, 1998; Yates et al. 1998; Peña et al. 2002).
1.2 Lactasa e intolerancia a la lactosa
Las intolerancias a la lactosa se clasifican como primarias o secundarias. Las primarias son las que tienen un origen genético, como la deficiencia congénita de la lactasa o Las intolerancias a la lactosa se clasifican como primarias o secundarias. Las primarias son las que tienen un origen genético, como la deficiencia congénita de la lactasa o
La digestión de la lactosa se da principalmente en la región yeyunal del intestino delgado (Holden Mace, 1997). La lactasa presente hidroliza la lactosa en sus monosacáridos constituyentes, glucosa y galactosa, los cuales son absorbidos por las células de la membrana del intestino hacia el torrente sanguíneo (Kretchmer, 1972). En las personas donde está ausente la capacidad de digerir lactosa, la ingestión de una pequeña cantidad de leche (que puede variar entre 12 a 18 gramos o de 8 a 12 onzas de leche) (Swagerty et al. 2002) causa molestias ya que cuando los niveles de lactasa son insuficientes para poder descomponer la cantidad de lactosa consumida. Esta lactosa pasa intacta al colon, donde es parcialmente digerida por coliformes; el resultado es una acumulación de agua (debido la carga osmótica de la lactosa no hidrolizada) y desechos
de bacterias (CO 2 y ácidos grasos) que originan fermentación, produciéndose así
síntomas como son, distensión abdominal, cólicos, flatulencia, diarrea, nauseas y vomito (Fig 1) (Rosensweig, 1969); incluso pueden presentarse síntomas más severos (Wiley, 2008). La presencia de estos síntomas no sólo conllevan las molestias obvias sino que contribuyen a una mala digestión de otros nutrientes, especialmente de minerales en el tracto gastrointestinal (Phillips, 1981).
Existe una variación individual en la manifestación de los síntomas que depende de la cantidad de productos lácteos consumidos y de la sensibilidad individual a los dolores estomacales (Enattah, 2002). Sin embargo los niveles reducidos de lactasa no siempre causan síntomas incluso cuando se consume lactosa (De Vrese et al. 2001). Es por ello que la intolerancia no debe ser confundida con malabsorción, pues la intolerancia se
1 MIM son las iniciales de Mendelian Inheritance in Man, un catálogo de todas las características humanas que siguen patrones mendelianos. La versión en línea es OMIM (Online) y se encuentra en:
http:www.ncbi.nlm.nih.govomim http:www.ncbi.nlm.nih.govomim
Figura 1. Representación de la absorción (panel A) y malabsorción (panel B) de la lactosa en el yeyuno.En el panel A se encuentra lactasa para romper el enlace (hidrólisis) entre glucosa y galactosa los cuales conforman la lactosa. En el panel B los bajos niveles
de actividad de la lactasa permite el paso de lactosa hacia el colon donde es fermentada por bacterias (Zihlman, 1982 modificado por Durham, 1991).
Algunos alimentos lácteos procesados como el yogurt y el queso causan pocos problemas en la mayoría de las personas ya que contienen bajos niveles de lactosa o ellos mismos secretan lactasas (por medio de Lactobacillus acidophilus), por lo que el procesado de leche se considera una posible una adaptación cultural al rasgo de la intolerancia a la lactosa (De Vrese et al. 2001; Adolfsson et al. 2004). En ocasiones, la actividad de la lactasa residual o la presencia de algunas bacterias intestinales que pueden metabolizar la lactosa son suficientes para aminorar los síntomas de intolerancia (Ransome-Kuti, 1977; Hill, 1983; Johnson et al. 1987).
1.2.1 Diagnóstico de intolerancia a la lactosa
Si bien es cierto la determinación a nivel clínico de la intolerancia a la lactosa es difícil, se han tratado de desarrollar algunos métodos. El método más directo involucra la toma
de una biopsia del intestino y se ha realizado en poblaciones hospitalizadas (Dunphy et al. 1965; Enattah et al. 2002; 2005). Otra de las pruebas requiere de la medición de niveles de glucosa en la sangre luego de una a dos horas (en intervalos de 15 a 20 minutos) de la ingestión de 50 gramos de lactosa en una solución al 12. 5, lo que equivale a un cuarto de litro de leche. Así, un aumento de menos de 20 mg de glucosa por cada 100 ml de sangre es considerado un indicador de intolerancia a la lactosa (Hoffman, 1937; Dubowsky, 1962). Algunas modificaciones se han hecho a los métodos
de mediciones sanguíneas, por ejemplo, administrando previamente etanol (Jussila, 1969) o por medio de lactosa marcada con isótopos radiactivos (Laws et al. 1967). Sin embargo, han surgido controversias sobre la confiabilidad de estos métodos para el diagnóstico (Cuatrecasas et al. 1965; McGill Newcomer, 1966; McMichael et al. 1966) además de ser poco prácticos (Harrison, 1975). Es por esto que se trataron de encontrar técnicas clínicas indirectas, que causaran los inconvenientes mínimos; una de ellas está basada en pruebas de orina que revelen una reducción de azúcares (Cook Howells, 1968) y la otra en un análisis de carbono o hidrógeno expirado a intervalos regulares (Calloway Murphy, 1968). Aún así, los métodos de medición directa ofrecen mejores resultados y son utilizados actualmente por presentar mayores índices
de confiabilidad (Pimentel et al. 2004). Lo más importante y que es subyacente a todos estos métodos de diagnóstico es que requieren de facilidades clínicas, personal médico y pacientes concientes de las molestias que podrían tener durante las pruebas (Harrison, 1975).
1.3 Desarrollo histórico de la dilucidación de las bases genético-moleculares de la intolerancia a la lactosa
En 1965 las investigaciones biomédicas comenzaron a revelar que existía una variación sistemática en la fisiología digestiva de la leche en los adultos. En este mismo año Pedro Cuatrecasas, Dean Lokwood y Jaques Caldwell encontraron que la leche fresca no podía En 1965 las investigaciones biomédicas comenzaron a revelar que existía una variación sistemática en la fisiología digestiva de la leche en los adultos. En este mismo año Pedro Cuatrecasas, Dean Lokwood y Jaques Caldwell encontraron que la leche fresca no podía
de 19, 84). Al profundizar las investigaciones Bayless y Rosensweig (1967) determinaron que la hipolactasia en los adultos es un rasgo determinado genéticamente y Kretchmer (1971, 1972) mostró que la hipolactasia es recesiva.
En 1988 Kruse et al. encontraron evidencia de que el gene de la lactasa (LPH) se encuentra en el brazo corto del cromosoma 2 (2q) y en 1993 Harvey et al. refinaron su ubicación a la banda 2q21, mientras que Boll et al. (1991) no encontraron diferencias en la estructura del gen, a nivel de ADN, ni en la de la proteína que producen los individuos con niveles altos o bajos de lactasa. Esto es válido también para la alactasia congénita (Järvelä et al. 1998). En ambos tipos de intolerancias primarias se ha encontrado que la causa genética de los problemas se encuentra en regiones vecinas del gen de la LPH pero separadas de él (Järvelä et al. 1998; Enattah et al. 2002).
Estudios de la biología molecular del gen (Ennatah et al. 2002) que codifica a la enzima lactasa han mostrado que el problema se origina en la reducción de la expresión del gen
a proporciones que varían entre el 2 y el 10 con respecto a aquellos de la edad lactante y que se conoce como no persistencia de la lactasa, mientras que en las personas que no sufren el padecimiento, en quienes los niveles de expresión génica casi no cambian durante el desarrollo, se le denomina persistencia de la lactasa en adultos. Estos correlacionan directamente con los fenotipos de intolerancia tolerancia a la lactosa (Enattah, 2005).
A nivel de ADN Enattah et al. (2002) reportaron para poblaciones europeas dos SNPs (el término SNPs es usado universalmente, en inglés, single nucleotide polimorphisms y en español se entiende como mutación de punto) corriente arriba del codón iniciador del gen de la LPH que correlacionan con los dos fenotipos, uno, CT a –13910 pb, y el otro, GA a –22018 pb.
Las personas homocigotas C-13910 y G-22018 no muestran persistencia de la lactasa, mientras que las homocigotas T-13910 y A-22018 y las heterocigotas CT-13910 y GA-
22018 muestran persistencia de la lactasa (Troelsen, 2005). Recientemente se han asociado otros marcadores en grupos que cuentan con historia pastoril; para africanos estos son los SNPs GC-14010, TG-13915 y CG-13907 (Tishkoff et al. 2006) y para grupos pastoriles árabes TC -3712 y TG -13915 (Enattah et al. 2008). De esta manera, el conocimiento de los genotipos en cada uno de estos sitios y de los haplotipos que conforman la combinación de genotipos entre estos marcadores además del aspecto ancestral podría servir como indicadores de susceptibilidad a padecer de problemas asociados a la digestión de la lactosa.
1.4 Distribución de la capacidad para digerir la lactosa en diferentes poblaciones del mundo
La distribución de los polimorfismos asociados con la capacidad de digerir la lactosa se
ha correlacionado con las prácticas culturales de las regiones en que se domesticó el ganado, y en consecuencia surgieron las condiciones para el consumo de leche fresca (Durham, 1991; Hollox et al 2001).
En las regiones en que se adoptó la práctica pastoril, norte de Europa y noreste de África, el porcentaje de personas con persistencia de la lactasa es muy alta (> 70), mientras que ésta disminuye (30-70) en las regiones Mediterránea, del Oriente medio, sur de África, así como en Asia Central y Sur (Holden Mace, 1997). Esta correlación
ha sugerido que en los grupos que histórica y culturalmente han consumido leche fresca y sus derivados, se dió una selección natural a favor de la persistencia de la lactasa y por ello se observan los diferentes patrones de tolerancia.
Otras regiones muestran baja prevalencia de la persistencia de la lactasa: el África Subsahariana y Oriental, el sureste de Asia y en los nativos americanos, donde el pastoralismo no era importante o no existía del todo (Durham, 1991; Holden Mace, 1997; Bloom Sherman, 2005; Enattah et al. 2007). Por ejemplo, datos de prevalencia
de intolerancia a lactosa, en diferentes poblaciones de las regiones mencionadas, son: Siberia 87 (Lember et al. 1995), España 15 (Peña-Yañez, et al. 1971), País Vasco
55 (Peña et al. 2002), Guinea 83 (Gibney et al. 1981), Estados Unidos 25 (en este caso se da el porcentaje por etnia dentro de la población estadounidense con una intolerancia de 80 para afroamericanos, 62 a 100 indígenas Pima y 90 asiáticos) (Inman-Felton, 1998). Para poblaciones mongoloides incluyendo los amerindios, la actividad desaparece después de los primeros años de vida (Huang Bayless, 1968; Newcomer et al, 1977; Jobling, 2004).
Debido al desarrollo de la industria lechera estas diferencias se hicieron evidentes conforme se promovió el consumo de lácteos por parte de las empresas productoras y programas de ayuda nutricional (USDA, 2010). Algunos investigadores señalaron la existencia de “etnocentrismo nutricional” (McCraken, 1971), “falacia de la normalidad médica” (Williams, 2000) o “bioetnocentrismo” (Wiley, 2008) como crítica a las políticas nutricionales que promueven el consumo de leche en todas las poblaciones debido a la tendencia de considerar como “normales” características que son comunes sólo en ciertos grupos, principalmente europeos, considerando así la hipolactasia como una desviación y no como una condición ancestral (Liberman, 1978; Wiley, 2008).
En Costa Rica la producción industrial de leche fue promovida por parte del movimiento cooperativo de los años 60 (Dos Pinos, 2010; INFOCOOP, 2010) y aunque no se conoce la prevalencia de la intolerancia a la lactosa, las políticas de salud mayormente impulsadas desde los años 70´s hasta la actualidad, incluyen el envío de leche a las poblaciones de mayor riesgo de desnutrición al país, y por ende a aquellas que son señaladas dentro del sector pobre en el que se incluye también a los grupos indígenas. Para poblaciones amerindias los estudios sobre la persistencia de la lactasa son escasos, y ninguno incluye a los grupos de Costa Rica. Se predice que estas poblaciones, al ser descendientes de grupos asiáticos que no desarrollaron prácticas pastoriles, no deberían presentar las variantes asociadas a la persistencia de la lactasa en altas frecuencias y por lo tanto, asimismo, la mayoría de los individuos no lactantes serían intolerantes a la lactosa.
Es de particular importancia el conocimiento sobre la susceptibilidad a la intolerancia a la lactosa en estos grupos debido al potencial impacto de los cambios dietéticos sufridos como consecuencia de la creciente aculturación (Bozzoli Guevara, 2002). Se espera que estos cambios sean mayores en poblaciones donde se facilite el acceso al consumo
de los productos lácteos que se da como resultado de los procesos de expansión comercial de empresas productoras o cooperativas locales (Mata et al. 1985) o que llegan a ellas a través del estado con programas de alimentación que actualmente se hacen efectivos a través de asociaciones de desarrollo locales llamadas Pro-CEN-CINAI, las cuáles distribuyen mensualmente leche íntegra a sectores con mayores índices de pobreza. Actualmente los beneficiados de esta distribución son 72 300 niños a nivel nacional entre los que se toma en cuenta a los grupos indígenas (MIDEPLAN, 2006). Es un número considerable de hogares que disponen de este alimento mensualmente agregándose a los productos de uso común, dentro de la canasta básica (INEC, 2002).
El interés en el estudio de las poblaciones amerindias obedece, además de su aislamiento durante miles de años de poblaciones con cultura del consumo de lácteos, a su importancia demográfica (altas tasas de reproducción) repercutiendo y teniendo su impacto sobre los grupos mestizados con las cuales ellos comparten su caudal genético (Arias, 1991; Barrantes Morera, 1999).
2. Objetivos
2.1 Objetivo General
Estudiar la variación molecular asociada con intolerancia a la lactosa en grupos amerindios de Baja Centroamérica.
2.2 Objetivos específicos
1. Caracterizar y cuantificar la variación genética de una región que comprende al gen LCT en distintos grupos amerindios.
2. Estimar si la prevalencia de variantes europeas y africanas concuerda con los datos preexistentes de mezcla para cada población.
3. Evaluar la neutralidad de las variantes encontradas en la región genómica que incluye al gen LCT para comprobar la hipótesis de la influencia de selección natural sobre este locus.
4. Valorar el riesgo de sufrir malabsorción de lactosa en estos grupos indígenas.
3. Marco Teórico
Con los cambios que se dieron alrededor del neolítico en algunas sociedades humanas, cuando surge el pastoralismo, y por consiguiente se inicia el consumo de leche en edades posteriores a la ablactación, se origina un cambio ambiental que ha puesto en evidencia la diferencia genética entre individuos en su capacidad de digerir la lactosa en esas edades. Por lo tanto las principales hipótesis para explicar el fenómeno de tolerancia se ubica en dos categorías, la primera se centra en la selección natural a favor de la mutación que confiere tolerancia asociada a un cambio dietético por disponibilidad de nutrientes y prácticas culturales (Feldman Cavalli- Sforza, 1976; Simoons, 1978; Durham, 1991; Bersaglieri et al. 2004; Enattah, 2002 et al; 2007; Tishkoff et al. 2006; Burger et al. 2007) y, la segunda, que por el contrario se basa en la distribución de frecuencias alélicas dependientes de procesos evolutivos no determinísticos como son la deriva genética, el efecto fundador y la migración, todos ellos relacionados entre sí (Nei Saitou, 1986; Swallow, 2003). Esta hipótesis es llamada de la causa inversa (McCraken, 1971), y se fundamenta en la presencia significativa de la mutación en las poblaciones antes de la domesticación por lo que su propagación no fue impulsada inicialmente por la selección (Peña et al. 2002; Brines, 2004). Los detalles de las hipótesis mencionadas además de otras que se han planteado, se reseñan a continuación con mayor detalle.
3.1 Desarrollo histórico de las hipótesis que explican el fenómeno de intolerancia a la lactosa.
La caracterización de una población humana utilizando polimorfismos genéticos y enfermedades genéticas es sólo un paso inicial hacia la comprensión de diferencias entre poblaciones humanas. Se requieren hipótesis para explicar las diferencias (Vogel Motulsky, 1986). En el caso de la intolerancia a la lactosa varias fueron desarrolladas desde 1965 para explicar la variación de la fisiología digestiva (Simoons, 1969).
a) Hipótesis de la enfermedad. Según ésta, algunos grupos eran más propensos a sufrir intolerancia debido a su alta prevalencia de enfermedades infecciosas, principalmente aquellas de tipo gastrointestinal (Keush, 1972; Ransome-Kuti, 1977; Anderson Vullo, 1994), sin embargo esto no se sostuvo ya que podía ser aplicable a casos individuales o grupos aislados pero no explicaba las diferencias observadas entre los grupos de distinta ancestría que compartían el mismo ambiente (Harrison, 1975).
b) Hipótesis de la inhibición dietética. Se refería a que algunos grupos consumen en su alimentación o en sus tratamientos médicos sustancias que pueden inhibir la actividad
de la lactasa (Simoons, 1969). Sin embargo ésta no se ha comprobado para ningún alimento o grupo de ellos, pues ninguno ha provocado una mala absorción de forma tan profunda en tantas dietas como existen sistemas de subsistencia y ambientes diferentes.
c) Hipótesis de la inducción. Propuesta por Bolin et al (1969), señalaba que si después del destete en la infancia se continuaba con el consumo en pequeñas o grandes cantidades, se mantendría inducida la lactasa y persistiría en la adultez. Por lo demás, esto sería congruente con el hecho de que el operón de la lactasa en bacterias es el ejemplo clásico de la inducción enzimática (Jacob Monod, 1961; Watson et al. 2008). Un número de experimentos trataron de comprobarlo sin embargo tales intentos fallaron (Cuatrecasas et al. 1965; Johnson et al. 1981; Hawkins, 1996); pues aunque se lograba una mejor absorción y se disminuían los síntomas, la actividad de lactasa se mantenía en bajos niveles, y el cambio se debía a la presencia de ciertas bacterias intestinales capaces
de digerir la lactosa, concluyendo así, que la inducción enzimática no aplicaba en este caso (Johnson et al. 1981; De Vrese et al. 2001).
d) Hipótesis genética. Fue propuesta de manera independiente por Simoons (1970) y McCracken (1971) y ha acumulado evidencia favorable desde entonces. Se basa en que las diferencias raciales observadas se deben a una adaptación a las prácticas de pastoreo y lechería que de alguna manera les confería ventaja selectiva. En un inicio la hipótesis se apoyó en la demostración de que la alactasia seguía un patrón de herencia mendeliano y el nivel de tolerancia era diferente en distintas poblaciones, aún así, lo que d) Hipótesis genética. Fue propuesta de manera independiente por Simoons (1970) y McCracken (1971) y ha acumulado evidencia favorable desde entonces. Se basa en que las diferencias raciales observadas se deben a una adaptación a las prácticas de pastoreo y lechería que de alguna manera les confería ventaja selectiva. En un inicio la hipótesis se apoyó en la demostración de que la alactasia seguía un patrón de herencia mendeliano y el nivel de tolerancia era diferente en distintas poblaciones, aún así, lo que
Estas diferencias muestran también una distribución particular entre grupos étnicos con localizaciones geográficas asociadas al desarrollo pastoril. A partir de esta distribución se plantea la hipótesis de coevolución gen-cultura, también conocida como hipótesis histórico-cultural, la cual sigue la línea de la hipótesis genética, proponiendo que la persistencia de la lactasa en la adultez es una adaptación milenaria al pastoralismo y consumo de leche. En este caso se propone que la capacidad para digerir la lactosa tuvo una ventaja selectiva en adultos de poblaciones pastoriles al tener disposición de beneficios nutricionales a través de la leche (Holden Mace, 1997; Bloom Sherman, 2005; Enatthah, 2002; Tishkoff et al. 2006; Burger et al. 2007). Recientemente Cochran y Harpending (2009) propusieron que las poblaciones con el rasgo de tolerancia (indoeuropeas) se encontraron en ventaja frente a otros grupos debido a que en procesos bélicos que demandaban movilidad contaban con el alimento y por lo tanto se encontraban mejor nutridas al poder consumir leche y carne de los rumiantes.
La teoría de coevolución gen-cultura ha sido también llamada mediación cultural por otros investigadores como Durham (1991). Se sostiene que esta hipótesis puede hallarse siempre que exista un cambio cultural dentro de una población o que haya diferencias culturales entre dos poblaciones que causen alguna diferencia en la tasa yo dirección de la evolución genética. Ampliando, la mediación cultural ocurre siempre que una diferencia cultural entre los miembros de una o varias poblaciones origine un comportamiento diferente y que alrededor de éste, se cause una diferencia en la La teoría de coevolución gen-cultura ha sido también llamada mediación cultural por otros investigadores como Durham (1991). Se sostiene que esta hipótesis puede hallarse siempre que exista un cambio cultural dentro de una población o que haya diferencias culturales entre dos poblaciones que causen alguna diferencia en la tasa yo dirección de la evolución genética. Ampliando, la mediación cultural ocurre siempre que una diferencia cultural entre los miembros de una o varias poblaciones origine un comportamiento diferente y que alrededor de éste, se cause una diferencia en la
de regiones con cultura pastoralista tenían ventaja en su ambiente, sea porque estuviesen en algún momento bajo estrés dietético o por una ventaja a nivel social que se reflejara en una mayor reproducción (Gerbault et al. 2009). Concordante con esto son los resultados de las estimaciones de antigüedad para las altas frecuencias de las mutaciones africanas y europeas están alrededor de 7000 años A.C. (Tishkof et al. 2006).
e) En este contexto surge la hipótesis de la causa inversa, una hipótesis contraria a la mediación cultural. Esta hipótesis no descarta que haya existido un papel selectivo a favor del rasgo de tolerancia, pero contempla su papel dentro de un marco de variación favorable preexistente. Es decir, la variación del rasgo tolerancia como resultado de un efecto fundador y la deriva genética a nivel mundial (características propias de las poblaciones naturales (Kimura, 1968) dado como resultado de las migraciones que se dieron en la dispersión de los seres humanos desde África hacia los diferentes continentes alrededor de 100 000 A.C. (Nei Saitou, 1986; Swallow, 2003; Brines, 2004).
Aquellas poblaciones donde no consumían leche fresca por causar malestar desarrollaron tecnologías para su procesamiento y así poder tener un aprovechamiento del producto, lo que explicaría que mantengan bajas tasas de tolerancia a leche fresca (Durham, 1991). Según McCraken (1971) las debilidades de esta hipótesis radican en Aquellas poblaciones donde no consumían leche fresca por causar malestar desarrollaron tecnologías para su procesamiento y así poder tener un aprovechamiento del producto, lo que explicaría que mantengan bajas tasas de tolerancia a leche fresca (Durham, 1991). Según McCraken (1971) las debilidades de esta hipótesis radican en
Al tener un marco de hipótesis explicativas con respecto al rasgo en estudio se debe tener presente un aspecto substancial en cuanto a la evolución de los amerindios, para lograr una comprensión del potencial problema de salud.
La llegada de los primeros americanos se dio alrededor de 12 500 años antes del presente (Torroni et al. 1994, Meltzer, 2009). Los grupos que pertenecen al grupo lingüístico chibcha se asentaron en Baja Centroamérica hace alrededor de 10 000 años; y desde entonces estuvieron sujetos a procesos evolutivos de las poblaciones naturales tales como deriva genética y cuellos de botella (Neel Salzano, 1964). Durante este lapso se desarrolló la agricultura y ganadería en Europa y Medio Oriente por lo que los amerindios se mantuvieron ajenos estas las prácticas culturales durante el neolítico. Con la llegada de los europeos 500 años atrás se produjo además de disminución demográfica, dispersión de los grupos y mezcla interétnica (Barrantes, 1990) la inserción
de nuevos rasgos culturales tales como la cría de ganado. El ganado fue introducido al continente en 1493 por Cristóbal Colón en su segundo viaje (Primo, 1992).
El estudio en estos grupos permite comprobar hipótesis sobre la distribución, la cinética
de las frecuencias alélicas sin el factor ambiental que impulsa la selección del fenotipo persistencia de la lactasa. Permite además abordar ciertos temas de importancia biomédica con mayores posibilidades de éxito de las que ofrecería su análisis en cualquier otro grupo humano (Neel Salzano, 1964; Neel, 1968). La intolerancia a la lactosa es un problema de salud que puede estar presente en los grupos amerindios contemporáneos y se presentaría dependiendo del grado de incorporación de la práctica del consumo de leche y la capacidad de respuesta a ella desde un punto de vista de las frecuencias alélicas sin el factor ambiental que impulsa la selección del fenotipo persistencia de la lactasa. Permite además abordar ciertos temas de importancia biomédica con mayores posibilidades de éxito de las que ofrecería su análisis en cualquier otro grupo humano (Neel Salzano, 1964; Neel, 1968). La intolerancia a la lactosa es un problema de salud que puede estar presente en los grupos amerindios contemporáneos y se presentaría dependiendo del grado de incorporación de la práctica del consumo de leche y la capacidad de respuesta a ella desde un punto de vista
4. Metodología
4.1 Poblaciones de estudio
Este trabajo se realizó con grupos indígenas de Costa Rica y uno de Nicaragua de filiación lingüística chibcha a excepción del grupo chorotega (grupo otomangue) localizado en el pacífico costarricense (Constenla, 1991). La mayoría de estos grupos habitan en diferentes sectores montañosos de Costa Rica que anteriormente fueron llamadas “reservas indígenas” pero que actualmente son reconocidos como “territorios indígenas” por el estado costarricense (Guevara Salas, 2000). Solo un 42 de la población indígena vive dentro de los territorios indígenas (Pérez-Brignoli, 2005) y este porcentaje asciende a un total de 37 404 personas (Guevara Salas, 2000). La elección
de estos grupos está basada principalmente en el interés comparativo tanto por los diferentes grados de mezcla como por la distribución geográfica en que se encuentran. Se presenta una breve reseña de cada uno de ellos a continuación.
4.1.1 Huetar Este grupo habita en dos comunidades, Quitirrisí y Zapatón, que se encuentran al oeste
de San José. Se estima que su población oscila entre 1600 y 1800 personas (Guevara Salas, 2000; Pérez-Brignoli, 2005). Se ha descrito como una de las poblaciones con mayor mezcla interétnica y por lo tanto con el mayor grado de aculturación (Ruiz- Narváez et al. 2005), sin embargo estudios genéticos han comprobado su ancestría indígena e indicado su relación con otros grupos chibchas de la región (Barrantes et al. 1990); la cual es mayor con los grupos talamanqueños que con los Maleku (Azofeifa et al. 2001).
4.1.2 Maleku Habitaban las tierras altas del norte de Costa Rica extendiéndose hasta el Lago de Nicaragua (Cooke, 1997) pero actualmente se localizan en las planicies del norte en tres pequeñas comunidades o “palenques” (Margarita, Tonjibe y El Sol) (Bozzoli Guevara, 2002). Existe una población aproximada de 890 individuos (Guevara Salas,
2000). Estudios genéticos y lingüísticos han relacionado mayormente a esta población con grupos no talamanqueños (Teribe y Kuna) situando la separación de estos alrededor
de 7000 años atrás (Barrantes et al. 1990b).
4.1.3 Cabécar Lo forman alrededor de 14 000 habitantes (Guevara Salas, 2000). Es uno de los grupo menos aculturados y étnicamente menos mezclados (Barrantes, 1993b), probablemente por su aislamiento en las regiones remotas ubicadas en el sector atlántico de la Cordillera de Talamanca (Gabb, 1981). Este aislamiento ha permitido que el grupo mantenga su cultura lo que se manifiesta en un 85 de la población que habla el idioma (Guevara Salas, 2000).
4.1.4 Bribri El grupo bribri también es un grupo talamanqueño que presenta gran similitud cultural y genética con los cabécares. Cerca del 70 de la población habla el idioma bribri (Guevara Salas, 2000) lo que refleja un grupo que se mantiene en gran medida su riqueza cultural. Cuentan con un aproximado de 12 000 habitantes (Guevara Salas, 2000) conformando así uno de los grupos más numerosos de Costa Rica.
4.1.5 Ngöbe Este grupo ha habitado ambos lados de la frontera entre Costa Rica y Panamá, aunque la mayoría de la población se ha mantenido al oeste de Panamá en la provincia de Chiriquí (Lothrop, 1963; Young, 1970). Los ngöbes costarricenses se asientan al sur del país, principalmente en tres localidades: Limoncito, Abrojo y Conte Burica; las cuales fueron establecidas como tales en los últimos 50 años por migrantes provenientes de Chiriquí (Barrantes et al. 1982). En estas localidades se ha estimado entre 2000 a 2500 habitantes (Barrantes et al. 1982; Guevara Salas, 2000) y se ha caracterizado como una población poco mezclada con descendientes africanos y europeos (Barrantes et al. 1982).
4.1.6 Rama El grupo Rama habita el sureste caribeño de la costa nicaragüense y se estima que su población se encuentra entre 1350 a 3000 personas (Pérez-Brignoli, 2005; Melton, 2008). Se ha sugerido que son un grupo remanente de los Suerre, Huetar, Corobicí, Maleku, Voto, Melchora, Kukra o Caribes, aunque tomando en cuenta marcadores del cromosoma Y se ha comprobado que se encuentran estrechamente relacionados con el grupo chorotega (Melton, 2008).
4.1.7 Chorotega Se estima que habitan 1436 personas en la península de Nicoya dentro el territorio (Guevara Salas, 2000). Aunque poseen una filiación lingüística distinta al chibcha al ser una población mesoamericana son considerados el límite con los grupos chibchas (Constenla, 1991). La evidencia ha mostrado una relación genética estrecha con estos, pues marcadores mitocondriales y del cromosoma Y sugieren que existieron uniones entre hombres de este grupo mesoamericano con mujeres del grupo chibcha (Melton, 2008). Gran parte de su cultura autóctona no se conserva hoy en día, sin embargo movimientos de etnogénesis aspiran a mantener la distinción histórico-cultural de este grupo en relación con los otros grupos remanentes chibchas (Guevara Salas, 2000).
4.2 Encuesta sobre la percepción de los efectos del consumo de leche en dos comunidades indígenas.
Se aplicó un cuestionario (ver anexo 1) en dos diferentes comunidades indígenas para averiguar sobre la presencia de síntomas relacionados con intolerancia a la lactosa, es decir con el fenotipo de no persistencia de la lactasa. En la segunda semana del mes de julio del año 2009 se realizó una visita a la comunidad ngöbe de Limoncito en San Vito
de Coto Brus, específicamente al sitio conocido como Limoncito. Los cuestionarios fueron aplicados a 8 mujeres y 13 hombres adultos cabezas de familia. El 22 de noviembre de 2008 se llevo a cabo una visita a la comunidad maleku donde se aplicó el cuestionario a las dos encargadas y 2 de los trabajadores del centro de información turística de la comunidad indígena maleku llamado Kaoranh ú tokuf ubicado en El
Palenque Tonjibe. Debido a que el número de cuestionarios que se logró aplicar fue muy bajo y los datos obtenidos no son estadísticamente confiables ni concluyentes, los resultados de esta averiguación se muestran en el anexo 2.
4.3 Análisis genético
Se utilizaron muestras de ADN de las siguientes poblaciones amerindias: Maleku (n 2 =31), Ngöbe de las comunidades de Abrojo (n=42), Dos Brazos (n=14) y Limoncito
(Limoncito) (n=10); Huetar de las comunidades de Zapatón (n=35) y Quitirrisí (n=15); Bribri de la comunidad de Mojoncito (n=21); Cabécar de la comunidad de Alto Telire (n=18); Chorotega de la comunidad de Matambú (n=16) y Rama (n=12) de la comunidad de Rama Cay. Todas estas muestras fueron colectadas durante el desarrollo del programa “Ecología, diversidad genética y salud de los amerindios de Costa Rica”, inscrito en la Vicerrectoría de Investigación bajo el No 742-93-903, por lo que cumplió con todos los procedimientos de aprobación requeridos, así como con los consentimientos de los líderes y comunidades, según era requerido entonces. Más detalles sobre las metodologías de colectas de muestras se encuentran en Barrantes (1990). El número total de muestras analizadas ascendió a 214. En la selección de las muestras se evitó tomar aquellas que pertenecieran a una misma familia. Es importante mencionar que dada la estructura de las poblaciones amerindias el tamaño de la muestra puede representar con confiabilidad el grupo en estudio pues son poblaciones pequeñas y muy emparentadas. Estas relaciones cercanas entre familias son propias de estos grupos amerindios según se ha descrito (Barrantes, 1993a).
Para cada una de estas muestras el ADN fue preparado a concentraciones finales de 25 ngul para cada una; esta es una concentración apropiada para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), técnica básica para esta investigación. Se utilizaron 9 marcadores genéticos de tipo SNP (por sus siglas en inglés Single Nucleotide Polimorfism) (Cuadro 1). Ocho de estos marcadores fueron descritos por Enattah et al. (2005, 2007); el otro que fue relacionado con tolerancia a la lactosa en grupos africanos
2 n= número de individuos 2 n= número de individuos
Cuadro 1. SNP´s analizados en las muestras de ADN para todas las poblaciones.
SNP
Tipo y posición
dbSNP (GenBank)
Posición en el
respecto al gen de la
cromosoma
lactasa
1 CT -8540
rs3754686
2 GC -8630
rs3769005
3 CT -13910 rs4988235
+ 4 GC -14010 -14010 lactasa
5 CT -15239
rs4954493
6 GC -20077
rs3099181
7 GA -22018 rs182549
8 CT -27312
rs4988183
9 AC -27807
rs3087343
Número de acceso en GenBank (online) se encuentra en: http:www.ncbi.nlm.nih.govGenbank
Posición en el cromosoma según GenBank. Tipos y posiciones descritas y asociadas para poblaciones europeas.
+ Tipo y posición descrita y asociada para poblaciones africanas.
Figura 2. Distancia (Kb) entre los diferentes marcadores utilizados (Modificado de Enattah et al. 2007).
Para cada muestra se requirió amplificar siete regiones diferentes, pues dos de los SNP`s están contenidos dentro de un mismo producto amplificado. Las disoluciones de PCR se realizaron en volúmenes finales de 25 ul compuestos por 2 ul de ADN [50 ng], 2.5 ul de
Buffer (NH 4 )SO 4 [15mM], 5 ul de MgCl 2 [25 mM], 1 ul de cada primer [5 uM], 0.2 ul
de dNTP`s [25uM] y 0.1 ul de Taq polimerasa [0.5 U]. Las recciones de PCR consistieron de 25 ciclos con una desnaturalización inicial y única de 5 minutos a 95 C; de dNTP`s [25uM] y 0.1 ul de Taq polimerasa [0.5 U]. Las recciones de PCR consistieron de 25 ciclos con una desnaturalización inicial y única de 5 minutos a 95 C;
de una tinción con plata. Los imprimadores rs4988183 y el rs4954493 se integraron en una PCR dúplex y los imprimadores rs3754686, rs3099181 y rs3087343 en una triplex (Fig 3).
rs375686 (297 pb) rs3087343 (250 pb) rs309181 (217 pb)
200 pb
Figura 3. Amplificación de fragmentos por PCR-triplex con los marcadores rs309181, rs3754686 y rs3087343 observados en un gel de acrilamida.
Para la detección de los SNP`s se utilizaron dos métodos de genotipeo: corte por enzimas de restricción (restriction fragment length polymorphisms-RFLPs) con visualización en geles de poliacrilamida y detección por medio de electroforesis capilar.
Los RFLPs permitieron analizar dos de las variantes, específicamente la variante CT en el nucleótido -13910 y la variante GA en el nucleótido -22018. Los imprimadores, condiciones de amplificación por PCR y las enzimas para analizar las variantes CT -13910 y GA -22018 fueron las descritas por Coelho y colaboradores (2005). Estos sitios polimórficos sirven para definir haplotipos que han sido caracterizados para otras poblaciones en el mundo (Hollox et al. 2001).
Se determinaron 7 genotipos con el método de minisecuenciación, utilizando el kit SNaPshot Multiplex de la casa Applied Biosystems. Para este paso, fue necesario amplificar las regiones en las que se encuentran estos marcadores y purificarlas para Se determinaron 7 genotipos con el método de minisecuenciación, utilizando el kit SNaPshot Multiplex de la casa Applied Biosystems. Para este paso, fue necesario amplificar las regiones en las que se encuentran estos marcadores y purificarlas para
de ADN fueron secuenciados, asimismo se llevo a cabo la secuenciación para aquellas muestras en que el genotipeo no era claro.
Una vez obtenidos los genotipos de cada sitio polimórfico se procedió a estimar las frecuencias alélicas, heterocigosis y equilibrio de Hardy-Weinberg por locus con el programa GenAlex versión 6.2 (Peakall R Smouse P, 2006). Se estimaron los haplotipos utilizando el programa PHASE versión 2.1 (Stephens et al. 2001) utilizando para ello los parámetros sugeridos en el programa. También se estimaron la medidas de
diversidad haplotípica ( Ĥ h )y F st para conocer la diferenciación genética entre las
subpoblaciones predefinidas y la prueba de neutralidad de Ewens-Waterson para evaluar el efecto selectivo utilizando el programa ARLEQUIN versión 3.1 (Excoffier et al. 2005). La relación entre los haplotipos encontrados se analizó con el programa NETWORK versión 4.5.1.6. (Bandelt et al. 1999) mediante la construcción de una red haplotípica que muestra la divergencia de los haplotipos a partir de un haplotipo ancestral determinado por máxima parsimonia, y los pasos mutacionales que se requieren para formar los demás haplotipos.