Uji Antioksidan dan Uji Antibakteri Pada Ekstrak Etanol Buah Mengkudu (Morinda Citrifolia L)Terhadap Bakteri Escherichia Coli dan Staphylococcus Aureus Chapter III V

BAB 3
METODE PENELITIAN

3.1 Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi :
-

Rotari Evaporator

Heidolph WB 2000

-

Gelas ukur

Pyrex

-

Gelas beaker

Pyrex

-

Gelas erlenmeyer

Pyrex

-

Tabung reaksi

Pyrex

-

Corong kaca

-

Pipet tetes

-

Spatula

-

Penangas air

-

Botol vial

-

Batang pengaduk

-

Aluminium foil

-

Kapas

-

Plastik wrap

-

Cottom bud

-

Rak tabung reaksi

-

Blender

-

Spektrofotometer UV-Visible Spectronic 300

-

Lemari pendingin

Toshiba

-

Pipet mikro

Eppendorf

-

Jarum ose

-

Cawan petri

-

Inkubator

-

Kertas cakram

-

Bunsen

Fiber Scientific

Universitas Sumatera Utara

17

-

Jangka sorong

-

Autoklaf

-

Pinset

-

Kuvet

-

Labu takar

-

Neraca analitik

Yamata SN 20

Mettler AE 200

3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah :
-

Buah mengkudu

-

Etanol

-

Aquadest

-

Nutrient Agar (NA)

-

Mueller Hinton Agar (MHA)

-

Serbuk DPPH

-

Biakan Staphylococcus aureus

-

Biakan Escherichia coli

3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang akan diteliti adalah buah mengkudu yang diproleh didaerah jalan
krakatau, medan deli, medan. Buah mengkudu diiris tipis tipis setelah itu
dikeringkan dibawah terik matahari selanjutnya dihaluskan dengan belender
sampai diperoleh serbuk mengkudu sampai diproleh 300 gr.
3.3.2 Ekstraksi Serbuk Buah Mengkudu
Ditimbang serbuk buah mengkudu sebanyak 300 g, dimaserasi dengan
menggunakan pelarut etanol 70% sebanyak 1 liter selama 24 jam. Kemudian
disaring. Filtrat etanol nuah mengkudu yang diproleh diuapkan menggunakan
rotari evaporator.

Universitas Sumatera Utara

18

3.3.3 Uji Antioksidan
3.3.3.1 Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM
Ditimbang serbuk DPPH sebanyak 8mg, dimasukan kedalam labu takar 50 ml,
ditambahkan methanol p.a sampai garis batas, dan dihomogenkan.
3.3.3.2 Pembuatan Larutan Blanko
Diukur larutan DPPH 0,3 mM sebanyak 1ml dimasukan kedalam labu takar 25ml
ditambahkan methanol p.a sampai garis batas dihomogenkan, dibiarkan selama 30
menit pada ruangan gelap, diukur absorbansi panjang maksimum 516 nm.
3.3.3.3 Pembuatan Variasi Ekstrak Buah Mengkudu
Ditimbang ekstrak mengkudu sebanyak 1 g dimasukan kedalam labu takar 100
ml, ditambahkan methanol p.a sampai baris batas dihomogenkan. Dibuat variasi
konsentrasi 100,200,300,400 ppm.
3.3.3.4 Uji Larutan Ekstrak Mengkudu
Diukur 5 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukan kedalam labu takar 25 ml
ditambahkan 2,5 ml larutan ekstrak mengkudu 100 ppm dihomogenkan dibiarka
selama 30 menit pada ruangan gelap dan diukur absorbansi pada panjang
gelombang 516 dilakukan dengan cara yang sama terhadap larutan ekstrak
mengkudu 200, 300 dan 400 ppm.

3.3.4 Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Mengkudu
3.3.4.1 Pembuatan Media Nutrien Agar (Na) Dan Inokulasi Bakteri
Sebanyak 1,4 g NA dimasukan kedalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan 50 ml
akuadest. Lalu panaskan diatas hot plate sampai mendidi dan disterilkan dalam
autoklaf pada suhu 121 oCselama 15 menit, lalu media dibagi 2 tabung reaksi dan
ditutup dengan kapas. Media dibiarkan memadat dengan cara memiringkan
tabung. Bakteri diinokulasikan diatas permukaan media dengan metode gores lalu
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 32-34 oC.

Universitas Sumatera Utara

19

3.3.4.2 Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Sebanyak 3,8 g MHA dimasukan dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan 100 ml
akuadest. Lalu panaskan diatas hot plate sampai mendidih dan disterilkan dalam
autoklaf pada suhu121 oC selama 15 menit. Kemudian media dituang kedalam 6
cawan petri dan didinginkan sampai media memadat.
3.3.4.3 Pembuatan Suspensi Bakteri
Masing-masing inokulat escherichia coli dan staphylococcus aureus diambil
dengan jarum ose steril dan disuspensi dengan akuades steril lalu dihomogenkan
dengan vortex hingga diperoleh suspensi sebanding kekeruhan.
3.3.4.4 Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Buah Mengkudu
Ekstrak mengkudu ditimbang sebanyak 500 mg kemudian dilarutkan dengan 1 ml
DMSO, konsentrasi ekstrak sama dengan 500 mg/ml. Kemudian dari konsentrasi
500 mg/ml dengan rumus pengenceran V1 . C1 = V2 . C2 dihitung dengan
konsentrasi 400 mg/ml, 300 mg/ml, 200 mg/ml dan 100 mg/ml.
3.3.4.5 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Mengkudu
Dimasukan media mueller hinton agar (MHA) kedakam cawan perti steril dengan
suhu 45-50 oC kemudian dibiarkan sampai memadat. Diambil cottom bud steril,
lalu dicelupkan kedalam inokulum bakteri, kemudian digoreskan kedalam media
MHA yang telah memadat. Dimasukan kertas cakram yang telah direndam dengan
ekstrak mengkudu dengan berbagai variasi konsentrasi kedalam cawan petri yang
telah terisi bakteri, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35 oC selama
24 jam. Selanjutnya diukur diameter zona hambat disekitar kertas cakram dengan
jangka sorong, dilakukan dengan cara yang sama terhadap bakteri Escherichia
coli dan Staphyloccus aureus.
.

Universitas Sumatera Utara

20

3.4 Bagan Penelitian
3.4.1 Pembuatan Ekstrak Buah Mengkudu

300 gr Serbuk Buah Mengkudu
Dimaserasi dengan
sebanyak 1 L

etanol

70%

Didiamkan selama ± 24 jam
Disaring

Larutan etanol

Residu

Dipekatkan dengan rotari evaporator
Ekstrak pekat
Mengkudu

3.4.2 Uji Antioksidan Terhadap Ekstrak Buah Mengkudu
3.4.2.1 Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM

8 mg Serbuk DPPH
Dimasukan kedalam labu takar 50 ml
Ditambahkan etanol p.a sampai garis
batas
Dihomogenkan
Larutan DPPH 0,4 mM

Universitas Sumatera Utara

21

3.4.2.2 Pembuatan Variasi Larutan Ekstrak Buah Mengkudu

0,05 g Ekstrak Buah Mengkudu

Dimasukan kedalam labu takar 50 ml
Ditambahkan etanol p.a sampai garis
batas
Dihomogenkan
50 ml larutan induk 1000 ppm

Dipipet 2,5 ml dengan
pipet volum

Dipipet 5 ml dengan
pipet volume

Dipipet 7,5 ml dengan
pipet volum

Dimasukan kedalam
labu takar 25 ml

Dimasukan kedalam
labu takar 25 ml

Dimasukan kedalam
labu takar 25 ml

Ditambahkan etanol
p.a sampai garis batas

Ditambahkan etanol
p.a sampai garis batas

Ditambahkan etanol
p.a sampai garis batas

Dihomogenkan

Dihomogenkan

Dihomogenkan

25 ml larutan
100 ppm

25 ml larutan
200 ppm

25 ml larutan
300 ppm

Dilakukan hal yang sama untuk konsenrasi larutan 400 ppm dengan penambahan
larutan induk sebanyak 10 ml.

Universitas Sumatera Utara

22

3.4.2.3 Pembuatan Larutan Blanko

1 ml larutan DPPH 0,4 mM

Dimasukan kedalam tabung reaksi
Ditambahkan 2,5 ml etanol p.a
Dihomogenkan
Dibiarkan selama 30 menit dalam ruangan gelap
Diukur absorbansi
maksimum 516 nm

pada

panjang

gelombang

Hasil

3.4.2.4 Uji Larutan Variasi Konsentrasi Sampel

1 ml larutan DPPH 0,4 mM

Dimasukan kedalam tabung reaksi
Ditambahkan
konsentrasi

2,5

ml

larutan

sampel

sesuai

Dihomogenkan
Dibiarkan selama 30 menit dalam ruangan gelap
Diukur absorbansi
maksimum 516 nm

pada

panjang

gelombang

Hasil

Universitas Sumatera Utara

23

3.5.4. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Buah mengkudu
1. Pembuatan Media Mueller Hinton (MHA)

8,5 gram media MHA (Mueller Hinton Agar)

Dilarutkan dengan 250 ml aquadest didalam
labu erlenmeyer
Dipanaskan dan diaduk hingga larut dan
mendidih
Disterilkan didalam autoklaf pada suhu
121oC selama 15 menit
Media MHA

Universitas Sumatera Utara

24

2.

Pembuatan Stok Kultur Bakteri
1,3 gram Media NA (Nutrien Agar)

Dilarutkan dengan 250 ml aquadest kedalam gelas
erlenmeyer
Dipanaskan sambil diaduk hingga larut dan mendidih
Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15
menit
Media NA (Nutrient Agar) steril

Dimasukan kedalam tabung reaksi sebanyak 3 ml
Dibiarkan pada temperatur kamar sampai memadat pada
posisi miring membentuk sudut 30-45 o
Diambil biakan bakteri S.aureus dari strain utama dengan
jarum ose lalu digoreskan pada media NA yang telah
memadat
Diinkubasi pada suhu 35oC selama 18-24 jam

Stok Kultur Bakteri

Dilakukan hal yang sama untuk bakteri E.coli

Universitas Sumatera Utara

25

3.5.4.1 Uji Aktivitas Ekstrak Buah mengkududengan Metode Kirby Bauer

Biakan bakteri Escherichia coli dan
Staphylococcus aureus
disuspensi dalam akuades steril
dihomogenkan dengan vortex
dibandingkan dengan kekeruhan
Suspensi bakteri
diencerkan dengan akuades
Steril sampai kekeruhan

Media MHA

106 CFU/ml

di inkubasi di

Suspensi Bakteri

atas media MHA

di inkubasi di atas media MHA
Media MHA

Cakram
Sampel
diletakkan cakram Sampel diatas media MHA
di inkubasi secara terbaik dalam inkubator pada
suhu 32-34ºC selama 24 jam
di ukur diameter zona antibakteri

Hasil

Universitas Sumatera Utara

BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Hasil Penelitian

4.1.1 Hasil Pengukuran Absorbansi Ekstrak Buah Mengkudu
Pada ekstrak buah mengkudu dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan metode
DPPH radikal bebas untuk diperoleh nilai IC50 dengan dilakukan pengamatan
secara spektrofotometer UV-Visible pada panjang gelombang maksimum 516 nm.
Kemampuan antioksidan diukur sebagai penurunan serapan larutan DPPH
(perendaman warna ungu DPPH) dapat dilihat pada tabel 4.1.

Tabel 4.1.1 Hasil Pengukuran Absorbansi Ekstrak Buah Mengkudu
Sampel
Blanko 0,770

Absorbansi% Peredaman
0

100ppm 0,35753,63
200 ppm

0,167

300 ppm

0,059

400 ppm

0,039

78,31
92,33
94,93

Universitas Sumatera Utara

27

Dari persamaan regresi linier diproleh nilai IC50 = 33,93 mg/ml

%
% Peredaman

120
100
80
60
%

y = 0,137x + 45,32
R² = 0,886

40
20

Linear (%)

0
0

100

200

300

400

500

Konsentrasi Ekstrak Mengkudu (ppm)

Gambar 4.1.1 Grafik % Perendaman Vs Konsentrasi Ekstrak Buah
Mengkudu

4.1.2

Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Buah Mengkudu Dengan
Metode Kirby Baurer

Pada ekstrak buah mengkudu dilakukan uji aktivitas antibakteri dengan
menggunakan Metode Kirby Bauer.Aktivitas antibakteri ekstrak buah mengkudu
menunjukkan memiliki zona hambat pada pertumbuhan bakteri patogen yaitu
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

a

b

Gambar 4.1.2.1 Zona Hambat Pada a Larutan BlankoStaphylococcus aureus
dan b Larutan Blangko Escherichia coli

Universitas Sumatera Utara

28

a
b
Gambar 4.1.2.2 Zona Hambat pertumbuhan a bakteri Staphylococcus
aureus dan b bakteriEscherichia coli

a
b
Gambar 4.1.2.3 Zona Hambat Pertumbuhan a bakteri Staphylococcus
aureusdan b bakteriEscherichia coli
Tabel 4.1.2 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Buah Mengkudu
No

Spesies Bakteri

Konsentrasi

1

Escherichiacoli
(Gram Negatif)

100 mg/ml
200 mg/ml
300 mg/ml
400 mg/ml
500 mg/ml

2

Staphylococcus aureus
(Gram Positif)

100 mg/ml
200 mg/ml
300 mg/ml
400 mg/ml
500 mg/ml

Diameter
Zona Hambat
(mm)
1. 8,2
2. 8,70
3. 10,5
4. 11,35
5. 12

Indeks
Antimkrobial

1. 10
2. 10,65
3. 11,5
4. 12
5. 14

1. 0,67
2. 0,77
3. 0,95
4. 1
5. 1,83

1. 0,36
2. 0,45
3. 0,75
4. 0,89
5. 1

Universitas Sumatera Utara

29

16

Diameter Zona Bening (mm)

14
12
10
8
E Coli

6

S Aureus
4
2
0
100 mg/ml 200 mg/ml 300 mg/ml 400 mg/ml 500 mg/ml

Konsentrasi ekstrak mengkudu (mg/ml)

Gambar 4.1.2 Grafik Diameter Zona Bening Ekstrak Buah Mengkudu
4.2

Pembahasan

4.2.1

Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah Mengkudu

Berdasarkan tabel 4.1.1 menunjukan bahwa adanya penurunan absorbansi DPPH
dengan penambahan ekstrak buah mengkudu pada larutan DPPH dibandingkan
dari larutan blanko tanpa penambahan ekstrak buah mengkudu. Penurunan
absorbansi yang semakin besar menunjukan aktivitas antioksidan yang semakin
besar pula. Hal ini menunjukan adanya aktivitas antioksidan dalam rendaman
radikal bebas DPPH. Jika semua elektron pada DPPH menjadi berpasangan, maka
warna larutan berubah dari ungu tua menjadi kuning terang dan absorbansi pada
panjang gelombang maksimumnya akan hilang. Penurunan nilai absorbansi terjadi
karena larutan uji merendam DPPH dan rendaman terjadi karena adanya transfer
elektron atom hidrogen antioksidan kepada DPPH. DPPH merupakan suatu
molekul radikal bebas yang distabilkan oleh bentuk resonansi.

Universitas Sumatera Utara

30

Gambar 4.2.1. Reaksi Penangkapan Radikal Bebas DPPH oleh Antioksidan

Nilai IC50 diperoleh berdasarkan persamaan regresi linier yang didapatkan dengan
cara memplot konsentrasi larutan uji dan persen peredaman DPPH sebagai
parameter aktivitas antioksidan, dimana konsentrasi larutan uji (ppm) sebagai
basis (sumbu X) dan nilai persen peredaman sebagai ordinat (sumbu Y)
Hasil persamaan regresi linier yang diperoleh untuk ekstrak buah
mengkudu memiliki hasil analisis IC50 diperoleh 33,93 mg/ml.
Dari literatur dapat diketahui bahwa jika nilai IC 50 yang dihasilkan lebih
dari 100, maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan
yang Sangat Kuat.Tingkat kekuatan senyawa antioksidan menggunakan metode
DPPH dapat digolongkan sebagai berikut :
Tabel 4.2.1 Tingkatan Kekuatan Senyawa Antioksidan
No

Intensitas

Nilai IC50

1

Sangat kuat

< 50 mg/ml

2

kuat

50-100 mg/ml

3

Sedang

101-150 mg/ml

4

Lemah

>150 mg/ml

Universitas Sumatera Utara

31

4.2.2

Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Buah Mengkudu Dengan Metode

Kirby Baurer
Pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak buah mengkudu dapat dilihat tabel
4.1.2 terhadap bakteri staphylococcus aureus dan escherchia coli menunjukkan
hasil yang positif, ini ditandai dengan terbentuknya zona bening disekitar cakram.
Senyawa antimikroba dapat menyebabkan kerusakan sel bakteri dengan beberapa
cara. Secara umum mekanisme kerja antimikroba dalam menghambat mikroba
adalah : (1) bereaksi dengan membran sel, (2) inaktivasi enzim esensial, dan (3)
mendetstruksi atau mengaktivasi fungsi materi genetik. Dari ekstrak buah
mengkudu yang mengandung senyawa antimikroba yaitu senyawa Acubin,
Asperuloside, Alizarin dan beberapa zat Antraquinon yang telah terbukti sebagai
zat anti bakteri sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
Ekstrak buah mengkudu yang dihasilkan mampu menghambat fungsi
membran sel dimana membran sel dibatasi oleh sitoplasma yang berperan aktif
sebagai barier permeabilitas selektif, membawa fungsi transpor aktif, dan
mengontrol komposisi internal sel. Ketika fungsi integrasi membran sitoplasma
dirusak, maka makromolekul dan ion keluar dari sel, kemudian sel bakteri rusak.
Berdasarkan

Clinical

and

Laboratory

Standarts

Institute

(2012)

menyatakan bahwa batas daerah hambatan bakteri yaitu dengan diameter zona
hambatan ≥ 20 memiliki zona hambatan yang sangat efektif, antara 15 sampai 19
mm memiliki zona hambatan efektif, ≤ 14 memiliki zona hambatan kurang
efektif.
Hasil uji aktivitas antibakteri dari ekstrak buah mengkudu dalam
menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus Aureus dan Escherichia Coli
pada tabel 4.1.2 memperlihatkan bahwa ekstrak buah mengkudu memiliki
aktivitas antibakteri pada konsentrasi 500 mg/ml dengan zona hambat masing
masing 12 mm dan 14 mm dikategorikan kurang efektif terhadap bakteri
Staphylococcus Aureus dan Escherichia Coli. Diameter zona hambat terbentuk
memperlihatkan variasi zona. Perbedaan ini dapat dibedakan disebabkan oleh
beberapa faktor antara lain besarnya inokulum, waktu inkubasi, konsentrasi

Universitas Sumatera Utara

32

ekstrak, dan daya antibakteri zat berkhasiat. Makin besar inokulum maka semakin
kecil hambatnya sehingga semakin kecil zona yang terbentuk. Konsentrasi yang
mempengaruhi kecepatan difusi zat berkhasiat. Semakin besar konsentrasi ekstrak
semakin cepat difusi akibatnya semakin besar daya antibakteri dan makin luas
diameter zona hambat yang terbentuk (jawetz, 2005)
Dari hasil penelitian menunjukan bahwa ektrak buah mengkudu lebih
mudah menghambat pertumbuhan bakteri gram positif yaitu Staphylococcus
Aureusdibandingkan dengan bakteri gram negatifyaitu Escherichia Coli. hal ini
disebakan oleh perbedaan komposisi dan struktur dinding sel pada bakteri gram
positif dan gram negatif. Struktur dinding sel bakteri gram positif berlapis tunggal
dengan kandungan lipid yang rendah (1-4%), sedangkan bakteri gram negatif
memiliki kandungan lipid tinggi yaitu (11-12%) dan membran terluar terdiri dari 3
lapisan yaitu lipopolisakarida, lipoprotein, dan pospolipid (fardiaz, 1992)
Hal ini sesuai dengan kandungan ekstrak buah mengkudu yang memiliki
kandungan terpenoid dan senyawa Acubin, Asperuloside, Alizarin dan beberapa
zat Antraquinon telah terbukti sebagai zat anti bakteri. Sedangkan senyawa
terpenoid pada ekstrak buah mengkudu dapat menghambat pertumbuhan bakteri
dengan cara merusak membran sel bakteri, membran sel bakteri bertindak sebagi
pelindung dan mengontrol permukaan zat dengan lingkungannya. (jawetz et al,
2001)

Universitas Sumatera Utara

BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
1. Hasil uji aktivitas antibakteri dari ekstrak etanol buah mengkudu dalam
menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus Aureus dan Escherichia
Coli memperlihatkan bahwa ekstrak etanol buah mengkudu memiliki
aktivitas antibakteri pada konsentrasi 500 mg/ml dengan zona hambat
masing masing 12 mm dan 14 mm dikategorikan kurang efektif terhadap
bakteri Staphylococcus Aureus dan Escherichia Coli.
2. Hasil persamaan regresi linier yang diperoleh untuk ekstrak etanol buah
mengkudu memiliki hasil analisis IC50 diperoleh 33,93 mg/ml.Dari
literatur dapat diketahui bahwa jika nilai IC50 yang dihasilkan lebih dari
100, maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki aktivitas
antioksidan yang Sangat Kuat.

5.2

Saran
Perluh dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai uji antibakteri pada buah

mengkudu (Morinda Citrifolia) dengan beberapa jenis bakteri pathogen lainnya
dengan menggunakan konsentrasi yang berbeda pula.

Universitas Sumatera Utara