Uji Aktivitas Antibakteri Dari Hasil Hidrolisis Crude Palm Oil dan Palm Kernel Oil Chapter III V
BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini bersifat eksperimental yang meliputi penyiapan sampel,
hidrolisis sampel serta pengujian aktivitas antibakteri. Penelitian ini merupakan
proses hidrolisis trigliserida dari CPO dan PKO dengan menambahkan enzim
lipase sebagai katalisator pada suhu 40oC. Selanjanjutnya hasil hidrolisis dengan
bilangan asam tertinggi diuji aktivitas bakteri trehadap bakteri gram positif
(Staphylococcus epidermidis) dan gram negatif (Pseudomonas aeruginosa
Rancangan
penelitian
dilakukan
dengan
variasi
akuades
sebagai
agen
penghidrolisis dan waktu reaksi.
3.1 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium oleopangan Pengolahan Hasil dan
Mutu (PAHAM), Pusat Penelitian Kelapa Sawit Medan dan Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.2 Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai dari masa orientasi sampai selesai dimulai
mulai bulan Agustus 2016 sampai Maret 2017.
3.3 Alat dan Bahan
3.3.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah arloji, alat-alat gelas
laboratorium, autoklaf, desikator, hot plate, , jarum ose, jangka sorong, kamera
26
Universitas Sumatera Utara
digital, kertas perkamen, krus porselin, laminar air flow cabinet, lemari pendingin,
neraca listrik, oven, penangas air, pinset, pipet mikro, spatula, stirer, vial.
3.3.2 Bahan
Bahan kimia yang digunakan adalah bahan kimia yang bersifat pro analisis.
Bahan baku penelitian yang digunakan adalah akuades, Cruder Palm Oil (CPO),
enzim lipozime,
KOH, Palm Kernel Oil (PKO), Na2SO4 anhidrat, n-heksan,
fenolftalein, etanol, nutrient agar, nutrient broth.
3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi
3.4.1 Pereaksi KOH 0.1 N
Sebanyak 5.6 g kalium hidroksida ditimbang dan dilarutkan ke dalam
akuades secukupnya, kemudian dicukupkan dengan akuadest sampai volume 1000
ml (Depkes RI, 1995).
3.4.2 Pereaksi fenolftalein 1% (pereaksi pp)
Larutkan 318,33 g fenolftalein dalam etanol secukupnya, kemudian
cukupkan etanol sampai 1000 ml (Depkes, RI. 1995).
3.4.3 Pereaksi etanol netral
Masukkan etanol dalam erlenmeyer kemudian ditambahkan pereaksi pp 3
tetes kedalam etanol lalu dititrasi dengan pereaksi KOH sampai etanol berubah
warna menjadi pink jernih (AOCS, 2009).
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1 Hidrolisis Crude Palm Oil dan Palm Kernel Oil
Sejumlah 10 gram minyak ditimbang dalam labu alas bulat leher tiga,
kemudian ditambahkan 50 ml n-Heksan, 500 mg lipozyme serta akuades dengan
27
Universitas Sumatera Utara
variasi volume akuades 30 ml, 60 ml, 90 ml serta 120 ml. Campuran ini diaduk
dengan stirer menggunakan magnetik stirer dengan variasi lama pengandukkan 6,
12, 18 serta 24 jam pada suhu 40o C. Setelah masing-masing waktu hidrolisis
tercapai kemudian campuran dipindahkan ke corong pisah dan ditambahkan air
panas sampai enzim yang digunakan rusak. Penambahan air panas ini juga
menghasilkan dua lapisan.
Lapisan atas (fraksi n-heksan) dipisahkan sebagai filtrat I (ditampung
dalam erlenmeyer) dan lapisan bagian bawah dipisah sebagai filtrat II (dibuang).
kemudian ditambahkan 50 mg Na2SO4 anhidrat dan digoyangkan selama 15
menit. Selanjutnya diuapkan menggunakan alat rotary evaporator. Asam lemak
yang diperoleh digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri dan penentuan
bilangan asam.
3.5.2 Penentuan bilangan asam
Penentuan asam lemak bebas dilakukan dengan penentuan bilangan asam
yaitu minyak yang akan diuji ditimbang 1 gram di dalam erlenmeyer 20 ml,
kemudian ditambahan 20 ml alkohol netral 95% dan dipanaskan. Larutan ini
kemudian dititrasi dengan larutan KOH 0,1 N dengan indikator larutan
fenolftalein sampai larutan tepat terlihat berwarna merah jambu stabil selama
beberapa menit sebelum warnanya menghilang. Setelah itu dihitung bilangan
asam dan kadar asam dari minyak (AOCS, 2009).
Bilangan asam (acid value) = A x N x BM KOH
G
Keterangan : A = jumlah ml KOH untuk titrasi, N = normalitas larutan KOH,
G = Bobot minyak, BM KOH = 56,01
28
Universitas Sumatera Utara
3.6 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri disterilkan terlebih
dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas yang bersifat kuantitatif dan media
pertumbuhan bakteri disterilkan di otoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit dan
alat-alat gelas lainnya disterilkan didalam oven pada suhu 170oC selama 1 jam.
Jarum ose dan pinset disterilkan dengan menggunakan api bunsen (Ditjen POM,
1995).
3.7 Pembuatan Media
3.7.1 Media nutrient agar
Komposisi:
− Lab-lemco powder 1 g
− Yeast extract 2g
− Peptone 5 g
− Sodium chloride 5 g
− Agar 15 g
Cara Pembuatan:
Sebanyak 28 g media nutrient agar (NA) yang sudah jadi ditimbang,
disuspensikan ke dalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut
sempurna. Media kemudian dimasukkan dalam labu dan disterilkan di dalam
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Oxoid, 1982).
3.7.2 Media nutrient broth
Komposisi:
− Lab-lemco powder 1 g
− Yeast extract 2 g
29
Universitas Sumatera Utara
− Peptone 5 g
− Sodium chloride 5 g
Cara Pembuatan:
Sebanyak 13 g media nutrient broth (NB) yang sudah jadi ditimbang,
disuspensikan ke dalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut
sempurna. Media kemudian dimasukkan dalam labu dan disterilkan di dalam
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Oxoid, 1982).
3.7.3 Pembuatan Agar Miring
Ke dalam tabung reaksi steril dimasukkan 5 ml media NA steril, didiamkan
pada temperatur kamar sampai sediaan memadat pada posisi miring kira-kira
45oC. Media kemudian disimpan dalam lemari pendingin (Ditjen POM, 1995).
3.8. Peremajaan Bakteri
Satu koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan menggunakan jarum
ose steril, lalu ditanam pada media NA miring dengan cara menggores. Kemudian
diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36-37oC selama 24 jam (Ditjen POM,
1995).
3.9. Penyiapan Inokulum Bakteri
Koloni bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa
diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril, lalu disuspensikan dalam tabung
reaksi yang berisi 10 ml larutan nutrient broth (NB), diinkubasi sampai didapat
kekeruhan yang sama dengan larutan Standar Mc.Farland No.0,5, berarti
konsentrasi bakteri adalah 108 CFU/ml. Kemudian dilakukan pengenceran
suspensi bakteri dengan memipet 0,1 ml inokulum bakteri dimasukkan ke dalam
30
Universitas Sumatera Utara
tabung reaksi yang telah berisi larutan nutrient broth (NB) sebanyak 9,9 ml dan
dihomogenkan sehingga konsentrasi suspensi bakteri sama dengan 106 CFU/ml.
(Difco and BBL Manual, 2009).
3.10.
Pembuatan Bahan Uji
Bahan uji dibuat dalam konsentrasi 100%, 75%, 50%, dan 25% (v/v)
dengan menggunakan en-heksan sebagai pelarut. Sejumlah bahan uji diukur
volumenya sesuai konsentrasi, dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml, kemudian
dicukupkan dengan etanol hingga garis tanda, kemudian dikocok hingga homogen
(Loung, 2014).
3.11.
Pengujian Antibakteri
Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri dicampur homogen dengan 15-20 ml
nutrient agar dicawan petri, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Pada
media yang telah padat ditanam pencadang kertas yang sebelumnya telah
direndam dalam bahan uji selama 15 menit. Kultur kemudian diikubasi pada suhu
36-37oC selama 18-24 jam untuk Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas
aeruginosae. Diameter daerah bening di sekitar pencadang diukur menggunakan
jangka sorong. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali terhadap asam lemak bebas
hasil hidrolisis minyak kelapa sawit dan minyak inti sawit (Ditjen POM, 1995;
Ugbogu et al., 2006 dan Muthezhilan, 2012).
31
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Hidrolisis Crude Palm Oil dan Palm Kernel Oil
Crude Palm Oil (CPO) dan Palm Kernel Oil (PKO) dihidrolisis dengan
menggunakan enzim lipase dengan variasi akuades 30, 60, 90, dan 120 ml (dapat
dilihat pada Lampiran 2 dan Lampiran 3), dan pengamatan dilakukan dengan
menghitung bilangan asamnya pada waktu 6, 12, 18 dan 24 jam. Menurut Puguh
(2012), bahwa kenaikan jumlah air dan semakin lama waktu hidrolisis dapat
mengeser konversi reaksi ke arah pembentukan asam lemak bebas. Pergeseran
konversi reaksi ini meningkatkan jumlah asam lemak bebas yang dihasilkan pada
proses hidrolisis CPO dan PKO.
Proses hidrolisis membutuhkan katalis untuk membantu mempercepat
reaksi. Pada penelitian ini, katalis yang digunakan yaitu enzim lipase. Prinsip pada
reaksi hidrolisis mengunakan enzim lipase yaitu, dengan memecah rantai
poliunsaturated dan polisaturated menjadi asam lemak bebas monosaturated dan
monounsaturated (Aehle, 2004). Banyaknya jumlah asam lemak bebas yang
terbentuk dapat dinyatakan dalam bilangan asam.
Bilangan asam merupakan ukuran dari jumlah asam lemak bebas yang
terkandung dalam minyak atau lemak. Bilangan asam dinyatakan sebagai jumlah
milligram basa (NaOH atau KOH) yang digunakan untuk menetralkan asam
lemak bebas yang terdapat dalam 1 gram minyak atau lemak (Loung, 2014).
Semakin tinggi nilai bilangan asam yang dihasilkan menunjukkan semakin
banyak asam lemak bebas yang terbentuk dalam lemak dan minyak (CPO dan
PKO) baik sebelum proses hidrolisis dan setelah proses hidrolisis.
32
Universitas Sumatera Utara
Data hasil perhitungan bilangan asam dapat dilihat pada Tabel 4.1
sedangkan uraian bilangan asam dari CPO dan PKO dapat dilihat pada Lampiran
7 halaman 58 dan Lampiran 8 halaman 59.
Tabel 4.1 Hasil uji bilangan asam dan waktu hidrolisis pada CPO dan PKO.
Sampel
Volume
akuades
(ml)
Non Hidrolisis
Hidrolisis
30
60
90
120
Waktu
hidrolisis
(Jam)
Rata-rata bilangan asam
n=2
(mg KOH/gram minyak)
CPO
1,4185
133,1063
160,8920
173,5322
186,8268
136,4012
161,6137
180,2387
196,7484
155,7675
165,2389
192,2351
199,6255
158,7629
168,4913
194,4038
204,6275
6
12
18
24
6
12
18
24
6
12
18
24
6
12
18
24
PKO
1,4156
142,7126
178,1355
211,5449
220,1475
174,8958
195,046
211,6708
223,9731
195,7820
214,1330
222,5827
230,4333
196,0207
212,9387
227,0898
246,8405
Berdasarkan hasil hidrolisis pada CPO dan PKO dengan volume akuades
30 ml dengan waktu pengadukan 6, 12, 18 dan 24 jam menghasilkan bilangan
asam tertinggi pada hasil hidrolisis CPO dengan waktu hidrolisis selama 24 jam,
yaitu 186,8268 mg KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO
menghasilkan bilangan asam tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 220, 1475 mg
KOH/gram minyak.
Pada hasil hidrolisis pada CPO dan PKO dengan volume akuades 60 ml
dengan waktu pengadukan yang sama menghasilkan bilangan asam tertinggi pada
hasil hidrolisis CPO dengan waktu hidrolisis selama 24 jam, yaitu 196,7484 mg
33
Universitas Sumatera Utara
KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO menghasilkan bilangan asam
tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 223,973 mg KOH/gram minyak.
Pada hasil hidrolisis pada CPO dan PKO dengan volume akuades 90 ml
dengan waktu pengadukan yang sama menghasilkan bilangan asam tertinggi pada
hasil hidrolisis CPO dengan waktu hidrolisis selama 24 jam, yaitu 199,6255 mg
KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO menghasilkan bilangan asam
tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 230,4333 mg KOH/gram minyak.
Pada hasil hidrolisis pada CPO dan PKO dengan volume akuades 120 ml
dengan waktu pengadukan yang sama menghasilkan bilangan asam tertinggi pada
hasil hidrolisis CPO dengan waktu hidrolisis selama 24 jam, yaitu 204,6275 mg
KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO menghasilkan bilangan asam
tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 246,8405 mg KOH/gram minyak.
Bilangan asam tertinggi dihasilkan pada sampel CPO dan PKO pada
volume akuades 120 ml dengan menggunakan enzim pada waktu hidrolisis yang
dibutuhkan selama 24 jam yaitu pada CPO 204,6275 mg KOH/gram minyak dan
pada PKO 246,8405 mg KOH/gram minyak. Hal itu sesuai dengan peningkatan
hasil hidrolisis (asam lemak bebas) dimana volume akuades terbesar 120 ml dan
waktu hidrolisis yang dibutuhkan selama 24 jam (Puguh, 2012). Penambahan
enzim juga sangat mempengaruhi peningkatan asam lemak bebas dengan
membentuk ikatan komplek terhadap CPO dan PKO (enzim-substrat) meskipun
enzim tidak ikut serta dalam reaksi dan mengalami perubahan fisik. Jumlah enzim
yang diberikan terhadap jumlah sampel (substrat) membuktikan bahwa enzim
yang diberikan telah cukup. Hal ini ditunjukkan adanya peningkatan jumlah asam
lemak bebas yang terjadi selama terjadinya proses hidrolisis menggunakan enzim
sebagai katalis (Barlianti, et al., 2015).
34
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.1 Hasil uji bilangan asam terhadap waktu hidrolisis secara enzimatik
Pada CPO
Gambar 4.2 Hasl uji bilangan asam terhadap waktu hidrolisis secara enzimatik
pada PKO
Pada proses hidrolisis ini, asam lemak bebas yang didapat lebih tinggi
(dapat dilihat pada Gambar 4.1 dan Gambar 4.2) dibandingkan virgin coconut oil
(VCO), minyak kedelai dan minyak kelapa dalam bentuk bilangan asam berturutturut adalah 148,1 mg KOH/g, 146,9 mg KOH/g and, 147,6 mg KOH/g (Silalahi,
et al., 2014) dengan bilangan asam terkecil yang dihasilkan untuk CPO dan PKO
yaitu 133,1063 mg KOH/gram minyak dan 142,7126 mg KOH/gram minyak pada
waktu 6 jam dan bilangan asam yang tertinggi yang dihasilkan CPO dan PKO
adalah 204,6275 mg KOH/gram minyak dan mg KOH/gram minyak.
35
Universitas Sumatera Utara
4.2 Pengujian Aktivitas Antibakteri Crude Palm Oil
Aktifitas antibakteri dari asam lemak bebas hasil dari hidrolisis Crude
Palm Oil (CPO) terhadap Gram positif (Staphylococcus epidermidis) dan Gram
negatif (Pseudomonas aeruginosa) dapat dilihat pada Lampiran 9 dan Lampiran
10 serta zona hambatnya dapat dilihat pada Tabel 4.2; 4.3; 4.4 dan 4.5.
Tabel 4.2 Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 30 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
CPO
0
25
50
75
100
Rata-rata SD zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
7,25
8,3
7,6
Berdasarkan hasil pengukuran yang terlihat pada Tabel 4.2, bahwa kadar
minyak yang dapat memenuhi persyaratan yang ditetapkan oleh Ditjen POM RI
(1995), adalah konsentrasi zat dengan zona hambatan yang efektif lebih kurang
14-16 mm. Berdasarkan hasil penelitian diatas didapatkan bahwa asam lemak
bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam dengan volume akuades 30 ml
tidak
efektif
sebagai
antibakteri
terhadap
bakteri
Gram
positif
yaitu
Staphylococcus epidermidis dan bakteri Gram negatif yaitu Pseudomonas
aeruginosa karena zona hambat yang dihasilkan asam lemak bebas tersebut lebih
kecil dari syarat yang telah ditetapkan yaitu 14 mm.
Hal tersebut ditunjukkan dengan diameter zona hambat terbesar yang
dihasilkan pada kadar minyak 100 ml/100 ml sebesar 8,3 mm untuk bakteri
Staphylococcus epidermidis dan 7,6 mm untuk bakteri Pseudomonas aeruginosa
lebih kecil dari 14 mm.
36
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.3 Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 60 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
CPO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
7,6
7,35
8,725
8,3
Berdasarkan hasil pengukuran yang dapat dilihat pada Tabel 4.3, diameter
zona hambat dari asam lemak bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam
dengan volume akuades 60 ml memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang
terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan
Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan
zona hambat yang dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 8,725
mm dan zona hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 8,3 mm
Hasil pengukuran diameter zona hambat dari asam lemak tersebut terhadap
bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa tidak efektif
sebagai antibakteri karena zona hambat terbesar yang dihasilkan dari asam lemak
bebas tersebut lebih kecil dari 14 mm.
Tabel 4.4 Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 90 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
CPO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
7,85
8,75
11,65
7,8
9,85
37
Universitas Sumatera Utara
Berdasarkan hasil pengukuran yang dapat dilihat pada Tabel 4.4, diameter
zona hambat dari asam lemak bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam
dengan volume akuades 90 ml memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang
terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan
Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan
zona hambat yang dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 11,65
mm dan zona hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 9,85 mm
Hasil pengukuran diameter zona hambat dari asam lemak tersebut terhadap
bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa tidak efektif
sebagai antibakteri karena zona hambat terbesar yang dihasilkan dari asam lemak
bebas tersebut lebih kecil dari 14 mm.
Tabel 4.5 Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 120 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
CPO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
7,9
7,4
8,6
7,75
11,8
10,75
Berdasarkan hasil pengukuran yang dapat dilihat pada Tabel 4.5, diameter
zona hambatan pada asam lemak bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam
dengan volume akuades 120 ml memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang
terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan
Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan
zona hambat yang dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 11,8
mm dan zona hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 10,75 mm
38
Universitas Sumatera Utara
tetapi hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa kurang dari 14 mm sehingga tidak
efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri tersebut. Hasilnya dapat dilihat pada
Gambar 4.3 dan Gambar 4.4.
Gambar 4.3 Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari asam lemak bebas CPO
terhadap Staphylococcus epidermidis
Gambar 4.4 Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari asam lemak bebas CPO
Pseudomonas aeruginosa
Bakteri memiliki membran sel yang tersusun dari fosfolipid berlapis ganda
dan protein yang berbentuk mosaik (Pratiwi, 2008). Membran sel ini yang
berfungsi sebagai sawar selektif untuk keluar masuknya senyawa kimia dari luar
dan dalam sel (Radji, 2009). Materi yang melewati membran sel terbagi atas
kelompok makromolekul dan mikromolekul yang kemudian dipecah sebagai
nutrisi serta energy bagi bakteri (Pratiwi, 2008).
39
Universitas Sumatera Utara
Struktur ampifatik pada asam lemak bebas yang memberikan sifat detergen
mengakibatkan rusaknya membran sel pada sel bakteri sehingga menyebabkan
asam lemak bebas dapat memasuki bagian dalam sel bakteri. Asam lemak yang
memasuki bagian dalam sel bakteri meyebabkan penghambatan pertumbuhan
bakteri atau kematian sel bakteri. Tetapi dengan adanya karoten dan sterol
menyebabkan menurunkan kerusakan membran sel pada bakteri. Hal ini
menyebabkan turunnya aktivitas antibakteri yang dihasilkan oleh asam lemak
bebas yang dihasilkan dari hasil hidrolisis CPO. Hal itu disebabkan karena adanya
kandungan karotenoid didalam CPO. Karotenoid dalam CPO menyebabkan
stabilnya membran sel dengan menurunkan fluiditasnya pada sel bakteri. Dengan
demikian, karotenoid dapat melawan efek produk degradasi asam lemak bebas
yang reaktif atau peningkatan fluiditas membran (Chamberlain, et al 1991.).
Begitu juga dengan sterol pada CPO yang dapat menstabilkan membran sel
sehingga dapat menurunkan kerentanan asam lemak bebas pada sel bakteri
(Debois, et al., 2010).
Pada saat karotenoid dan sterol menstabilkan membran sel pada bakteri,
bagian dalam, bakteri pada saat yang sama mengatur ekspresi gen yang berperan
dalam mengkodekan protein yang terlibat dalam sintesis dinding sel saat terpapar
asam lemak bebas yang berfungsi sebagai pembentuk dinding sel yang lebih tebal
sehingga lebih sulit bagi asam lemak bebas untuk menembus dan merusak
membran sel pada bakteri (Kenny et al., 2009). Selanjutnya, material dinding
tambahan membuat permukaan sel lebih bermuatan tinggi dan dengan demikian
kurang hidrofobik. Oleh karena itu, asam lemak bebas bebas kurang tertarik pada
sel dan cenderung tidak masuk ke dalam membran dalam (Clarke, et al., 2007;
Kenny et al., 2009).
40
Universitas Sumatera Utara
4.3 Pengujian Aktivitas Antibakteri Palm Kernel Oil
Palm Kernel Oil (PKO) Aktifitas antibakteri dari asam lemak bebas hasil
PKO hidrolisis terhadap Gram positif (Staphylococcus epidermidis) dan Gram
negatif (Pseudomonas aeruginosa) dapat dilihat pada Lampiran11 dan Lampiran
12 serta zona hambatnya dapat dilihat pada Tabel 4.6; 4.7; 4.8 dan 4.9.
Tabel 4.6 Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 30 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
PKO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
7,7
11,85
13,115
17,65
7,8
9,3
11,6
14,5
Berdasarkan hasil pengukuran yang terlihat pada Tabel 4.6, bahwa kadar
minyak yang dapat memenuhi persyaratan yang ditetapkan oleh Ditjen POM RI
(1995), adalah konsentrasi zat dengan batas diameter daerah hambatan yang
efektif lebih kurang 14-16 mm. Berdasarkan hasil penelitian diatas didapatkan
bahwa asam lemak bebas hasil dari hidrolisis PKO selama 24 jam dengan volume
akuades 30 ml efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri Gram positif yaitu
Staphylococcus epidermidis dan bakteri Gram negatif yaitu Pseudomonas
aeruginosa karena zona hambat yang dihasilkan asam lemak bebas tersebut lebih
besar dari syarat yang telah ditetapkan yaitu 14 mm.
Hal tersebut ditunjukkan dengan diameter zona hambat terbesar yang
dihasilkan pada kadar minyak 100 ml/100 ml sebesar 17,65 mm untuk bakteri
Staphylococcus epidermidis dan 14,5 mm
untuk bakteri Pseudomonas
aeruginosa.
41
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.7 Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 60 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
PKO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
10,75
13,225
15,8
18,4
8,3
12,235
14,425
17,95
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambatan pada asam lemak
bebas PKO hasil hidrolisis selama 24 jam dengan volume akuades 60 ml bahwa
aktivitas antibakteri yang terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri
Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100
ml. Hal itu ditunjukkan dengan zona hambat yang dihasilkan pada bakteri
Staphylococcus epidermidis yaitu 18,4 mm dan zona hambat pada bakteri
Pseudomonas aeruginosa yaitu 17,95 mm.
Hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada asam lemak bebas tersebut efektif
sebagai
antibakteri
terhadap
bakteri
Staphylococcus
epidermidis
dan
Pseudomonas aeruginosa.
Tabel 4.8 Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 90 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
PKO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
12,65
10,425
13,45
13,115
16,115
16,25
19,325
18,95
42
Universitas Sumatera Utara
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambatan pada asam lemak
bebas bebas PKO hasil hidrolisis selama 24 jam dengan volume akuades 90 ml
memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang terkuat dalam menghambat
pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa
pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan zona hambat yang
dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 18,4 mm dan zona
hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 17,95 mm.
Hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada asam lemak bebas bebas hasil
hidrolisis selama 24 jam dengan volume akuades 90 ml menunjukkan bahwa asam
lemak bebas tersebut efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa.
Tabel 4.9 Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 120 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
PKO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. epidermidis
P. aeruginosa
15,4
12,8
17,1
14,725
18,6
17,35
21,9
19,75
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambatan pada asam lemak
bebas PKO hasil hidrolisis selama 24 jam dengan volume akuades 120 ml
memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang terkuat dalam menghambat
pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa
pada kadar 100 ml/100 ml.
Hal itu ditunjukkan dengan zona hambat yang
dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 19,325 mm dan zona
hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 18,95 mm.
43
Universitas Sumatera Utara
Hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada asam lemak bebas hasil hidrolisis
selama 24 jam dengan volume akuades 120 ml menunjukkan bahwa asam lemak
bebas tersebut efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa.
Peningkatan diameter zona hambat pada aktifitas antibakteri dari asam
lemak bebas hasil hidrolisis PKO menunjukkan bahwa peningkatan asam lemak
bebas bebas berbanding lurus dengan peningkatan aktifitas antibakteri baik pada
bakteri gram positif (Staphylococcus epidermidis) dan bakteri gram negatif
(Pseudomonas aeruginosa). Karena struktur amfipatik pada asam lemak bebas
dapat dikaitkan dengan sifat detergen. Struktur tersebut dapat mengakibatkan
asam lemak bebas untuk berinteraksi dengan membran sel untuk membuat poripori transien atau permanen dengan ukuran variabel. Pada konsentrasi yang lebih
tinggi, deterjen dapat melarutkan membran sehingga berbagai protein membran
atau bagian yang lebih besar dari lapisan ganda lipid dilepaskan. Proses kunci
yang terletak pada membran yang dipengaruhi oleh asam lemak bebas adalah
produksi energi yang disebabkan oleh gangguan pada rantai transpor elektron dan
terganggunya fosforilasi oksidatif. Proses lain yang dapat menyebabkan
penghambatan pertumbuhan bakteri atau kematian meliputi pemecahan sel,
penghambatan aktivitas enzim, penurunan serapan hara dan pembentukan
peroksidasi racun dan produk autooksidasi. Asam lemak bebas dapat membunuh
bakteri secara langsung (tindakan bakterisida) atau menghambat pertumbuhannya
(tindakan bakteriostatik), yang reversibel dan berarti bahwa bakteri tetap bertahan
tetapi tidak dapat mengalami pembelahan sel (Debois, et al., 2010). Hasilnya
dapat dilihat pada Gambar4.3 dan Gambar 4.4.
44
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.3 Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari asam lemak bebas PKO
terhadap Staphylococcus epidermidis
Gambar 4.4 Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari asam lemak bebas PKO
terhadap Pseudomonas aeruginosa
45
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN
4.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil hidrolisis Crude Palm Oil (CPO) dan Palm Kernel Oil
(PKO) dengan enzim lipase diperoleh;
a. Volume akuades untuk hidrolisis CPO dan PKO adalah 120 ml dan waktu
optimum adalah 24 jam.
b. Bilangan asam paling besar yang dihasilkan CPO dan PKO adalah 204, 6275
mg KOH/gram minyak dan bilangan asam tertinggi yang dihasilkan PKO
adalah 246,8405 mg KOH/gram minyak.
c. CPO dan PKO memiliki aktivitas antibakteri terhadap gram positif
(Staphylococcus epidermidis) dan gram negatif (Pseudomonas aeruginosa)
tetapi aktivitas antibakteri lebih baik ditunjukkan terhadap gram positif
(Staphylococcus epidermidis)
d. PKO memiliki potensi antibakteri lebih baik daripada CP,. zona hambat yang
untuk PKO pada bakteri Staphylococcus epidermidis (21,9 mm) dan
Pseudomonas aeruginosa (19,75mm) lebih besar daripada zona hambat yang
dihasilkan CPO Staphylococcus epidermidis (11,8 mm) dan Pseudomonas
aeruginosa (10,75 mm).
4.2 Saran
Disarankan kepada peneliti selanjutnya agar dapat melakukan penelitian
terhadap pengaruh asam lemak bebas hasil hidrolisis CPO dan PKO serta aktivitas
antibakterinya dengan perbedaan nutrisi terhadap tanaman kelapa sawit..
46
Universitas Sumatera Utara
METODE PENELITIAN
Penelitian ini bersifat eksperimental yang meliputi penyiapan sampel,
hidrolisis sampel serta pengujian aktivitas antibakteri. Penelitian ini merupakan
proses hidrolisis trigliserida dari CPO dan PKO dengan menambahkan enzim
lipase sebagai katalisator pada suhu 40oC. Selanjanjutnya hasil hidrolisis dengan
bilangan asam tertinggi diuji aktivitas bakteri trehadap bakteri gram positif
(Staphylococcus epidermidis) dan gram negatif (Pseudomonas aeruginosa
Rancangan
penelitian
dilakukan
dengan
variasi
akuades
sebagai
agen
penghidrolisis dan waktu reaksi.
3.1 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium oleopangan Pengolahan Hasil dan
Mutu (PAHAM), Pusat Penelitian Kelapa Sawit Medan dan Laboratorium
Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3.2 Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai dari masa orientasi sampai selesai dimulai
mulai bulan Agustus 2016 sampai Maret 2017.
3.3 Alat dan Bahan
3.3.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah arloji, alat-alat gelas
laboratorium, autoklaf, desikator, hot plate, , jarum ose, jangka sorong, kamera
26
Universitas Sumatera Utara
digital, kertas perkamen, krus porselin, laminar air flow cabinet, lemari pendingin,
neraca listrik, oven, penangas air, pinset, pipet mikro, spatula, stirer, vial.
3.3.2 Bahan
Bahan kimia yang digunakan adalah bahan kimia yang bersifat pro analisis.
Bahan baku penelitian yang digunakan adalah akuades, Cruder Palm Oil (CPO),
enzim lipozime,
KOH, Palm Kernel Oil (PKO), Na2SO4 anhidrat, n-heksan,
fenolftalein, etanol, nutrient agar, nutrient broth.
3.4 Pembuatan Larutan Pereaksi
3.4.1 Pereaksi KOH 0.1 N
Sebanyak 5.6 g kalium hidroksida ditimbang dan dilarutkan ke dalam
akuades secukupnya, kemudian dicukupkan dengan akuadest sampai volume 1000
ml (Depkes RI, 1995).
3.4.2 Pereaksi fenolftalein 1% (pereaksi pp)
Larutkan 318,33 g fenolftalein dalam etanol secukupnya, kemudian
cukupkan etanol sampai 1000 ml (Depkes, RI. 1995).
3.4.3 Pereaksi etanol netral
Masukkan etanol dalam erlenmeyer kemudian ditambahkan pereaksi pp 3
tetes kedalam etanol lalu dititrasi dengan pereaksi KOH sampai etanol berubah
warna menjadi pink jernih (AOCS, 2009).
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1 Hidrolisis Crude Palm Oil dan Palm Kernel Oil
Sejumlah 10 gram minyak ditimbang dalam labu alas bulat leher tiga,
kemudian ditambahkan 50 ml n-Heksan, 500 mg lipozyme serta akuades dengan
27
Universitas Sumatera Utara
variasi volume akuades 30 ml, 60 ml, 90 ml serta 120 ml. Campuran ini diaduk
dengan stirer menggunakan magnetik stirer dengan variasi lama pengandukkan 6,
12, 18 serta 24 jam pada suhu 40o C. Setelah masing-masing waktu hidrolisis
tercapai kemudian campuran dipindahkan ke corong pisah dan ditambahkan air
panas sampai enzim yang digunakan rusak. Penambahan air panas ini juga
menghasilkan dua lapisan.
Lapisan atas (fraksi n-heksan) dipisahkan sebagai filtrat I (ditampung
dalam erlenmeyer) dan lapisan bagian bawah dipisah sebagai filtrat II (dibuang).
kemudian ditambahkan 50 mg Na2SO4 anhidrat dan digoyangkan selama 15
menit. Selanjutnya diuapkan menggunakan alat rotary evaporator. Asam lemak
yang diperoleh digunakan dalam pengujian aktivitas antibakteri dan penentuan
bilangan asam.
3.5.2 Penentuan bilangan asam
Penentuan asam lemak bebas dilakukan dengan penentuan bilangan asam
yaitu minyak yang akan diuji ditimbang 1 gram di dalam erlenmeyer 20 ml,
kemudian ditambahan 20 ml alkohol netral 95% dan dipanaskan. Larutan ini
kemudian dititrasi dengan larutan KOH 0,1 N dengan indikator larutan
fenolftalein sampai larutan tepat terlihat berwarna merah jambu stabil selama
beberapa menit sebelum warnanya menghilang. Setelah itu dihitung bilangan
asam dan kadar asam dari minyak (AOCS, 2009).
Bilangan asam (acid value) = A x N x BM KOH
G
Keterangan : A = jumlah ml KOH untuk titrasi, N = normalitas larutan KOH,
G = Bobot minyak, BM KOH = 56,01
28
Universitas Sumatera Utara
3.6 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri disterilkan terlebih
dahulu sebelum dipakai. Alat-alat gelas yang bersifat kuantitatif dan media
pertumbuhan bakteri disterilkan di otoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit dan
alat-alat gelas lainnya disterilkan didalam oven pada suhu 170oC selama 1 jam.
Jarum ose dan pinset disterilkan dengan menggunakan api bunsen (Ditjen POM,
1995).
3.7 Pembuatan Media
3.7.1 Media nutrient agar
Komposisi:
− Lab-lemco powder 1 g
− Yeast extract 2g
− Peptone 5 g
− Sodium chloride 5 g
− Agar 15 g
Cara Pembuatan:
Sebanyak 28 g media nutrient agar (NA) yang sudah jadi ditimbang,
disuspensikan ke dalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut
sempurna. Media kemudian dimasukkan dalam labu dan disterilkan di dalam
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Oxoid, 1982).
3.7.2 Media nutrient broth
Komposisi:
− Lab-lemco powder 1 g
− Yeast extract 2 g
29
Universitas Sumatera Utara
− Peptone 5 g
− Sodium chloride 5 g
Cara Pembuatan:
Sebanyak 13 g media nutrient broth (NB) yang sudah jadi ditimbang,
disuspensikan ke dalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai larut
sempurna. Media kemudian dimasukkan dalam labu dan disterilkan di dalam
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit (Oxoid, 1982).
3.7.3 Pembuatan Agar Miring
Ke dalam tabung reaksi steril dimasukkan 5 ml media NA steril, didiamkan
pada temperatur kamar sampai sediaan memadat pada posisi miring kira-kira
45oC. Media kemudian disimpan dalam lemari pendingin (Ditjen POM, 1995).
3.8. Peremajaan Bakteri
Satu koloni bakteri diambil dari stok kultur dengan menggunakan jarum
ose steril, lalu ditanam pada media NA miring dengan cara menggores. Kemudian
diinkubasi dalam inkubator pada suhu 36-37oC selama 24 jam (Ditjen POM,
1995).
3.9. Penyiapan Inokulum Bakteri
Koloni bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa
diambil dari stok kultur dengan jarum ose steril, lalu disuspensikan dalam tabung
reaksi yang berisi 10 ml larutan nutrient broth (NB), diinkubasi sampai didapat
kekeruhan yang sama dengan larutan Standar Mc.Farland No.0,5, berarti
konsentrasi bakteri adalah 108 CFU/ml. Kemudian dilakukan pengenceran
suspensi bakteri dengan memipet 0,1 ml inokulum bakteri dimasukkan ke dalam
30
Universitas Sumatera Utara
tabung reaksi yang telah berisi larutan nutrient broth (NB) sebanyak 9,9 ml dan
dihomogenkan sehingga konsentrasi suspensi bakteri sama dengan 106 CFU/ml.
(Difco and BBL Manual, 2009).
3.10.
Pembuatan Bahan Uji
Bahan uji dibuat dalam konsentrasi 100%, 75%, 50%, dan 25% (v/v)
dengan menggunakan en-heksan sebagai pelarut. Sejumlah bahan uji diukur
volumenya sesuai konsentrasi, dimasukkan dalam labu tentukur 10 ml, kemudian
dicukupkan dengan etanol hingga garis tanda, kemudian dikocok hingga homogen
(Loung, 2014).
3.11.
Pengujian Antibakteri
Sebanyak 0,1 ml inokulum bakteri dicampur homogen dengan 15-20 ml
nutrient agar dicawan petri, kemudian dibiarkan sampai media memadat. Pada
media yang telah padat ditanam pencadang kertas yang sebelumnya telah
direndam dalam bahan uji selama 15 menit. Kultur kemudian diikubasi pada suhu
36-37oC selama 18-24 jam untuk Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas
aeruginosae. Diameter daerah bening di sekitar pencadang diukur menggunakan
jangka sorong. Pengujian dilakukan sebanyak 3 kali terhadap asam lemak bebas
hasil hidrolisis minyak kelapa sawit dan minyak inti sawit (Ditjen POM, 1995;
Ugbogu et al., 2006 dan Muthezhilan, 2012).
31
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Hidrolisis Crude Palm Oil dan Palm Kernel Oil
Crude Palm Oil (CPO) dan Palm Kernel Oil (PKO) dihidrolisis dengan
menggunakan enzim lipase dengan variasi akuades 30, 60, 90, dan 120 ml (dapat
dilihat pada Lampiran 2 dan Lampiran 3), dan pengamatan dilakukan dengan
menghitung bilangan asamnya pada waktu 6, 12, 18 dan 24 jam. Menurut Puguh
(2012), bahwa kenaikan jumlah air dan semakin lama waktu hidrolisis dapat
mengeser konversi reaksi ke arah pembentukan asam lemak bebas. Pergeseran
konversi reaksi ini meningkatkan jumlah asam lemak bebas yang dihasilkan pada
proses hidrolisis CPO dan PKO.
Proses hidrolisis membutuhkan katalis untuk membantu mempercepat
reaksi. Pada penelitian ini, katalis yang digunakan yaitu enzim lipase. Prinsip pada
reaksi hidrolisis mengunakan enzim lipase yaitu, dengan memecah rantai
poliunsaturated dan polisaturated menjadi asam lemak bebas monosaturated dan
monounsaturated (Aehle, 2004). Banyaknya jumlah asam lemak bebas yang
terbentuk dapat dinyatakan dalam bilangan asam.
Bilangan asam merupakan ukuran dari jumlah asam lemak bebas yang
terkandung dalam minyak atau lemak. Bilangan asam dinyatakan sebagai jumlah
milligram basa (NaOH atau KOH) yang digunakan untuk menetralkan asam
lemak bebas yang terdapat dalam 1 gram minyak atau lemak (Loung, 2014).
Semakin tinggi nilai bilangan asam yang dihasilkan menunjukkan semakin
banyak asam lemak bebas yang terbentuk dalam lemak dan minyak (CPO dan
PKO) baik sebelum proses hidrolisis dan setelah proses hidrolisis.
32
Universitas Sumatera Utara
Data hasil perhitungan bilangan asam dapat dilihat pada Tabel 4.1
sedangkan uraian bilangan asam dari CPO dan PKO dapat dilihat pada Lampiran
7 halaman 58 dan Lampiran 8 halaman 59.
Tabel 4.1 Hasil uji bilangan asam dan waktu hidrolisis pada CPO dan PKO.
Sampel
Volume
akuades
(ml)
Non Hidrolisis
Hidrolisis
30
60
90
120
Waktu
hidrolisis
(Jam)
Rata-rata bilangan asam
n=2
(mg KOH/gram minyak)
CPO
1,4185
133,1063
160,8920
173,5322
186,8268
136,4012
161,6137
180,2387
196,7484
155,7675
165,2389
192,2351
199,6255
158,7629
168,4913
194,4038
204,6275
6
12
18
24
6
12
18
24
6
12
18
24
6
12
18
24
PKO
1,4156
142,7126
178,1355
211,5449
220,1475
174,8958
195,046
211,6708
223,9731
195,7820
214,1330
222,5827
230,4333
196,0207
212,9387
227,0898
246,8405
Berdasarkan hasil hidrolisis pada CPO dan PKO dengan volume akuades
30 ml dengan waktu pengadukan 6, 12, 18 dan 24 jam menghasilkan bilangan
asam tertinggi pada hasil hidrolisis CPO dengan waktu hidrolisis selama 24 jam,
yaitu 186,8268 mg KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO
menghasilkan bilangan asam tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 220, 1475 mg
KOH/gram minyak.
Pada hasil hidrolisis pada CPO dan PKO dengan volume akuades 60 ml
dengan waktu pengadukan yang sama menghasilkan bilangan asam tertinggi pada
hasil hidrolisis CPO dengan waktu hidrolisis selama 24 jam, yaitu 196,7484 mg
33
Universitas Sumatera Utara
KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO menghasilkan bilangan asam
tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 223,973 mg KOH/gram minyak.
Pada hasil hidrolisis pada CPO dan PKO dengan volume akuades 90 ml
dengan waktu pengadukan yang sama menghasilkan bilangan asam tertinggi pada
hasil hidrolisis CPO dengan waktu hidrolisis selama 24 jam, yaitu 199,6255 mg
KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO menghasilkan bilangan asam
tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 230,4333 mg KOH/gram minyak.
Pada hasil hidrolisis pada CPO dan PKO dengan volume akuades 120 ml
dengan waktu pengadukan yang sama menghasilkan bilangan asam tertinggi pada
hasil hidrolisis CPO dengan waktu hidrolisis selama 24 jam, yaitu 204,6275 mg
KOH/gram minyak serta hasil hidrolisis dari PKO menghasilkan bilangan asam
tertinggi pada waktu 24 jam, yaitu 246,8405 mg KOH/gram minyak.
Bilangan asam tertinggi dihasilkan pada sampel CPO dan PKO pada
volume akuades 120 ml dengan menggunakan enzim pada waktu hidrolisis yang
dibutuhkan selama 24 jam yaitu pada CPO 204,6275 mg KOH/gram minyak dan
pada PKO 246,8405 mg KOH/gram minyak. Hal itu sesuai dengan peningkatan
hasil hidrolisis (asam lemak bebas) dimana volume akuades terbesar 120 ml dan
waktu hidrolisis yang dibutuhkan selama 24 jam (Puguh, 2012). Penambahan
enzim juga sangat mempengaruhi peningkatan asam lemak bebas dengan
membentuk ikatan komplek terhadap CPO dan PKO (enzim-substrat) meskipun
enzim tidak ikut serta dalam reaksi dan mengalami perubahan fisik. Jumlah enzim
yang diberikan terhadap jumlah sampel (substrat) membuktikan bahwa enzim
yang diberikan telah cukup. Hal ini ditunjukkan adanya peningkatan jumlah asam
lemak bebas yang terjadi selama terjadinya proses hidrolisis menggunakan enzim
sebagai katalis (Barlianti, et al., 2015).
34
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.1 Hasil uji bilangan asam terhadap waktu hidrolisis secara enzimatik
Pada CPO
Gambar 4.2 Hasl uji bilangan asam terhadap waktu hidrolisis secara enzimatik
pada PKO
Pada proses hidrolisis ini, asam lemak bebas yang didapat lebih tinggi
(dapat dilihat pada Gambar 4.1 dan Gambar 4.2) dibandingkan virgin coconut oil
(VCO), minyak kedelai dan minyak kelapa dalam bentuk bilangan asam berturutturut adalah 148,1 mg KOH/g, 146,9 mg KOH/g and, 147,6 mg KOH/g (Silalahi,
et al., 2014) dengan bilangan asam terkecil yang dihasilkan untuk CPO dan PKO
yaitu 133,1063 mg KOH/gram minyak dan 142,7126 mg KOH/gram minyak pada
waktu 6 jam dan bilangan asam yang tertinggi yang dihasilkan CPO dan PKO
adalah 204,6275 mg KOH/gram minyak dan mg KOH/gram minyak.
35
Universitas Sumatera Utara
4.2 Pengujian Aktivitas Antibakteri Crude Palm Oil
Aktifitas antibakteri dari asam lemak bebas hasil dari hidrolisis Crude
Palm Oil (CPO) terhadap Gram positif (Staphylococcus epidermidis) dan Gram
negatif (Pseudomonas aeruginosa) dapat dilihat pada Lampiran 9 dan Lampiran
10 serta zona hambatnya dapat dilihat pada Tabel 4.2; 4.3; 4.4 dan 4.5.
Tabel 4.2 Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 30 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
CPO
0
25
50
75
100
Rata-rata SD zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
7,25
8,3
7,6
Berdasarkan hasil pengukuran yang terlihat pada Tabel 4.2, bahwa kadar
minyak yang dapat memenuhi persyaratan yang ditetapkan oleh Ditjen POM RI
(1995), adalah konsentrasi zat dengan zona hambatan yang efektif lebih kurang
14-16 mm. Berdasarkan hasil penelitian diatas didapatkan bahwa asam lemak
bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam dengan volume akuades 30 ml
tidak
efektif
sebagai
antibakteri
terhadap
bakteri
Gram
positif
yaitu
Staphylococcus epidermidis dan bakteri Gram negatif yaitu Pseudomonas
aeruginosa karena zona hambat yang dihasilkan asam lemak bebas tersebut lebih
kecil dari syarat yang telah ditetapkan yaitu 14 mm.
Hal tersebut ditunjukkan dengan diameter zona hambat terbesar yang
dihasilkan pada kadar minyak 100 ml/100 ml sebesar 8,3 mm untuk bakteri
Staphylococcus epidermidis dan 7,6 mm untuk bakteri Pseudomonas aeruginosa
lebih kecil dari 14 mm.
36
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.3 Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 60 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
CPO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
7,6
7,35
8,725
8,3
Berdasarkan hasil pengukuran yang dapat dilihat pada Tabel 4.3, diameter
zona hambat dari asam lemak bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam
dengan volume akuades 60 ml memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang
terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan
Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan
zona hambat yang dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 8,725
mm dan zona hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 8,3 mm
Hasil pengukuran diameter zona hambat dari asam lemak tersebut terhadap
bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa tidak efektif
sebagai antibakteri karena zona hambat terbesar yang dihasilkan dari asam lemak
bebas tersebut lebih kecil dari 14 mm.
Tabel 4.4 Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 90 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
CPO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
7,85
8,75
11,65
7,8
9,85
37
Universitas Sumatera Utara
Berdasarkan hasil pengukuran yang dapat dilihat pada Tabel 4.4, diameter
zona hambat dari asam lemak bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam
dengan volume akuades 90 ml memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang
terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan
Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan
zona hambat yang dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 11,65
mm dan zona hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 9,85 mm
Hasil pengukuran diameter zona hambat dari asam lemak tersebut terhadap
bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa tidak efektif
sebagai antibakteri karena zona hambat terbesar yang dihasilkan dari asam lemak
bebas tersebut lebih kecil dari 14 mm.
Tabel 4.5 Hasil uji aktivitas antibakteri CPO dengan volume akuades 120 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
CPO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
7,9
7,4
8,6
7,75
11,8
10,75
Berdasarkan hasil pengukuran yang dapat dilihat pada Tabel 4.5, diameter
zona hambatan pada asam lemak bebas hasil dari hidrolisis CPO selama 24 jam
dengan volume akuades 120 ml memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang
terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan
Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan
zona hambat yang dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 11,8
mm dan zona hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 10,75 mm
38
Universitas Sumatera Utara
tetapi hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa kurang dari 14 mm sehingga tidak
efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri tersebut. Hasilnya dapat dilihat pada
Gambar 4.3 dan Gambar 4.4.
Gambar 4.3 Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari asam lemak bebas CPO
terhadap Staphylococcus epidermidis
Gambar 4.4 Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari asam lemak bebas CPO
Pseudomonas aeruginosa
Bakteri memiliki membran sel yang tersusun dari fosfolipid berlapis ganda
dan protein yang berbentuk mosaik (Pratiwi, 2008). Membran sel ini yang
berfungsi sebagai sawar selektif untuk keluar masuknya senyawa kimia dari luar
dan dalam sel (Radji, 2009). Materi yang melewati membran sel terbagi atas
kelompok makromolekul dan mikromolekul yang kemudian dipecah sebagai
nutrisi serta energy bagi bakteri (Pratiwi, 2008).
39
Universitas Sumatera Utara
Struktur ampifatik pada asam lemak bebas yang memberikan sifat detergen
mengakibatkan rusaknya membran sel pada sel bakteri sehingga menyebabkan
asam lemak bebas dapat memasuki bagian dalam sel bakteri. Asam lemak yang
memasuki bagian dalam sel bakteri meyebabkan penghambatan pertumbuhan
bakteri atau kematian sel bakteri. Tetapi dengan adanya karoten dan sterol
menyebabkan menurunkan kerusakan membran sel pada bakteri. Hal ini
menyebabkan turunnya aktivitas antibakteri yang dihasilkan oleh asam lemak
bebas yang dihasilkan dari hasil hidrolisis CPO. Hal itu disebabkan karena adanya
kandungan karotenoid didalam CPO. Karotenoid dalam CPO menyebabkan
stabilnya membran sel dengan menurunkan fluiditasnya pada sel bakteri. Dengan
demikian, karotenoid dapat melawan efek produk degradasi asam lemak bebas
yang reaktif atau peningkatan fluiditas membran (Chamberlain, et al 1991.).
Begitu juga dengan sterol pada CPO yang dapat menstabilkan membran sel
sehingga dapat menurunkan kerentanan asam lemak bebas pada sel bakteri
(Debois, et al., 2010).
Pada saat karotenoid dan sterol menstabilkan membran sel pada bakteri,
bagian dalam, bakteri pada saat yang sama mengatur ekspresi gen yang berperan
dalam mengkodekan protein yang terlibat dalam sintesis dinding sel saat terpapar
asam lemak bebas yang berfungsi sebagai pembentuk dinding sel yang lebih tebal
sehingga lebih sulit bagi asam lemak bebas untuk menembus dan merusak
membran sel pada bakteri (Kenny et al., 2009). Selanjutnya, material dinding
tambahan membuat permukaan sel lebih bermuatan tinggi dan dengan demikian
kurang hidrofobik. Oleh karena itu, asam lemak bebas bebas kurang tertarik pada
sel dan cenderung tidak masuk ke dalam membran dalam (Clarke, et al., 2007;
Kenny et al., 2009).
40
Universitas Sumatera Utara
4.3 Pengujian Aktivitas Antibakteri Palm Kernel Oil
Palm Kernel Oil (PKO) Aktifitas antibakteri dari asam lemak bebas hasil
PKO hidrolisis terhadap Gram positif (Staphylococcus epidermidis) dan Gram
negatif (Pseudomonas aeruginosa) dapat dilihat pada Lampiran11 dan Lampiran
12 serta zona hambatnya dapat dilihat pada Tabel 4.6; 4.7; 4.8 dan 4.9.
Tabel 4.6 Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 30 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
PKO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
7,7
11,85
13,115
17,65
7,8
9,3
11,6
14,5
Berdasarkan hasil pengukuran yang terlihat pada Tabel 4.6, bahwa kadar
minyak yang dapat memenuhi persyaratan yang ditetapkan oleh Ditjen POM RI
(1995), adalah konsentrasi zat dengan batas diameter daerah hambatan yang
efektif lebih kurang 14-16 mm. Berdasarkan hasil penelitian diatas didapatkan
bahwa asam lemak bebas hasil dari hidrolisis PKO selama 24 jam dengan volume
akuades 30 ml efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri Gram positif yaitu
Staphylococcus epidermidis dan bakteri Gram negatif yaitu Pseudomonas
aeruginosa karena zona hambat yang dihasilkan asam lemak bebas tersebut lebih
besar dari syarat yang telah ditetapkan yaitu 14 mm.
Hal tersebut ditunjukkan dengan diameter zona hambat terbesar yang
dihasilkan pada kadar minyak 100 ml/100 ml sebesar 17,65 mm untuk bakteri
Staphylococcus epidermidis dan 14,5 mm
untuk bakteri Pseudomonas
aeruginosa.
41
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.7 Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 60 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
PKO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
10,75
13,225
15,8
18,4
8,3
12,235
14,425
17,95
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambatan pada asam lemak
bebas PKO hasil hidrolisis selama 24 jam dengan volume akuades 60 ml bahwa
aktivitas antibakteri yang terkuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri
Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada kadar 100 ml/100
ml. Hal itu ditunjukkan dengan zona hambat yang dihasilkan pada bakteri
Staphylococcus epidermidis yaitu 18,4 mm dan zona hambat pada bakteri
Pseudomonas aeruginosa yaitu 17,95 mm.
Hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada asam lemak bebas tersebut efektif
sebagai
antibakteri
terhadap
bakteri
Staphylococcus
epidermidis
dan
Pseudomonas aeruginosa.
Tabel 4.8 Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 90 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
PKO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. Epidermidis
P. aeruginosa
12,65
10,425
13,45
13,115
16,115
16,25
19,325
18,95
42
Universitas Sumatera Utara
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambatan pada asam lemak
bebas bebas PKO hasil hidrolisis selama 24 jam dengan volume akuades 90 ml
memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang terkuat dalam menghambat
pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa
pada kadar 100 ml/100 ml. Hal itu ditunjukkan dengan zona hambat yang
dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 18,4 mm dan zona
hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 17,95 mm.
Hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada asam lemak bebas bebas hasil
hidrolisis selama 24 jam dengan volume akuades 90 ml menunjukkan bahwa asam
lemak bebas tersebut efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa.
Tabel 4.9 Hasil uji aktivitas antibakteri PKO dengan volume akuades 120 ml.
Bahan uji
Kadar minyak
(ml/100ml)
PKO
0
25
50
75
100
Rata-rata sd zona hambat (mm)
n=3
S. epidermidis
P. aeruginosa
15,4
12,8
17,1
14,725
18,6
17,35
21,9
19,75
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambatan pada asam lemak
bebas PKO hasil hidrolisis selama 24 jam dengan volume akuades 120 ml
memperlihatkan bahwa aktivitas antibakteri yang terkuat dalam menghambat
pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa
pada kadar 100 ml/100 ml.
Hal itu ditunjukkan dengan zona hambat yang
dihasilkan pada bakteri Staphylococcus epidermidis yaitu 19,325 mm dan zona
hambat pada bakteri Pseudomonas aeruginosa yaitu 18,95 mm.
43
Universitas Sumatera Utara
Hasil pengukuran diameter zona hambat pada bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa pada asam lemak bebas hasil hidrolisis
selama 24 jam dengan volume akuades 120 ml menunjukkan bahwa asam lemak
bebas tersebut efektif sebagai antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus
epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa.
Peningkatan diameter zona hambat pada aktifitas antibakteri dari asam
lemak bebas hasil hidrolisis PKO menunjukkan bahwa peningkatan asam lemak
bebas bebas berbanding lurus dengan peningkatan aktifitas antibakteri baik pada
bakteri gram positif (Staphylococcus epidermidis) dan bakteri gram negatif
(Pseudomonas aeruginosa). Karena struktur amfipatik pada asam lemak bebas
dapat dikaitkan dengan sifat detergen. Struktur tersebut dapat mengakibatkan
asam lemak bebas untuk berinteraksi dengan membran sel untuk membuat poripori transien atau permanen dengan ukuran variabel. Pada konsentrasi yang lebih
tinggi, deterjen dapat melarutkan membran sehingga berbagai protein membran
atau bagian yang lebih besar dari lapisan ganda lipid dilepaskan. Proses kunci
yang terletak pada membran yang dipengaruhi oleh asam lemak bebas adalah
produksi energi yang disebabkan oleh gangguan pada rantai transpor elektron dan
terganggunya fosforilasi oksidatif. Proses lain yang dapat menyebabkan
penghambatan pertumbuhan bakteri atau kematian meliputi pemecahan sel,
penghambatan aktivitas enzim, penurunan serapan hara dan pembentukan
peroksidasi racun dan produk autooksidasi. Asam lemak bebas dapat membunuh
bakteri secara langsung (tindakan bakterisida) atau menghambat pertumbuhannya
(tindakan bakteriostatik), yang reversibel dan berarti bahwa bakteri tetap bertahan
tetapi tidak dapat mengalami pembelahan sel (Debois, et al., 2010). Hasilnya
dapat dilihat pada Gambar4.3 dan Gambar 4.4.
44
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.3 Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari asam lemak bebas PKO
terhadap Staphylococcus epidermidis
Gambar 4.4 Hasil pengujian aktivitas antibakteri dari asam lemak bebas PKO
terhadap Pseudomonas aeruginosa
45
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN
4.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil hidrolisis Crude Palm Oil (CPO) dan Palm Kernel Oil
(PKO) dengan enzim lipase diperoleh;
a. Volume akuades untuk hidrolisis CPO dan PKO adalah 120 ml dan waktu
optimum adalah 24 jam.
b. Bilangan asam paling besar yang dihasilkan CPO dan PKO adalah 204, 6275
mg KOH/gram minyak dan bilangan asam tertinggi yang dihasilkan PKO
adalah 246,8405 mg KOH/gram minyak.
c. CPO dan PKO memiliki aktivitas antibakteri terhadap gram positif
(Staphylococcus epidermidis) dan gram negatif (Pseudomonas aeruginosa)
tetapi aktivitas antibakteri lebih baik ditunjukkan terhadap gram positif
(Staphylococcus epidermidis)
d. PKO memiliki potensi antibakteri lebih baik daripada CP,. zona hambat yang
untuk PKO pada bakteri Staphylococcus epidermidis (21,9 mm) dan
Pseudomonas aeruginosa (19,75mm) lebih besar daripada zona hambat yang
dihasilkan CPO Staphylococcus epidermidis (11,8 mm) dan Pseudomonas
aeruginosa (10,75 mm).
4.2 Saran
Disarankan kepada peneliti selanjutnya agar dapat melakukan penelitian
terhadap pengaruh asam lemak bebas hasil hidrolisis CPO dan PKO serta aktivitas
antibakterinya dengan perbedaan nutrisi terhadap tanaman kelapa sawit..
46
Universitas Sumatera Utara