Uji Sitotoksisitas Fraksi Butanol Anonna

UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI BUTANOL KULIT BATANG SRIKAYA

( Annona Squamosa L.) TERHADAP SEL HeLa SKRIPSI

Disusun untuk melengkapi syarat- syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta

Disusun oleh:

WAHYU SUGIYARTO 0843050024 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS 17 AGUSTUS 1945 JAKARTA

LEMBAR PENGESAHAN Skripsi dengan judul UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI BUTANOL KULIT BATANG SRIKAYA ( Annona squamosa L.) TERHADAP SEL HELA

Yang Dipersiapkan dan Disusun Oleh : Wahyu Sugiyarto 0843050024

Telah dipertahankan di hadapan tim penguji Pada tanggal : 26 Agustus 2013

Pembimbing :

Penguji :

(Dra. Aprilita Rinayanti, M.Biomed., Apt) (Dr. Hasan Rachmat, M.DEA., Apt) Utama

Ketua

(Widayanti, S.Si., Apt) (Ema Dewanti, M.Si) Pendamping

Sekretaris

(Diana Laila R., M.Farm., Apt) Anggota

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah Tuhan seru sekalian alam, atas segala rahmat dan karunianya sehingga

penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini yang berjudul “UJI SITOTOKSIK FRAKSI BUTANOL KULIT BATANG SRIKAYA ( Annona

squamosa L.) TERHADAP SEL HELA”. Shalawat serta salam semoga senantiasa tercurah kepada junjungan kita Nabi Muhammad S.A.W. Dengan penuh rasa kasih dan cinta, penulis mengucapkan terima kasih yang terdalam untuk seluruh keluargaku terutama Ibu tercinta serta istriku tersayang yang tidak pernah berhenti memberikan doa dan dukungan baik secara moril maupun materil sehingga penulis bisa menyelesaikan skripsi ini.

Dalam kesempatan ini, penulis juga ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada yang terhormat :

1. Bapak Dr. Hasan Rachmat, M.DEA., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta untuk semua kesempatan yang telah diberikan dalam menuntut ilmu beserta ketua program studi.

2. Ibu Dra. Aprilita Rina Yanti, M.Si, Apt., dan Ibu Widayanti, S.Si, Apt, selaku Dosen pembimbing skripsi yang telah berkenan meluangkan waktunya dan mencurahkan segala perhatian, kesabaran dan waktunya kepada penulis selama penyusunan dan penulisan proposal skripsi ini.

3. Ibu Dra. W. Muchlifa, Apt., atas bimbingan dan nasehatnya selaku pembimbing akademik (P.A).

4. Para dosen yang telah memberikan ilmu dan bimbingan selama penulismenempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta.

5. Seluruh Staf kesekretariatan Fakultas Farmasi Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta yang telah membantu penulis selama menempuh pendidikan.

6. Ibu Elrade Rofaani,St. M.Sc., dan seluruh staf BPPT Serpong( Mas Fery, dan Bu Churi) terima kasih telah banyak membantu dan membimbing selama menjalani penelitian dengan penuh kesabaran.

7. Dessy, Marifatur, Abeth, Cory, Oz, dan Christine teman-teman kelompok penelitian yang sudah menjadi tim yang hebat.

8. Serta teman- teman angkatan 2008 terima kasih banyak untuk dukungan dan solidaritasnya.

9. Dan kakak - kakak senior, terima kasih untuk semua dukungan dan bantuan kalian.

Semoga Allah S.W.T membalas segala kebaikan dan bantuan yang telah di berikan kepada penulis. Sebagai manusia yang penuh dengan kekhilafan, Penulis sangat menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, penulis dengan senang hati menerima kritik dan saran dari pembaca. Semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi penulis pada khususnya dan dunia kefarmasian pada umumnya , Amin.

Jakarta, 30 Agustus 2013

Penulis

42

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................

A. Kesimpulan ................................................................................................ 42

B. Saran ........................................................................................................... 42

43

DAFTAR PUSAKA ..............................................................................................

56

LAMPIRAN ...........................................................................................................

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Hasil Penapisan Fitokimia Fraksi Butanol Kulit Batang Srikaya .............

32 Tabel II. Persentase Sel Hidup Fraksi Butanol dari Annona squamosa L.Terhadap Sel Kanker Serviks ( sel HeLa ) Setelah Diinkubasi 24 jam .....................

33 Tabel III. Analisa Probit Fraksi Butanol Annona squamosa L. ..............................

33 Tabel IV. Persentase Sel Hidup Dengan Penambahan Doxorubisin (Kontrol Positif) Setelah Diinkubasi 24 jam ..........................................................

34 Tabel V. Analisa Probit ( Log Konsentrasi Doxorubisin (Kontrol Positif) vs Probit Kematian Sel) ...........................................................................................

35

SURAT PERNYATAAN

Yang bertanda tangan di bawah ini menyatakan bahwa,

1. Karya tulis ilmiah saya, berupa skripsi adalah asli dan belum pernah diajukan untuk mendapatkan gelar akademik S1, baik di Universitas ini maupun di Universitas lain.

2. Karya tulis ini murni gagasan, rumusan dan penulisan saya sendiri tanpa bantuan pihak lain kecuali tim pembimbing.

3. Dalam karya tulis ilmiah ini tidak terdapat karya atau pendapat yang telah ditulis dan dipublikasikan orang lain kecuali tertulis dengan jelas dicantumkan sebagai acuan dalam naskah dengan disebutkan nama pengarang serta dicantunkan dalam daftar pustaka.

4. Pernyataan ini saya buat dengan sesungguhnya, apabila dikemudian hari terdapat penyimpangan dan ketidakbenaran dalam pernyataan ini, maka saya bersedia menerima sanksi akademik berupa pencabutan gelar yang telah diperoleh karena karya tulis ini dan sanksi lainnya sesuai peraturan perundang-undangan dan norma akademik yang berlaku di Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta.

Jakarta, 30 Agustus 2013 Yang membuat pernyataan

Wahyu Sugiyarto 0843050024

ABSTRAK [A] WAHYU SUGIYARTO (0843050024)

[B] UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI BUTANOL KULIT BATANG SRIKAYA ( Annona Squamosa L.) TERHADAP SEL HeLa [C] Xii + 82 Halaman ; 2013; 5 Tabel; 16 Gambar; 14 Lampiran.

Kata kunci : kulit batang, srikaya ( Anoona squamosa L.), butanol, sitotoksisitas, sel HeLa [D] Banyak tanaman di sekitar kita yang sangat berpotensi untuk

digunakan sebagai tanaman obat, salah satunya adalah srikaya (Annona squamosa L.) yang berasal dari family Annonaceae. Secara empiris, srikaya sering digunakan sebagai astringen, antiradang, anthelmetik, antifertilitas, zat pemicu pematangan bisul, dan anti tumor. Kandungan flavonoid yang terkandung dalam tanaman srikaya diduga memiliki khasiat sebagai antikanker. Hasil penelitian dengan metode Brine Shrimp Lethality Test menunjukkan bahwa ekstrak metanol kulit batang Annona squamosa L. Berefek toksik

pada larva udang dengan nilai LC 50 sebesar 6,53 μg/ml dan nilai LC 50 sebesar 70,77 μg/ml terhadap sel T47D . Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui lebih lanjut apakah fraksi buta nol kulit batang srikaya memiliki potensi sebagai anti kanker dengan menggunakan metode MTT pada kultur sel HeLa. Penelitian dimulai dengan cara simplisia dimaserasi dalam etanol 70% kemudian dilanjutkan dengan fraksinasi beringkat dengan heksan, etil asetat dan butanol, hingga didapat fraksi butanol. Sampel ekstrak dengan konsentarsi 400 µ g/ml, 200 µ g/ml, 100 µ g/ml, 50 µ g/ml , 25 µ g/ml dan 12,5 µ g/ml, diujikan pada media yang berisi sel Hela. Jumlah sel yang hidup dilihat berdasarkan nilai absorbansi dari warna yang terbentuk oleh reaksi reduksi garam tetrazolium MTT.

Parameter penelitian adalah menentukan nilai LC 50 dari hasil persamaan regresi antara log konsentrsai ekstrak vs probit kematian sel. Dari persamaan regresi linier yang diperoleh didapat harga

LC 50 sebesar 3372,87 µg/ml atau ≈ 3,37 mg/ml. Berdasarkan analisis sitotoksisitas terhadap sel HeLa, dapat disimpulkan bahwa fraksi butanol kulit batang srikaya (Annona squamosa L.) kurang berpotensi terhadap sel kanker serviks.

[E] Daftar Pustaka : 46 buah (1987-2012)

[F] Dra. Aprilita Rinayanti, M.Si, Apt. Widayanti, S.Si, Apt.

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kanker merupakan suatu penyakit sel yang ditandai dengan hilangnya fungsi kontrol sel terhadap regulasi daur sel maupun fungsi homeostatis sel pada organisme multiseluler. Dengan kegagalan tersebut, sel tidak dapat berproliferasi secara normal. Akibatnya, sel akan berproliferasi terus-menerus sehingga menimbulkan pertumbuhan jaringan yang abnormal (Anonim, 2009).

Penyakit kanker masih menjadi masalah kesehatan dunia. Menurut data World Health Organization (WHO), setiap tahun jumlah penderita kanker di dunia berjumlah 625 juta orang dan dalam waktu 10 tahun diperkirakan 9 juta orang akan meninggal setiap tahun akibat kanker, dua pertiga dari pederita kanker di dunia berada di negara berkembang (Djajanegara dan Wahyudi, 2009).

Kanker serviks menduduki urutan tertinggi di negara berkembang dan urutan ke-10 di negara maju atau urutan ke 5 secara global. Menurut data Globocan 2008, terdapat 529.409 kasus baru kanker seviks dengan sekitar 274.883 kematian di dunia. Di Indonesia, terdapat 13.762 kasus baru dan kematian 7493 jiwa dalam setahun. Data dari 13 laboratorium patologi di Indonesia, memperlihatkan bahwa kanker serviks menduduki urutan pertama dari

10 kanker terbanyak (Soehartati et al , 2010). Kanker serviks adalah kanker primer dari serviks ( kanalis servikalis dan atau porsio) (Andrijono, 2004). Penyebab utama kanker serviks adalah virus HPV.

Proses dimulai dengan lesi prakanker dan setelah bertahun-tahun baru menjadi kanker invasif (Soehartati et al , 2010).

Beberapa obat antikanker yang telah dikembangkan saat ini, antara lain berupa obat yang merangsang diferensiasi sel sehingga akan terjadi perubahan sifat dari sel kanker yang ganas menjadi sel jinak, obat yang dapat meningkatkan efektivitas radiasi dan obat yang mengubah respon imun sel kanker dengan sel sehat. Selain itu, telah banyak obat-obatan yang dikembangkan berdasarkan aktivitas molekuler dari sel kanker. Namun, obat-obatan tersebut mengalami permasalahan dalam hal resistensi dan toleransi obat serta selektivitas obat itu sendiri di samping dari berbagai efek samping yang dapat ditimbulkan . Berbagai penelitian juga telah dilakukan dalam rangka pemanfaatan senyawa alam untuk terapi kanker. Penelitian-penelitian tersebut masih terus dikembangkan untuk menemukan obat kanker yang optimal dalam terapi (Anonim, 2009).

Salah satu masalah yang mempersulit upaya pengobatan kanker adalah kondisi ekonomis sebagian besar masyarakat yang belum memadai. Mengingat mahalnya biaya pengobatan, perlu dicari alternatif dengan memanfaatkan tumbuhan obat disekitar kita atau istilah populernya, kembali ke alam ( back to nature ). Pengobatan tradisional sering dilakukan masyarakat karena biayanya murah, bahannya mudah didapat dan aman bagi tubuh serta memiliki efek samping yang relatif kecil dibandingkan dengan obat-obat moderen (Djajanegara dan Wahyudi, 2006).

Banyak tanaman di sekitar kita yang sangat berpotensi untuk digunakan sebagai tanaman obat, salah satunya adalah srikaya ( Annona squamosa L. ) yang

berasal dari family Annonaceae. Tanaman srikaya memiliki banyak kegunaan. Buah, daun, kulit pohon, sampai biji bisa digunakan untuk berbagai keperluan. Ini tidak hanya terjadi di satu negara tapi di berbagai penjuru dunia yang terdapat banyak tanaman srikaya. Di berbagai belahan dunia, daun srikaya dimanfaatkan untuk pengobatan tradaisional. Di Meksiko, misalnya digunakan untuk mengusir kutu rambut. Di India, daunnya ditumbuk lalu dihirupkan untuk memulihkan orang yang pingsan. Di Amerika Selatan, daunnya dijadikan teh untuk membantu pencernaan dan melawan flu (Soedarso, 2012).

Secara empiris, srikaya sering digunakan sebagai astringen, antiradang, anthelmetik, antifertilitas, zat pemicu pematangan bisul, dan anti tumor. Tanaman ini mengandung beberapa senyawa aktif, antara lain flavonoid, borneol, camphor, terpen, saponin, tannin, polifenol dan senyawa polipeptida (Djajanegara dan Wahyudi, 2006).

Kandungan flavonoid yang terkandung dalam tanaman srikaya diduga memiliki khasiat sebagai antikanker. Hasil penelitian sebelumnya melaporkan bahwa kandungan senyawa kimia dari tanaman dengan family Annonaceae memiliki potensi sebagai anti kanker. Pisutthanan et al. (2004) melakukan uji sitotoksik dengan metode Brine Shrimp Lethality Test menunjukkan bahwa ekstrak metanol kulit batang Annona squamosa L. Berefek toksik pada larva

udang dengan nilai LC 50 sebesar 6,53 μg/ml. Fraksi semipolar ekstrak etanol kulit batang Srikaya ( Annona squamosa L.) mempunyai aktivitas sitotoksik yang poten

terhadap sel kanker T47D dengan nilai IC50 sebesar 70,77 μg/ml ( Hanif, 2012).

Hal ini yang membuat penulis tertarik meneliti srikaya ( Annona squamosa L.) pada fraksi polar butanol dengan menggunakan metode MTT pada media kultur sel HeLa. Kandungan flavonoid dari tanaman yang bersifat polar, diharapkan dapat tersari dengan pelarut butanol yang juga bersifat polar (Sjahid, 2008).

B. Rumusan Masalah

Apakah fraksi n-butanol ekstrak kulit batang Srikaya ( Annona squamosa L.) mempunyai efek sitotoksik terhadap sel HeLa?

C. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui daya sitotoksisitas (IC 50 ) fraksi butanol kulit batang srikaya ( Annona squamosa L. ) terhadap sel HeLa.

D. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai aktivitas daya sitotoksisitas fraksi butanol kulit batang srikaya ( Annona squamosa L.) terhadap sel kanker dan semakin bertambahnya alternatif pengobatan kanker yang bersumber dari tanaman obat Indonesia.

E. Landasan Teori

Dari hasil penelitian sebelumnya Djajanegara, I et al . (2009) menunjukkan bahwa eksrak etanol 70% dan fraksi kloroform daun srikaya memiliki aktivitas Dari hasil penelitian sebelumnya Djajanegara, I et al . (2009) menunjukkan bahwa eksrak etanol 70% dan fraksi kloroform daun srikaya memiliki aktivitas

Lethality Test menyebabkan toksisitas pada larva udang dengan LC 50 sebesar 6,53 μg/ml. Dari data ini akan diteliti mengenai daya sitotoksisitas ( LC 50 ) dari

fraksi butanol kulit batang srikaya ( Annona squamosa L.).

F.Hipotesis

Fraksi butanol kulit batang Srikaya ( Annona squamosa L.) berefek sitotoksis terhadap sel HeLa.

G. Keaslian Penelitian

Sampai saat ini penelitian untuk mengetahui konsentrasi daya sitotokisitas fraksi butanol kulit batang srikaya ( Annona squamosa L.) terhadap sel HeLa belum pernah ada dan belum dilakukan dalam penelitian.

H. Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas 17 Agustus 1945 Jakarta, Jalan Sunter Permay Raya, Jakarta Utara dan di Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro dan Biomedika ( LAPTIAB ), Gedung 610-612. Kawasan Puspitek Serpong, Jalan Raya Puspitek Serpong, Tanggerang 15.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. Uraian Tanaman

1. Taksonomi

Klasifikasi tanaman Srikaya ( Annona squamosa L. ) adalah sebagai berikut: Divisi

: Spermatophyta Subdivisi

: Angiospermae Kelas

: Dicotyledonae Bangsa

: Ranunculales Suku

: Annonaceae Marga

: Annona Jenis

: Annona squamosa L. (Syamsuhidayat, 1991)

2. Sinonim

Nama latin

: Annona squamosa L.

Nama daerah : Sumatera: delima bintang, serba bintang, sarikaya, seraikaya. Jawa: sarikaya, srikaya, serkaya, surikaya, srikawis, sarkaja, serakaja, sirikaja. Kalimantan: sarikaya. Nusa Tenggara: sirkaya, srikaya, garoso, ata. Sulawesi: atis soe walanda, sirikaya, sirikaja, perse, atis, delima srikaya, srikaya. Maluku: atisi, hirikaya, atis. (Soedarso, 2012)

Nama asing : Fan li chi (C), nona, serikaya (M), noinah (T), ates or atis (F), cachiman (A), saramulla, saramuya (Mx), anon (B), scopappel (B).

3. Morfologi Tanaman

Kulit pohon tipis berwarna keabu-abuan, getah kulitnya beracun. Batangnya (pada dahan) coklat muda, bagian dalamnya berwarna kuning muda dan agak pahit. Pada bagian ranting berwarna coklat dengan bintik coklat muda, lenti sel kecil, oval, berupa bercak bulat pada batang.

Daun tunggal, bertangkai, kaku, letaknya berseling. Helai daun berbentuk lonjong hingga jorong menyempit, ujung dan pangkal runcing, dasar lengkung, tepi rata, panjang 5-17 cm, lebar 2-7,5 cm, permukaan daun berwarna hijau, bagian bawah hijau kebiruan, sedikit berambut atau gundul. Rasanya pahit, sedikit dingin. Tangkai daun panjangnya 0,4-2,2 cm.

Bunganya bergerombol pendek menyamping dengan panjang sekitar 2.5 cm, sebanyak 2-4 kuntum bunga kuning kehijauan (berhadapan) pada tangkai kecil panjang berambut dengan panjang ± 2 cm, tumbuh pada ujung tangkai atau ketiak daun. Biji membujur di setiap karpel, halus, coklat tua hingga hitam, panjang 1,3-1,6 cm. Biji masak berwarna hitam mengkilap (Syamsuhidayat, 1991).

4. Kandungan Kimia

Secara umum, tanaman srikaya mengandung skuamosin, asimicin atherospermidine. Biji mengandung senyawa poliketida dan suatu senyawa turunan bistetrahidrofuran, asetogenin (skuamostatin C, D, anonain, anonasin A, anonin 1, IV, VI, VIII, IX, XVI, skuamostatin A, bulatasin, bulatasinon, skuamon,

ncoanonin B, neo desasetilurarisin, neo retikulasin A, skuamosten A, asmisin, skuamosin, sanonasin, anonastatin, neoanonin). Juga ditemukan skuamosisnin A, skuamosin B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N; skuamostatin B, asam lemak, asam amino dan protein. Daun mengandung alkaloid tetrahidro isokuinolin, p- hidroksibenzil-6,7- dihidroksi-1,2,3,4-tetrahidroisokinolin (demetilkoklaurin = higenamin). Bunga mengandung asam kaur-1,6-ene-1,9-oat diinformasikan sebagai kornponen aktif bunga srikaya. Akarnya mengandung flavonoid, borneol, kamfer, terpen, alkaloid anonain, saponin, tanin, dan polifenol. Kulit kayu mengandung flavonoid, borneol, kamfer, terpen, dan alkaloid anonain. Buah muda mengandung tanin. (Anonim, 2006b).

5. Manfaat dan Kegunaan

Akar rasanya pahit, sifatnya dingin. Berkhasiat antiradang, antidepresi. Daun rasanya pahit, kelat, sifatnya sedikit dingin. Berkhasiat astringen, antiradang, peluruh cacing usus (antheimintik), serta mempercepat pemasakan bisul dan abses. Biji berkhasiat memacu enzim pencernaan, abortivum, anthelmintik, dan pembunuh serangga (insektisida). Kulit kayu berkhasiat astringen dan tonikum. Buah muda dan biji juga berkhasiat antiparasit ( Soedarso, 2012 ).

6. Ekologi dan Budidaya

Srikaya adalah tanaman tropis yang bisa juga ditanam didaerah sub tropis. Tanaman ini bisa tumbuh didataran rendah sampai ketinggian 1000 m dpl, pada berbagai kondisi tanah dengan drainase yang baik. Pada umunya tanaman srikaya bagus ditanam pada kawasan yang terkena sinar matahari secara penuh. Pohon Srikaya adalah tanaman tropis yang bisa juga ditanam didaerah sub tropis. Tanaman ini bisa tumbuh didataran rendah sampai ketinggian 1000 m dpl, pada berbagai kondisi tanah dengan drainase yang baik. Pada umunya tanaman srikaya bagus ditanam pada kawasan yang terkena sinar matahari secara penuh. Pohon

B. Ekstraksi

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut air. Simplisia yang diekstrak mengandung zat aktif yang dapat larut dan zat yang tidak dapat larut seperti serat,karbohidrat, protein, dan lain-lain. Senyawa aktif yang ada dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid, dan lain-lain. Struktur kimia yang berbeda akan mempengaruhi kelarutan serta stabilitas senyawa tersebut terhadap pemanasan, udara, cahaya, logam berat, dan derajat keasaman. Dengan diketahuinya senyawa aktif yang dikandung simplisia akan mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat (Anonim, 2000).

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim,1995).

C. Metode

Teknik yang digunakan dalam ekstraksi dengan menggunakan pelarut dapat dilakukan dengan dua cara : (Anonim,2000)

1. Cara dingin

a. Maserasi

Maserasi merupakan proses ekstraksi suatu senyawa, dari simplisia yang sudah dihaluskan kemudian direndam sampai meresap dan selnya melunak, sehingga zat-zat yang mudah larut akan terlarut (Anonim, 2000).

Maserasi biasanya dilaksanakan pada temperatur 15-20°C dengan waktu yang berbeda-beda tergantung pada sifat atau ciri campuran senyawa. Tetapi lamanya harus cukup supaya dapat memasuki semua rongga dari struktur senyawa dan melarutkan semua zat yang mudah larut, biasanya waktunya dalam 3 hari (Anonim, 2000). Secara teknologi termasuk ektraksi dengan prinsip pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan yang kontinyu (terus-menerus) (Anonim, 2000).

b.Perkolasi

Perkolasi adalah proses ekstraksi dengan menggunakan perkolator. Bahan dalam serbuk dicampur dengan pelarut ekstraksi kemudian ditaburkan dalam perkolator, pelarut dialirkan melalui dinding perkolator dengan perlahan agar merata dari atas sampai ke bawah (Anonim, 2000).

2. Cara panas

a. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya,

b.Soxhlet

Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilaksanakan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah pearut relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Anonim, 2000).

c. Digesti

Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan secara umum dilakukan pada temperatur 40-50°C (Anonim, 2000).

d. Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut cair pada temperatur penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih), temperatur terukur 96- 98°C selama waktu tertentu (15-20 menit) (Anonim, 2000).

e. Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (± 30 menit) dan temperatur sampai titik didih air (Anonim, 2000).

C. Pelarut

Pelarut yang umumnya digunakan adalah air dan pelarut organik. Pelarut organik dibagi berdasarkan kepolarannya, antara lain n-heksan, petroleum eter (non polar), kloroform, etil asetat (semi polar), methanol, etanol, butanol (polar). Masing-masing kelompok senyawa kimia memiliki kelarutan yang berbeda, pelarut polar melarutkan senyawa yang polar dan pelarut non polar melarutkan senyawa yang non polar (Aulia, 2012).

D. Kanker

Kanker merupakan suatu penyakit sel yang ditandai dengan hilangnya fungsi kontrol sel terhadap regulasi daur sel maupun fungsi homeostatis sel pada organisme multiseluler. Dengan kegagalan tersebut, sel tidak dapat berproliferasi secara normal. Akibatnya, sel akan berproliferasi terus-menerus sehingga menimbulkan pertumbuhan jaringan yang abnormal (Anonim, 2009).

Pertumbuhan kanker merupakan sebuah proses mikroevolusioner yang dapat berlangsung selama beberapa bulan atau beberapa tahun. Proses pertumbuhan ini dinamakan karsinogenesis. Usaha penyembuhan penyakit kanker sangat sulit karena kompleksnya mekanisme molekuler yang menyertainya (Anonim, 2009).

E. Kanker Leher Rahim (Serviks)

Kanker leher rahim adalah tumor ganas/karsinoma yang tumbuh di dalam leher rahim/serviks, yaitu suatu daerah pada organ reproduksi wanita yang Kanker leher rahim adalah tumor ganas/karsinoma yang tumbuh di dalam leher rahim/serviks, yaitu suatu daerah pada organ reproduksi wanita yang

Sembilan puluh persen dari kanker serviks berasal dari sel skuamosa (pada jaringan epitel) yang melapisi serviks sedangkan 10% berasal dari sel kelenjar penghasil lendir pada saluran servikal yang menuju ke dalam rahim. Pada tahun 2008, kasus Kanker Leher Rahim masih menduduki peringkat pertama insidensi kanker di Indonesia. Menurut sumber yang didapat, wanita yang telah terserang kanker ini lebih dipicu lagi dengan kebiasaan mereka akan merokok (Anonim, 2007).

Penyebab paling utama kanker servik adalah anggota famili Papovirida yaitu HPV (Human Papiloma Virus) yang mempunyai diameter 55 µm dan virus ini ditularkan secara seksual. HPV memiliki kapsul isohedral yang telanjang dengan 72 kapsomer, serta mengandung DNA circular double stranded dengan panjang kira – kira 8000 pasang basa (Sjamsudin, 2001).

Berdasarkan penelitian Sjamsuddin (2001), disimpulkan bahwa terdapat 3 golongan tipe HPV dalam hubungannya dengan kanker serviks, yaitu : 1) HPV resiko rendah, yaitu HPV tipe 6 dan 11, 46 yang jarang ditemukan pada karsinoma invasif ; 2) HPV resiko sedang, yaitu HPV 33, 35, 40, 43, 51, 56, dan

58 ; 3) HPV resiko tinggi, yaitu HPV tipe 16, 18, 31. Ketiga jenis HPV ini dapat menyebabkan pertumbuhan sel yang abnormal, namun hanya tipe 2 dan 3 yang menyebabakan kanker (Yamato et al., 2006).

Faktor resiko kanker leher rahim (Anonim, 2008) :

1. Infeksi virus HPV (Human Papiloma Virus)

2. Penyakit menular seksual

3. Memulai aktifitas seksual pada usia yang sangat muda

4. Berganti-ganti pasangan seks

5. Pemakaian kontrasepsi

6. Pemakaian Dietilstilbestrol (DES)

7. Sering melahirkan

8. Penyakit yang menekan sistem imun

9. Merokok

10. Genetik Untuk tumbuh menjadi kanker leher rahim dibutuhkan beberapa tahun sejak sel-sel leher rahim mengalami perubahan. Sel-sel leher rahim abnormal yang bukan merupakan sel kanker namun dapat berkembang menjadi kanker disebut dengan cervical intra-epithelial neoplasia (CIN). CIN juga disebut sebagai sel-sel prekanker yang jika tidak ditangani lebih lanjut akan berpotensi untuk berkembang menjadi kanker. Namun tidak semua wanita yang memiliki CIN akan menderita kanker. Keberadaan CIN identik dengan displasia (Anonim, 2008).

F. Mekanisme Anti Kanker

Mekanisme kerja suatu bahan aktif dari bahan alami sangat penting diketahui untuk menjelaskan bagaimana cara kerja anti kanker. Mekanisme kerja beberapa bahan anti kanker diantaranya adalah senyawa yang langsung bekerja Mekanisme kerja suatu bahan aktif dari bahan alami sangat penting diketahui untuk menjelaskan bagaimana cara kerja anti kanker. Mekanisme kerja beberapa bahan anti kanker diantaranya adalah senyawa yang langsung bekerja

Penelusuran mekanisme lainnya yang diharapkan dapat memperbaiki system sel kanker adalah menginduksi proses apoptosis. Apoptosis merupakan kematian sel yang terprogram. Apoptosis memiliki peran penting dalam menjaga keseimbangan ( homeostatis) perkembngan sel organism pada tingkat seluler. Meningkatnya apoptosis merupakan salah satu mekanisme kerja senyawa aktif yang berfungsi sebagai anti kanker (Mulyadi, 1998).

G. Sel HeLa

Kultur sel HeLa atau HeLa cell line merupakan continuous cell line yang diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim ( cervix ) seorang wanita penderita kanker leher rahim bernama Henrietta Lacks yang meninggal akibat kanker pada tahun 1951. Kultur sel ini memiliki sifat semi melekatdan digunakan sebagai model sel kanker dan untuk mempelajari sinyal transduksi seluler. Sel HeLa ini cukup aman dan merupakan sel manusia yang umum digunakan untuk kepentingan kultur sel (Anonim, 2006a).

Sel HeLa dapat tumbuh dengan agresif dalam media kultur. Media yang digunakan adalah media RPMI 1640-serum. Di dalamnya terkandung nutrisi yang cukup untuk pertumbuhan, yaitu asam amino, vitamin, garam-garam anorganik, dan glukosa. Serum yang ditambahkan mengandung hormon-hormon yang mampu memacu pertumbuhan sel. Albumin berfungsi sebagai protein transport, Sel HeLa dapat tumbuh dengan agresif dalam media kultur. Media yang digunakan adalah media RPMI 1640-serum. Di dalamnya terkandung nutrisi yang cukup untuk pertumbuhan, yaitu asam amino, vitamin, garam-garam anorganik, dan glukosa. Serum yang ditambahkan mengandung hormon-hormon yang mampu memacu pertumbuhan sel. Albumin berfungsi sebagai protein transport,

Sel HeLa adalah sel kanker leher rahim akibat infeksi Human Papillomavirus (HPV 18) sehingga mempunyai sifat yang berbeda dengan sel leher rahim normal. Sel kanker leher rahim yang diinfeksi HPV diketahui mengeekspresikan 2 onkogen, yaitu E6 dan E7. Protein E6 dan E7 terbukti dapat menyebabkan sifat imortal pada kultur primer keratinosit manusia, namun sel yang imortal ini tidak bersifat tumorigenik hingga suatu proses genetik terjadi. Jadi, viral onkogen tersebut tidak secara langsung menginduksi pembentukan tumor, tetapi menginduksi serangkaian proses yang pada akhirnya dapat menyebabkan sifat kanker (Goodwin dan DiMaio, 2000).

H. Kultur Sel

Kultur sel merupakan teknik yang biasa digunakan untuk perkembangbiakan sel yang berasal dari cell line di luar tubuh ( In Vitro ). Sedangkan kultur jaringan merupakan kultur tiga dimensi dari jaringan utuh atau sama seperti halnya in vivo (Mahardika, 2004).

Kultur sel ditempatkan dalam wadah khusus yang steril (Flask), kebutuhan akan O 2 95% harus dijaga dan menginkubasikannya pada inkubator sel yang mengandung kadar CO 2 5% . Umumnya cell line tumbuh pada PH 7,4 sehingga kestabilannya harus dijaga dengan menambahkan buffer ke dalam medium kultur. Sel turunan disimpan pada tempratur -120 sampai -180°C agar sel tersebut tidak berproliferasi (Mahardika, 2004).

Medium kultur yang sering dipakai dalam kultur sel myeloma atau hibridoma ialah RPMI 1640. Media ini mengandung garam-garam, asam amino, dan vitamin yang diperlukan sel untuk tumbuh. Serum juga diperlukan dalam pertumbuhan sel dan biasanya digunakan ialah Fetal Calf Serum (FCS). dan Fetal Bovine Serum (FBS) (Mahardika,2004).

Uji proliferasi dapat dilakukan dengan menggunakan MTT yang diabsorbsi ke dalam sel hidup dan dipecah melalui reaksi reduksi oleh enzim reduktase menjadi formazan yang berwarna ungu, selanjutnya diukur dengan spektrofotometri menggunakan ELISA Plate Reader ( Enzyme Linked Immunosorbernt Assay ) (Freshney, 2000).

BAB III METODE PENELITIAN

A. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah tabung reaksi, erlemeyer, beaker glass, gelas ukur ( Pyrex Iwaki Glass ), botol kaca tertutup, timbangan analitik, timbangan kasar, vacum rotary evaporator (Buchi), alat

destilasi, waterbath, box lampu UV, kertas label, kertas saring, Inkubator CO 2 5% ( Heraeus ), sentrifuge ( Sarvall MC 12 V ), Laminar air flow BSL 2, mikropipet 20 µl, 200µl dan 1000 µl(Gilson), autoklaf ( Hirayama ), haemocytometer ( Neubaue r), Tips 100 µl dan 1000 µl, Tissue culture flask 25 cm ( nunclon ), tabung falcon 15 ml dan 50 ml, mikroskop inverted (Olympus CH-2), ELISA reader (SLT 240 ATC), mikroplate 96-well (Nunclon), tube sentrifuse (®Falcon), penyaring steril berdiameter pori 0,2 μm steril (®Nalgene), tangki nitrogen cair (®Locator JR Thermolyne), eppendorf steril 1,5 ml ( plasti brand ), timbangan elektrik ( Sartorius ), vortex, kamera digital, dan alat-alat praktikum penunjang yang lain.

B. Bahan

1. Kulit batang srikaya ( Annona squamosa L.)

Kulit batang Srikaya ( Annona squamosa L ) diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatis (BALITRO), Jl. Tentara Pelajar No. 3 Bogor 16111,dan dilakukan determinasi di LIPI Cibinong, untuk memastikan bahwa bahan coba benar-benar jenis Annona squamosa L.

2. Sel Hela

Sel Hela didapat dari koleksi LAPTIAB, Serpong yang dirawat dan ditumbuhkan pada medium RPMI (Gibco) dengan FBS 10% (Gibco).

3. Pelarut, Reagen dan bahan kimia

Etanol 70%, Aquadest, MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) - 2,5-difenil tetrazolium bromida] 5 mg/ml. Bahan lain yang digunakan yakni: media penumbuh RPMI ( Rossewell Park Memorial Institute) , PBS ( Phosphate buffer Saline ) pH7,4, pelarut dimetil sulfoksida (DMSO). Sodium Dodesil Sulfat (SDS)

10%, Fetal bovine serum (FBS) 10%, Natrium subkarbonat (NaHCO 3 ) 2 g/l, HCl 0,1 N, trypan blue , dan trypsin EDTA 0,5 %.

C. Prosedur Penelitian

1. Determinasi dan Pengumpulan Kulit Batang Srikaya (Annona squamosa L. ) Kulit batang srikaya diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatis (BALITRO). Kulit batang diambil dari batang bagian bawah tanaman sampai ke bagian cabang, dipisahkan dari batangnya kemudian dikumpulkan. Kulit batang kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.

2. Pembuatan Serbuk / Simplisia Kulit Batang Srikaya (Annona squamosa L. ) Kulit Batang Srikaya (Annona squamosa L. ) yang sudah kering, disortir, dicuci dengan air mengalir sampai bersih dari kotoran yang melekat. Kemudian diangin-anginkan tanpa terkena sinar matahari secara langsung, kemudian dilanjutkan proses pengeringan di lemari pengering yang dilengkapi dengan 2. Pembuatan Serbuk / Simplisia Kulit Batang Srikaya (Annona squamosa L. ) Kulit Batang Srikaya (Annona squamosa L. ) yang sudah kering, disortir, dicuci dengan air mengalir sampai bersih dari kotoran yang melekat. Kemudian diangin-anginkan tanpa terkena sinar matahari secara langsung, kemudian dilanjutkan proses pengeringan di lemari pengering yang dilengkapi dengan

3. Pembuatan Ekstrak Kulit Batang Srikaya (Annona squamosa L. ) Serbuk kering kulit batang srikaya dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup rapat. Metode yang digunakan pada penelitian adalah cara ekstraksi langsung. Simplisia direndam dalam etanol 70%, kemudiaan simplisia dimaserasi selama 6 hari dan diganti pelarutnya setiap 2 hari. Setelah selesai dimaserasi lalu disaring dengan menggunakan kertas saring sampai diperoleh filtrat. Filtrat yang diperoleh ditambah aqua dest kemudian difraksinasi dengan heksan, hingga didapat fraksi heksan dan fraksi air. Fraksi air kemudian difraksinasi kembali dengan etil asetat hingga didapat fraksi etil asetat dan fraksi air. Kemudian fraksi air difraksinasi dengan butanol, hingga didapat fraksi butanol dan fraksi air. Fraksi dari butanol yang didapat dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 60ºC sampai diperoleh ekstrak butanol kental (Anonim, 2000).

4. Pemeriksaan Karakteristik Ekstrak

a. Uji Organoleptis

Ekstrak diamati bau, rasa, warna.

b. Perhitungan Rendemen

Nilai rendemen didapat dengan cara membagi bobot ekstrak kental dengan bobot awal simplisia. Dari perhitungan rendamen ini dapat diketahui nilai kesetaraan tiap g ekstrak kental simplisia. Nilai rendamen dihitung dengan cara: Nilai rendemen didapat dengan cara membagi bobot ekstrak kental dengan bobot awal simplisia. Dari perhitungan rendamen ini dapat diketahui nilai kesetaraan tiap g ekstrak kental simplisia. Nilai rendamen dihitung dengan cara:

Rendemen ekstrak( % ) = x 100 % ( Anonim,1995 )

bobot simplisia

c. Uji susut pengeringan

Ekstrak ditimbang secara seksama sebanyak 1 g dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu

105 o C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol timbang, dengan menggoyangkan botol, hingga merupakan lapisan

setebal 5 mm sampai 10 mm. Jika ekstrak yang diuji berupa ekstrak kental, ratakan dengan bantuan pengaduk. Kemudian dimasukkan ke dalam oven,

dibuka tutupnya, dikeringkan pada suhu 105 o

C selama 30 menit hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, dibiarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar kemudian dikeringkan kembali

pada suhu 105 o C selama 30 menit hingga diperoleh bobot tetap (Anonim, 2000).

5. Identifikasi Kandungan Kimia

a. Minyak atsiri

Ekstrak diuapkan sampai kering, tambahkan alkohol, sebagian alkohol diuapkan dan sebagian lagi untuk identifikasi lemak. Jika berbau aromatis maka positif mengandung minyak atsiri (Tiwari, et.al., 2011).

b. Tanin

Ekstrak ditambah Feri klorida jika berubah menjadi warna biru kehijauan atau hijau tua maka dinyatakan mengandung tannin (Tiwari, et.al., 2011).

c. Alkaloid

Ekstrak ditambahkan 5 ml asam klorida 10%, lalu ditambahkan Amonium hidroksida pekat dan disari dengan kloroform, dikocok. Lapisan kloroform yang berada dibagian bawah diambil lalu diuapkan hingga kering. Residu ditambahkan

2 ml HCl 2N, dikocok dan dibagi 3 bagian masing-masing bagian ditambahkan pereaksi yang berbeda-beda. Penambahan pereaksi Dragendorof akan memberikan endapan berwarna jingga, penambahan pereaksi Mayer akan memberikan endapan warna putih dan penambahan pereaksi Bouchardad akan memberikan endapan berwarna coklat yang semuanya menunjukan hasil positif terhadap alkaloid (Tiwari, et.al., 2011).

d. Gula pereduksi

Ekstrak ditambahkan 2 tetes larutan fehling A dan 2 tetes larutan fehling

B, kemudian panaskan di atas waterbath akan terjadi endapan merah bata (Tiwari, et.al., 2011).

e. Kumarin

Ekstrak diuapkan sampai kering tambahkan air panas dan dinginkan. Setelah dingin dibagi menjadi 2 tabung, tabung 1 diberi Amonium hidroksida 10% dan tabung ke 2 sebagai pembanding. Lihat dibawah UV, jika terdapat fluoresensi kuning kehijauan berarti positif mengandung kumarin (Tiwari, et.al., 2011).

f. Emodol

Ekstrak dipekatkan, dinginkan lalu tambahkan Amonium hidroksida 25% kemudian kocok. Warna merah menunjukkan adanya emodol (Tiwari, et.al., 2011).

g. Steroid

Ekstrak di uapkan sampai kering di tambahkan CH 3 COOH anhidrat di tambahkan CHCl 3 ditambah H 2 SO 4 (p) melalui dinding tabung, steroid positif jika terdapat cincin warna hijau/ biru (Tiwari, et.al., 2011).

h. Terpenoid

Ekstrak di uapkan sampai kering di tambahkan CH 3 COOH anhidrat di tambahkan CHCl 3 ditambah H 2 SO4(p) melalui dinding tabung, terpenoid positif jika terdapat cincin warna ungu-merah (Tiwari, et.al., 2011).

i . Saponin

Ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi dalam tabung reaksi. Di tambahkan 1 ml aquadest, kemudian dikocok dan didiamkan, jika terbentuk buih yang tidak menghilang selama 30 menit, maka positif mengandung saponin (Tiwari, et.al., 2011).

j. Flavonoid

Ekstrak ditambahkan HCl(p) berwarna merah, kemudian ditambahkan logam Mg, warna merah naik keatas positif mengandung flavonoid (Tiwari, et.al., 2011).

6. Pembuatan Reagen

a. Medium Kultur RPMI 1640

Satu botol medium RPMI 1640 yang mengandung L-glutamin dan 20 mM HEPES (®Flow lab, Sydney, Australia) dilarutkan dengan 1 liter aquadest steril dan ditambah 2g/L NaHCO3. Medium ini kemudian disaring menggunakan penyaring bakteri dengan diameter 0,2µm. Medium yang steril ini dapat disimpan Satu botol medium RPMI 1640 yang mengandung L-glutamin dan 20 mM HEPES (®Flow lab, Sydney, Australia) dilarutkan dengan 1 liter aquadest steril dan ditambah 2g/L NaHCO3. Medium ini kemudian disaring menggunakan penyaring bakteri dengan diameter 0,2µm. Medium yang steril ini dapat disimpan

b. Phosfat Buffer Saline (PBS)

Dinatrium hidrogen fosfat (Na 2 HPO4) ditimbang 2,16 g, kemudian ditambahkan 0,20 g Kalium dihidrogen fosfat (KH 2 PO4), 8,00 g natrium klorida (KCl) larutkan dalam aqua dest steril hingga 1 liter, kemudian disterilkan dengan autoklaf (Freshney, 2000).

c. Trypsin EDTA

Trypsin ditimbang 0,250 g dan ditambah larutan PBS hingga 1 liter aduk sampai larut. Setelah itu saring dengan penyaring bakteri dan simpan pada suhu - 20°C (Freshney, 2000).

d. Trypan Blue 0,4%

Trypan Blue ditimbang 0,2 g kemudian ditambahkan 50 ml aqua dest aduk sampai larut (Freshney, 2000).

e. Sodium Dodesil Sulfat (SDS 1% )

SDS ditimbang 1 g tambahkan HCl 0,1 M kemudian dilarutkan dalam 100 ml aquadestilata aduk sampai larut (Freshney, 2000).

7. Penyiapan Sampel Uji dan Kontrol

a) Penyiapan Sampel Uji

Sampel uji ditimbang 20 mg dilarutkan dalam 400 µl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi 50.000 µg/ml (Stok I). Kemudian dipipet 100 µl Stok I dan ditambahkan 900 µl RPMI 1640 sehingga konsentrasi 5000 µg/ml (Stok II). Pembuatan konsentrasi sampel uji akan dibuat dan diambil dari stok II dengan perhitungan : Sampel uji ditimbang 20 mg dilarutkan dalam 400 µl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi 50.000 µg/ml (Stok I). Kemudian dipipet 100 µl Stok I dan ditambahkan 900 µl RPMI 1640 sehingga konsentrasi 5000 µg/ml (Stok II). Pembuatan konsentrasi sampel uji akan dibuat dan diambil dari stok II dengan perhitungan :

b) Konsentrasi 200 µg/ml diambil 750 µl dari KI dan di tambahkan 750 µl RPMI 1640 (Konsentrasi II).

c) Konsentrasi 100 µg/ml diambil 750 µl dari KII dan di tambahkan 750 µl RPMI 1640 (Konsentrasi III).

d) Konsentrasi 50 µg/ml diambil 750 µl dari KIII dan di tambahkan 750 µl RPMI 1640 (Konsentrasi IV).

e) Konsentrasi 25 µg/ml diambil 750 µl dari stok KIV dan di tambahkan 750 µl RPMI 1640 (Konsentrasi V).

f) Konsentrasi 12,5 µg/ml diambil 750 µl dari stok KV dan di tambahkan 750 µl RPMI 1640 (Konsentrasi VI).

b) Penyiapan Kontrol Positif

Doxorubisin yang digunakan sebagai kontrol positif, dibuat konsentrasi 10 ; 5 ; 2,5 ; 1,25 ; 0,625 ; 0,3125 µg/ml dari larutan induk yang berkonsentrasi 100 µg/ml.

8. Kultur Sel

a. Thawing Kultur Sel

Sel Hela yang disimpan dalam Cyro vial dari nitrogen cair dihangatkan di atas waterbath dengan suhu 37°C. Sebelum larutan mencair semua segera pindahkan sel ke T-flask yang sudah berisi 5-10 ml medium kultur RPMI, FBS

10% dan Penisillin-Streptomisin 1%, kemudian diinkubasi pada CO 2 inkubator 10% dan Penisillin-Streptomisin 1%, kemudian diinkubasi pada CO 2 inkubator

b. Sub-Kultivasi

Sel yang telah dithawing selama 1 hari dicuci satu kali dengan 10ml PBS. Tuang cairan dalam flask setelah itu tambahkan 1,8 ml PBS dan 0,2 ml trypsin, kemudian diinkubasi selama 3 menit di inkubator CO 2 5%. Setelah 3 menit lihat dibawah mikroskop untuk memastikan sel sudah tidak melekat lagi dalam dinding flask, kemudian tambahkan 1 ml medium kultur (RPMI 1640). Setelah itu keluarkan cairan dari dalam flask dan masukkan dalam tube sentrifuse kemudian disuspensikan. Setelah itu suspensi sel di sentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit.

Supernatan dituang sedangkan pellet disuspensikan dengan medium kultur (RPMI 1640) dan FBS 10% hingga 6 ml. Setelah itu suspensi sel dibagi menjadi dua bagian, kemudian masukkan ke dalam dua flask dan diinkubasi selama 2 hari

pada suhu 37°C dalam inkubator CO 2 5% (Tim kultur BPPT, 2005).

c. Perhitungan Kepadatan Sel

Sel Hela yang telah diinkubasi selama 2 hari dikeluarkan, kemudian diamati di bawah mikroskop jika kepadatan sel baik, maka dapat digunakan sedangkan jika tidak maka diinkubasi lagi hingga optimal. (Freshney, 2000).

Kultur sel dicuci dua kali dengan 10ml PBS, kemudian ditambahkan 1,8 ml PBS dan 0,2 ml trypsin, inkubasi pada suhu 37°C dalam inkubator CO 2 5% selama 3 menit. Setelah itu tambahkan 1 ml medium kultur (RPMI 1640) lalu keluarkan suspensi sel dari dalam flask, masukkan ke dalam tube sentrifuse Kultur sel dicuci dua kali dengan 10ml PBS, kemudian ditambahkan 1,8 ml PBS dan 0,2 ml trypsin, inkubasi pada suhu 37°C dalam inkubator CO 2 5% selama 3 menit. Setelah itu tambahkan 1 ml medium kultur (RPMI 1640) lalu keluarkan suspensi sel dari dalam flask, masukkan ke dalam tube sentrifuse

Setelah itu, sel dihitung dengan menggunakan hemacytometer, caranya ambil sebanyak 50 µl sel dan ditambahkan 450 µl RPMI 1640 kemudian masukkan campuran tersebut dalam cup. Lalu ambil 50 µl dari campuran tadi dan ditambahkan 50 µl trypan blue masukkan dalam setiap ujung bidang dari hemacytometer diletakkan di bawah mikroskop dan hitung semua sel yang terdapat dalam keempat bidang besar pada sudut-sudut seluruh permukaan yang dibagi (Tim kultur BPPT, 2005). Hitung sel yang menyinggung garis batas sebelah kiri dan atas. Sel yang menyinggung garis batas sebelah kanan dan bawah tidak dihitung. Jumlah sel yang diperoleh dari keempat bidang diambil nilai rata- ratanya, kemudian dikalikan dengan pengenceran sebesar 10 kali dan faktor

koreksi dari hemacytometer 10 . Jumlah sel per ml ialah rata-rata jumlah sel kali

faktor pengenceran kemudian dikalikan 10 . Sel yang tidak dihitung diencerkan, caranya diambil volume yang sesuai untuk membuat konsentrasi sel sebanyak 50.000 sel/ml dengan penambahan RPMI 1640 dan FBS 10%. Banyaknya jumlah volume yang dibutuhkan untuk konsentrasi tersebut dapat dihitung dengan rumus : P1V1 = P2V2 Dimana : P1 = jumlah sel yang telah dihitung

V1 = volume yang akan diambil P2 = jumlah sel yang diinginkan V2 = volume total sel dengan medium

9. Uji Sitotoksisitas Fraksi Butanol Kulit Batang Srikaya ( Annona squamosa L.)

Suspensi sel kanker serviks ( HeLa ) dengan kepadatan 5 x 10 sel/100 μL media didistribusikan ke dalam sumuran- sumuran pada 60- well plate dan diinkubasikan selama 24 jam. Setelah diinkubasi, ke dalam sumuran dimasukkan 100 μL larutan uji pada berbagai seri konsentrasi. Sebagai kontrol positif ditambahkan 100 μL medium kultur, kemudian 100 μL Doksorubisin pada berbagai seri konsentrasi ke dalam sumuran yang telah berisi 100 μL suspensi sel

kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator dengan aliran 5% CO 2 dan 95% O 2 . Pada akhir inkubasi, media kultur dibuang lalu ditambahkan 10 μL larutan MTT (5 mg/mL PBS),dan medium diganti dengan 190 μL medium RPMI 1640. Kemudian sel diinkubasi selama 3-4 jam. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper SDS (100 μL) setiap sumuran. Microplate kemudian diinkubasi satu malam pada suhu kamar dan ruangan gelap. Sel yang hidup bereaksi dengan MTT membentuk warna ungu. Hasil pengujian dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 570 nm (Tim kultur BPPT, 2005).

10. Pengolahan Data

Hasil yang diperoleh dari pengukuran serapan sampel dianalisis menggunakan Persen regresi linear. Untuk uji distribusi dan homogenitas menggunakan Kolmogorov-Smirnov . Jika data terdistribusi normal dan homogen dilakukan analisis one way anova pada tingkat kepercayaan 95%. Jika terdapat perbedaan yang signifikan, dilanjutkan dengan analisis Post Hoc Tuckey . Jika data tidak terdistribusi normal atau tidak homogen maka dilakukan analisis non Hasil yang diperoleh dari pengukuran serapan sampel dianalisis menggunakan Persen regresi linear. Untuk uji distribusi dan homogenitas menggunakan Kolmogorov-Smirnov . Jika data terdistribusi normal dan homogen dilakukan analisis one way anova pada tingkat kepercayaan 95%. Jika terdapat perbedaan yang signifikan, dilanjutkan dengan analisis Post Hoc Tuckey . Jika data tidak terdistribusi normal atau tidak homogen maka dilakukan analisis non

Persen sel hidup dihitung menggunakan rumus:

% Hidup = (Absorbansi sel dengan perlakuan - Absorbansi kontrol media) x 100% (Absorbansi kontrol media Sel - Absorbansi kontrol media) (Anonim, 2010).

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

1. Determinasi Kulit Batang Srikaya

Determinasi kulit batang srikaya dilakukan di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi-LIPI Cibinong. Tujuan determinasi tanaman adalah untuk memastikan identitas tanaman yang diteliti agar terhindar dari kesalahan dalam pengambilan tanaman . Hasil identifikasi menunjukan bahwa kulit batang sriakya yang digunakan dalam penelitian benar merupakan Annona squamosa L. suku Annonaceae. Hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 1.

2. Pemeriksaan Karakteristik Ekstrak