ISOLASI DAN KARAKTERISASI EKSTRAK KASAR
ISOLASI DAN KARAKTERISASI EKSTRAK KASAR
ENZIM XILANASE DARI Aspergillus niger
Sutrisno
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
Email : tris_mc@brawijaya.ac.id
Abstrak. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi ekstrak kasar enzim xilanase, hasil isolasi dari Aspergillus
niger dengan induser jerami padi, menggunakan substrat xilan. Karakterisasi enzim xilanase meliputi kondisi
optimum aktivitas enzim dan parameter kinetika reaksi enzimatis. Produksi ekstrak kasar enzim dilakukan dengan
cara menginokulasikan Aspergillus niger dalam media cair, kemudian diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 150
rpm pada temperatur kamar dan diisolasi pada jam ke-98. Isolasi ekstrak kasar enzim menggunakan metode
sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit pada pH 5, temperatur 4 oC. Ekstrak kasar enzim yang
dihasilkan sebesar 400 mL. Aktivitas xilanase diukur pada variasi pH (5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0), temperatur (40, 45, 50,
55, 60) oC dan waktu inkubasi (40, 45, 50, 55, 60) menit. Gula pereduksi yang terbentuk ditentukan secara
spektrofotometri dengan reagen Nelson-Somogyi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kondisi optimum aktivitas
ekstrak kasar enzim xilanase dalam menghidrolisis xilan menjadi gula pereduksi terjadi pada pH 8,0, temperatur 55
o
C dan waktu inkubasi selama 55 menit dengan aktivitas sebesar (25,7331 ± 0,4268) unit, sedangkan Vm dan KM
yang dihasilkan masing-masing sebesar 27,25 unit dan KM 0,4251 %.
Kata kunci : Aspergillus niger, Xilanase, kondisi optimum, reagen Nelson-Somogyi
1. Pendahuluan
Enzim xilanase merupakan biokatalis reaksi hidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi gula pereduksi.
Xilan merupakan polimer xilosa yang berikatan β-1,4 dengan jumlah monomer 30-100 unit (Schlegel dan
Schmidt, 1994). Pemanfaatan enzim xilanase dalam dunia industri memiliki peranan yang sangat penting,
misalnya pada pembuatan kertas, pembuatan gula xilosa, produksi makanan dan minuman, produksi
pakan ternak, peningkatan kualitas roti, penyerap air dan produksi biofuel (Dashek, 1997).
Enzim xilanase dapat dihasilkan oleh sejumlah mikroorganisme seperti: A. niger, Bacillus,
Cryptococcus, Penicillium, Aureo-basidium, Fusarium, Rhizomucor, Humicola (Haltrich et al., 1996).
Semua mikroorganisme memerlukan media yang mengandung sumber karbon untuk pertumbuhannya.
Mikroorganisme penghasil xilanase memerlukan xilan sebagai sumber karbon. Xilan mahal harganya
sehingga penggunaan senyawa murni secara langsung dalam media produksi memerlukan biaya cukup
tinggi. Jerami padi merupakan limbah pertanian yang sangat melimpah. Komposisi jerami padi sebagian
besar merupakan polisakarida, sehingga dapat digunakan sebagai sumber karbon pada media
pertumbuhan kapang. Jerami padi mengandung selulosa 34,6 %, hemiselulosa (xilan) 30,4 %, lignin 6,3
% (Muller, 1978 dalam Pearce, 1983). Berdasarkan kandungan xilan dalam jerami padi yang cukup
tinggi, maka dalam penelitian ini digunakan jerami padi sebagai sumber karbon.
Kemampuan enzim dalam mengkatalisis reaksi kimia dipengaruhi oleh kondisi lingkungan yang
meliputi pH, temperatur dan waktu inkubasi. Xilanase yang dihasilkan oleh A. nidulans mempunyai
aktivitas paling tinggi pada pH 5-6 dan temperatur 50-55 oC (Reis et al., 2003) Konstanta MichaelisMenten (KM) merupakan konsentrasi substrat pada saat kecepatan reaksi telah mencapai ½ kecepatan
maksimum. Sedangkan Vm merupakan kecepatan reaksi bila enzim telah jenuh dengan substrat. Setiap
enzim mempunyai nilai tetapan Michaelis-Menten tertentu. Nilai KM dapat digunakan untuk
memperkirakan jumlah subtrat yang diperlukan agar reaksi ezimatis berjalan efisien. Dengan mengetahui
nilai KM dan Vm suatu enzim maka dapat dilakukan optimalisasi penggunaan enzim tersebut sebagai
biokatalisator reaksi pemecahan substrat menjadi produk.
Dengan demikian, enzim xilanase yang dihasilkan oleh kapang A. niger dengan sumber xilan jerami
padi, perlu ditentukan karakternya, agar diketahui kondisi optimum kerja enzim dan parameter
kinetiknya.
2. Metode Penelitian
BSS_265_1_1 - 6
Kultur murni A. niger diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi PAU Universitas Gadjah Mada
Yogyakarta dan jerami padi yang digunakan adalah jenis IR 64.
Penanaman biakan Murni A. niger
Disiapkan jarum ose, kemudian dilakukan pemindahan secara aseptis kapang A. niger ke dalam
media padat dan diinkubasi selama 4 sampai 6 hari pada temperatur 30 oC.
Pembuatan Inokulum
Pembuatan inokulum dilakukan dengan mengambil spora dari biakan murni A. niger yang telah
berumur 4-6 hari dari satu agar miring, kemudian disuspensikan dalam 8 mL akuades setril. Suspensi
diambil masing-masing sebanyak 2 mL dan ditanam dalam tiga buah erlenmeyer yang masing-masing
berisi 13 mL media cair steril. Selanjutnya, media tersebut diinkubasi dalam shaker selama 49 jam.
Preparasi jerami padi.
Jerami padi kering digiling, lalu disaring, material yang lolos 150 mesh selanjutnya dicuci dengan air
panas beberapa kali , kemudian dikeringkan dalam oven.
Produksi Enzim
Disiapkan 3 buah erlenmeyer 250 mL, yang masing-masing berisi 150 mL media cair, kemudian
disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121 oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. Setelah
dingin, ditambahkan secara aseptis 15 mL inokulum. Selanjutnya media tersebut diinkubasi dalam shaker
dengan kecepatan 150 rpm pada temperatur kamar selama 98 jam, setelah itu dilakukan isolasi enzim.
Isolasi Enzim
Pada akhir masa inkubasi (98 jam), enzim xilanase diisolasi dengan metode sentrifugasi. Pada
masing-masing media cair ditambah dengan 15 mL buffer asetat pH 5,0 dan disentrifuse dengan
kecepatan 3000 rpm selama 30 menit pada temperatur 4 oC. Supernatan yang diperoleh merupakan
ekstrak kasar enzim xilanase.
Uji Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Xilanase (Isil, 2005)
Disiapkan 5 buah tabung reaksi, masing-masing diisi substrat xilan 1 % (b/v) sebanyak 1,0 mL.
Kemudian diinkubasi dalam penangas air pada temperatur 60 oC selama 15 menit. Kemudian ditambah
ekstrak kasar enzim xilanase sebanyak 1,0 mL, buffer asetat pH 5,0 sebanyak 1,0 mL dan diinkubasi pada
temperatur 60 oC selama 50 menit. Setelah itu, masing-masing tabung diinkubasi pada penangas air
mendidih selama 15 menit dan didinginkan dalam air es hingga mencapai temperatur kamar. Kemudian
dianalisis kadar gula pereduksi secara spektrofotometri menggunakan reagen Nelson-Somogyi.
Penentuan Kondisi Optimum Enzim Xilanase
a. Penentuan pH optimum
Untuk menentukan pH optimum dilakukan uji aktivitas dengan menggunakan ekstrak kasar enzim
xilanase pada variasi pH 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 dengan cara sebagai berikut: disediakan 5 buah tabung
reaksi, masing-masing diisi dengan 1,0 mL substrat xilan 1 % (b/v), yang pHnya telah diatur sebelumnya,
yaitu pH 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0. Kemudian diinkubasi di atas penangas air pada temperatur 60 oC selama
15 menit. Selanjutnya ditambahkan 1,0 mL ekstrak kasar enzim xilanase dan 1,0 mL buffer asetat pH 5,0;
6,0; 7,0; 8,0; 9,0. Tiap campuran ini diinkubasi pada temperatur 60 oC selama 30 menit. Setelah selesai
diinkubasi, untuk menghentikan hidrolisis, tabung dimasukkan dalam penangas air mendidih selama 15
menit. Kemudian didinginkan dalam air es sampai temperatur sama dengan temperatur kamar. Kadar gula
pereduksi tiap tabung dianalisis secara spektrofotometri menggunakan reagen Nelson-Somogyi.
b. Penentuan temperatur optimum
Untuk menentukan temperatur optimum dilakukan uji aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase pada pH
optimum yang diperoleh pada percobaan sebelumnya (a). Temperatur divariasi, yaitu (40; 45; 50; 55; 60)
o
C selama 30 menit.
c. Penentuan waktu inkubasi optimum
BSS_265_1_2 - 6
Untuk menentukan waktu inkubasi optimum dilakukan uji aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase pada
pH dan temperatur optimum yang diperoleh pada percobaan sebelumnya (a) dan (b). Waktu inkubasi
divariasi selama (40; 45; 50; 55; 60) menit.
d.Penentuan Vm dan KM
Harga Vm dan KM ditentukan melalui uji aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase dengan substrat xilan
pada pH, temperatur dan waktu inkubasi optimum yang diperoleh pada percobaan sebelumnya. Variasi
konsentrasi substrat xilan sebesar (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0) % (b/v).
Pengukuran Aktivitas Enzim Xilanase
Aktivitas enzim xilanase dinyatakan dalam Unit. Satu Unit aktivitas enzim adalah banyaknya μg gula
pereduksi yang dihasilkan oleh 1 mL enzim dalam setiap menit. Pengukuran aktivitas enzim dilakukan
dengan mengkonversikan nilai absorbansi yang diperoleh ke dalam persamaan linier kurva standar gula
pereduksi, kemudian dihitung dengan rumus sebagai berikut (Lehninger, 1997)
x.V.fp
AE =
di mana:
AE = aktivitas enzim (µg/mL.menit)
V = volume total sampel tiap tabung (mL)
q = waktu reaksi (menit)
p.q
x = konsentrasi gula pereduksi (µg/mL)
p = jumlah enzim (mL)
fp = faktor pengenceran
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Xilanase dari A. niger
Tahap awal sebelum mengisolasi ekstrak kasar enzim xilanase adalah membuat inokulum dan
dilanjutkan dengan produksi enzim. Enzim xilanase dihasilkan oleh kapang A. niger dengan
menggunakan sumber xilan jerami padi. Jerami padi mengandung karbohidrat cukup tinggi, sehingga
dapat digunakan sebagai sumber energi kapang dalam menginduksi enzim xilanase. Proses isolasi ekstrak
kasar enzim dilakukan dengan metode sentrifugasi, dari 450 mL media cair yang digunakan dihasilkan
supernatan yang merupakan ekstrak kasar enzim xilanase sebanyak 400 mL.
Keberhasilan isolasi enzim ditentukan melalui uji aktivitas enzim dengan substrat xilan. Terbentuknya
gula pereduksi ditandai dengan terbentuknya endapan Cu2O berwarna merah bata. Pemilihan substrat
xilan untuk uji aktivitas ini didasarkan pada kandungan xilan yang merupakan hemiselulosa murni tanpa
adanya lignin, yang sulit untuk dihidrolisis oleh enzim xilanase, sehingga mengoptimalkan hidrolisis
xilan oleh ekstrak kasar enzim xilanase.
Penentuan Kondisi Optimum
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain pH, temperatur dan waktu inkubasi.
Untuk mengetahui aktivitas optimum, maka dilakukan pengukuran aktivitas dengan variasi kondisi yang
berbeda.
Penentuan pH Optimum
Enzim memiliki pH optimum yang karakteristik, yaitu pH yang dapat menghasilkan aktivitas
maksimal dalam mengkatalisis suatu reaksi. Perubahan pH berpengaruh terhadap aktivitas enzim, karena
muatan gugus-gugus yang terdapat di dalam protein enzim, yaitu gugus karboksil dan asam amino,
mengalami perubahan tingkat ionisasi.
Gambar 1. menunjukkan bahwa aktivitas optimum ekstrak kasar enzim xilanase adalah pada pH
optimum, yaitu pH 8 dengan aktivitas rata-rata sebesar (21,7721 unit ± 0,1848). Hasil pH optimum ini
sedikit berbeda dengan hasil penelitian yang dilakukan Coral, et al (2002), yang melaporkan bahwa
aktivitas maksimum enzim xilanase terjadi pada pH 7,5.
Enzim memiliki sisi aktif dengan gugus-gugus tertentu yang berperan sebagai katalis dalam
pembentukan kompleks enzim-substrat (ES). Xilanase mempunyai gugus aktif yang dapat menghidrolisis
xilan, yaitu gugus karboksil yang merupakan gugus aktif dari asam amino jenis asam glutamat (Yong eok
lee, et al., 1993) serta mengandung gugus sulfhidril (-SH) (Marsiati, 1995). Perubahan pH berpengaruh
BSS_265_1_3 - 6
Aktivitas Ekstrak
Kasar Enzim (Unit)
terhadap ionisasi gugus fungsi, yang dapat menyebabkan terjadinya perubahan konformasi enzim xilanase
dan sifat katalitiknya.
25
20
15
10
5
0
4
6
8
10
pH
Gambar 1. Kurva pengaruh pH terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase
Aktivitas Ekstrak Kasar
Enzim (Unit)
Penentuan Temperatur Optimum
Enzim memiliki temperatur optimum dalam melakukan fungsinya, sehingga diperoleh aktivitas enzim
maksimum. Gambar 2. menunjukkan bahwa aktivitas optimum ekstrak kasar enzim xilanase dicapai pada
temperatur 55 oC, dengan aktivitas rata-rata sebesar (22,6054 ± 1,1655) unit. Hal ini sesuai dengan
penelitian yang dilakukan oleh Sunna dan Antraniklan (1997) dalam Richana (2002), yaitu temperatur
optimum enzim xilanase berkisar antara (50-60) oC.
25
20
15
10
5
0
35
45
55
65
Temperatur
Gambar 4. Kurva pengaruh temperatur terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase
Peningkatan temperatur menyebabkan aktivitas ekstrak kasar enzim meningkat. Hal ini disebabkan
oleh temperatur yang makin tinggi akan meningkatkan energi kinetik, sehingga menambah intensitas
tumbukan antara substrat dengan enzim. Tumbukan yang sering terjadi akan mempermudah pembentukan
kompleks enzim-substrat, sehingga produk yang terbentuk makin banyak. Pada temperatur optimum,
tumbukan antara enzim dan substrat sangat efektif, sehingga pembentukan kompleks enzim-substrat
makin mudah dan produk yang terbentuk meningkat. Peningkatan temperatur lebih lanjut akan
menurunkan aktivitas ekstrak kasar enzim. Hal ini disebabkan karena enzim mengalami denaturasi.
Enzim mengalami perubahan konformasi pada temperatur yang terlalu tinggi, sehingga substrat terhambat
dalam memasuki sisi aktif enzim (Lakitan, 2004).
Penentuan Waktu Inkubasi Optimum
Waktu inkubasi adalah waktu yang dibutuhkan oleh enzim untuk berikatan dengan substrat.
Penentuan waktu inkubasi optimum ekstrak kasar enzim xilanase dilakukan pada kondisi optimum yang
telah diperoleh sebelumnya, yaitu pada pH 5 dan temperatur 60 oC.
Gambar 3. menunjukkan bahwa aktivitas optimum ekstrak kasar enzim dicapai pada waktu inkubasi
55 menit dengan aktivitas rata-rata sebesar (25,7331 ± 0,2521) unit.
BSS_265_1_4 - 6
Aktivitas Ekstrak Kasar
Enzim (Unit)
30
25
20
15
10
5
0
30
40
50
60
Waktu Inkubas i (menit)
70
Gambar 3. Kurva pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase
Penambahan waktu inkubasi akan meningkatkan aktivitas ekstrak kasar enzim. Sisi aktif enzim dalam
mengikat substrat secara optimum membutuhkan waktu yang cukup. Jika waktu yang dikondisikan pada
enzim dan substrat kurang dari cukup, maka sisi aktif enzim belum optimal dalam mengikat substrat,
sehingga produk yang terbentuk masih sedikit pada saat reaksi dihentikan. Pada saat waktu inkubasi
optimum, substrat terikat secara maksimum oleh sisi aktif enzim, sehingga pada saat ini dihasilkan
produk yang melimpah. Aktivitas enzim mengalami penurunan dengan penambahan waktu inkubasi lebih
lanjut. Produk gula pereduksi yang dihasilkan dari reaksi enzimatis sebanding dengan lama waktu
inkubasi, tetapi jika sisi aktif enzim telah jenuh oleh substrat, maka lama waktu inkubasi kurang
berpengaruh, sehingga produk yang dihasilkan hanya mengalami peningkatan yang relatif kecil.
Penentuan Parameter Kinetika Reaksi Enzimatis
Aktivitas ekstrak kasar Enzim
(unit)
Konsentrasi substrat merupakan salah satu faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Gambar
4. menunjukkan bahwa konsentrasi substrat sebanding dengan aktivitas ekstrak kasar enzim. Pada
konsentrasi substrat rendah, aktivitas ekstrak kasar enzim juga rendah, karena sisi aktif enzim hanya
sedikit mengikat substrat, sehingga produk gula pereduksi yang dihasilkan juga sedikit. Demikian juga
dengan konsentrasi substrat yang makin tinggi, maka sisi aktif enzim akan makin banyak mengikat
substrat, sehingga produk gula pereduksi yang dihasilkan juga makin banyak. Penambahan substrat lebih
lanjut hanya sedikit meningkatkan aktivitas ekstrak kasar enzim, karena hampir semua enzim telah
membentuk kompleks enzim-substrat, sehingga tidak terdapat lagi sisi aktif enzim yang bebas.
Berdasarkan kurva hubungan antara konsentrasi substrat terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim
(Gambar 4), menunjukkan adanya hubungan kuantitatif di antara konsentrasi substrat dan kecepatan
reaksi enzimatik. Makin tinggi konsentrasi substrat, maka makin besar probabilitas substrat dalam
berikatan dengan sisi aktif enzim. Gambar 4 sulit menyatakan berapa konsentrasi substrat yang
diperlukan untuk mencapai Vm, karena penambahan substrat berlebih akan terus meningkatkan kecepatan
reaksi enzimatik, tetapi hanya mengalami peningkatan yang sangat kecil, sehingga tidak dapat diketahui
pada konsentrasi berapa tercapai harga Vm.
25
20
15
10
5
0
0,1
0,5
1,0
1,5
2,0
Konsentrasi Substrat (mM)
Gambar 4. Kurva hubungan konsentrasi substrat xilan terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase
Harga Vm dan KM dapat ditentukan dengan menggunakan persamaan Lineweaver-Burk sebagai berikut
(Lehninger, 1997)
BSS_265_1_5 - 6
1
=
1
+
KM 1
Vm [ S ]
Vo Vm
Berdasarkan kurva hubungan antara 1/Vo dengan 1/[S] (Gambar 7), diperoleh intersep sebesar 0,0367
dan slope sebesar 0,0156, sehingga diperoleh nilai Vm sebesar 27,25 µg/menit dan KM sebesar 0,4251 %..
0,3
1/Vo
0,2
0,1
y = 0,0156x + 0,0367
R2 = 0,9997
0
0
5
10
15
1/[S]
Gambar 5. Kurva hubungan 1/Vo dengan 1/[S]
4. KESIMPULAN
Dari hasil penelitian yang dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa:
1. Kondisi kerja optimum aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase dalam menghidrolisis substrat xilan
menjadi gula pereduksi terjadi pada pH 8,0, temperatur 55 oC dan waktu inkubasi selama 55 menit
dan dihasilkan aktivitas enzim sebesar (25,7331 ± 0,4268) unit.
2. Harga Vm dan KM yang diperoleh dari persamaan Lineweaver-Burk sebesar 27,25 µg/menit dan
0,4251 %.
DAFTAR PUSTAKA
Coral, G., Arikan, B., Unaldi, M.N., Guvenmez, H.K., 2002, Some Properties of Thermostable
Xylanase from an A. niger strain, Ann. Microbio., 52, 299-306, diakses tanggal 20 Januari 2009
Dashek, W.V., 1997, Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology,
http://www.en.wikipedia.org/wiki/xylanase, diakses tanggal 17 Juli 2006.
Haltrich, D., Nidetzky, B., Kulbe, K.D., Steiner, W. and Zupaneie, S., 1996, Production of fungal
xylanases,http://www2.psu.ac.th/PresidentOffice/EduService/journal/27-2-pdf/10xylanase.pdf, diak
ses tanggal 15 Juli 2006.
Isil, S. and N. Aksoz, 2005, Investigation of Factors Affecting Xylanase Activity from Trichoderma
harzianum 1073 D3,
Brazilian Journal of Biology and Technology 48(2):1516-8913, diakses
tanggal 15 Juni 2006.
Lakitan, B., 2004, Dasar-dasar Fisiologi Tumbuhan, PT Raja Grafindo Persada, Jakarta.
Marsiati, H. 1995, Isolasi dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Jamur Volvariella volvacea, Jurnal
Matematika dan Sains Suplemen G. F-MIPA ITB, Bandung
Pearce, G.R., 1983, The Utilization of Fibrous Agricultural Residues, Australian Government
Publishing Service, Canberra.
Reis, S.,Costa, M.A.F., Peralta, R.M., 2003, Xylanase Production by a wild strain of A. nidulans, Acta
Scientiarum: Biological Sciences, 25 (1), 221-225, diakses tanggal 12 Juni 2008.
Richana, N., 2002, Produksi dan Prospek Enzim Xilanase dalam Pengembangan Bioindustri di
Indonesia, Jurnal AgroBio 5(1):29-36, diakses tanggal 14 Juni 2006
Schlegel, H.G. dan K. Schmidt, 1994, Mikrobiologi Umum, Edisi 6, Alih Bahasa: R.M. Tedjo Baskoro,
UGM Press, Yogyakarta.
Yong-Eok Lee, S.E. Lowe, B. Henrissat and J. Gregory Zeikus, 1993, Charactrization of the Active Site
and Thermostability Regions of Endoxylanase from Thermoanaerobacterium saccharolyticum
B6A-RI, Journal of Bacteriology 175(18):5890-5898, diakses tanggal 12 April 2007.
BSS_265_1_6 - 6
ENZIM XILANASE DARI Aspergillus niger
Sutrisno
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Brawijaya, Malang, Indonesia
Email : tris_mc@brawijaya.ac.id
Abstrak. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi ekstrak kasar enzim xilanase, hasil isolasi dari Aspergillus
niger dengan induser jerami padi, menggunakan substrat xilan. Karakterisasi enzim xilanase meliputi kondisi
optimum aktivitas enzim dan parameter kinetika reaksi enzimatis. Produksi ekstrak kasar enzim dilakukan dengan
cara menginokulasikan Aspergillus niger dalam media cair, kemudian diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 150
rpm pada temperatur kamar dan diisolasi pada jam ke-98. Isolasi ekstrak kasar enzim menggunakan metode
sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit pada pH 5, temperatur 4 oC. Ekstrak kasar enzim yang
dihasilkan sebesar 400 mL. Aktivitas xilanase diukur pada variasi pH (5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0), temperatur (40, 45, 50,
55, 60) oC dan waktu inkubasi (40, 45, 50, 55, 60) menit. Gula pereduksi yang terbentuk ditentukan secara
spektrofotometri dengan reagen Nelson-Somogyi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kondisi optimum aktivitas
ekstrak kasar enzim xilanase dalam menghidrolisis xilan menjadi gula pereduksi terjadi pada pH 8,0, temperatur 55
o
C dan waktu inkubasi selama 55 menit dengan aktivitas sebesar (25,7331 ± 0,4268) unit, sedangkan Vm dan KM
yang dihasilkan masing-masing sebesar 27,25 unit dan KM 0,4251 %.
Kata kunci : Aspergillus niger, Xilanase, kondisi optimum, reagen Nelson-Somogyi
1. Pendahuluan
Enzim xilanase merupakan biokatalis reaksi hidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi gula pereduksi.
Xilan merupakan polimer xilosa yang berikatan β-1,4 dengan jumlah monomer 30-100 unit (Schlegel dan
Schmidt, 1994). Pemanfaatan enzim xilanase dalam dunia industri memiliki peranan yang sangat penting,
misalnya pada pembuatan kertas, pembuatan gula xilosa, produksi makanan dan minuman, produksi
pakan ternak, peningkatan kualitas roti, penyerap air dan produksi biofuel (Dashek, 1997).
Enzim xilanase dapat dihasilkan oleh sejumlah mikroorganisme seperti: A. niger, Bacillus,
Cryptococcus, Penicillium, Aureo-basidium, Fusarium, Rhizomucor, Humicola (Haltrich et al., 1996).
Semua mikroorganisme memerlukan media yang mengandung sumber karbon untuk pertumbuhannya.
Mikroorganisme penghasil xilanase memerlukan xilan sebagai sumber karbon. Xilan mahal harganya
sehingga penggunaan senyawa murni secara langsung dalam media produksi memerlukan biaya cukup
tinggi. Jerami padi merupakan limbah pertanian yang sangat melimpah. Komposisi jerami padi sebagian
besar merupakan polisakarida, sehingga dapat digunakan sebagai sumber karbon pada media
pertumbuhan kapang. Jerami padi mengandung selulosa 34,6 %, hemiselulosa (xilan) 30,4 %, lignin 6,3
% (Muller, 1978 dalam Pearce, 1983). Berdasarkan kandungan xilan dalam jerami padi yang cukup
tinggi, maka dalam penelitian ini digunakan jerami padi sebagai sumber karbon.
Kemampuan enzim dalam mengkatalisis reaksi kimia dipengaruhi oleh kondisi lingkungan yang
meliputi pH, temperatur dan waktu inkubasi. Xilanase yang dihasilkan oleh A. nidulans mempunyai
aktivitas paling tinggi pada pH 5-6 dan temperatur 50-55 oC (Reis et al., 2003) Konstanta MichaelisMenten (KM) merupakan konsentrasi substrat pada saat kecepatan reaksi telah mencapai ½ kecepatan
maksimum. Sedangkan Vm merupakan kecepatan reaksi bila enzim telah jenuh dengan substrat. Setiap
enzim mempunyai nilai tetapan Michaelis-Menten tertentu. Nilai KM dapat digunakan untuk
memperkirakan jumlah subtrat yang diperlukan agar reaksi ezimatis berjalan efisien. Dengan mengetahui
nilai KM dan Vm suatu enzim maka dapat dilakukan optimalisasi penggunaan enzim tersebut sebagai
biokatalisator reaksi pemecahan substrat menjadi produk.
Dengan demikian, enzim xilanase yang dihasilkan oleh kapang A. niger dengan sumber xilan jerami
padi, perlu ditentukan karakternya, agar diketahui kondisi optimum kerja enzim dan parameter
kinetiknya.
2. Metode Penelitian
BSS_265_1_1 - 6
Kultur murni A. niger diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi PAU Universitas Gadjah Mada
Yogyakarta dan jerami padi yang digunakan adalah jenis IR 64.
Penanaman biakan Murni A. niger
Disiapkan jarum ose, kemudian dilakukan pemindahan secara aseptis kapang A. niger ke dalam
media padat dan diinkubasi selama 4 sampai 6 hari pada temperatur 30 oC.
Pembuatan Inokulum
Pembuatan inokulum dilakukan dengan mengambil spora dari biakan murni A. niger yang telah
berumur 4-6 hari dari satu agar miring, kemudian disuspensikan dalam 8 mL akuades setril. Suspensi
diambil masing-masing sebanyak 2 mL dan ditanam dalam tiga buah erlenmeyer yang masing-masing
berisi 13 mL media cair steril. Selanjutnya, media tersebut diinkubasi dalam shaker selama 49 jam.
Preparasi jerami padi.
Jerami padi kering digiling, lalu disaring, material yang lolos 150 mesh selanjutnya dicuci dengan air
panas beberapa kali , kemudian dikeringkan dalam oven.
Produksi Enzim
Disiapkan 3 buah erlenmeyer 250 mL, yang masing-masing berisi 150 mL media cair, kemudian
disterilkan dalam autoklaf pada temperatur 121 oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. Setelah
dingin, ditambahkan secara aseptis 15 mL inokulum. Selanjutnya media tersebut diinkubasi dalam shaker
dengan kecepatan 150 rpm pada temperatur kamar selama 98 jam, setelah itu dilakukan isolasi enzim.
Isolasi Enzim
Pada akhir masa inkubasi (98 jam), enzim xilanase diisolasi dengan metode sentrifugasi. Pada
masing-masing media cair ditambah dengan 15 mL buffer asetat pH 5,0 dan disentrifuse dengan
kecepatan 3000 rpm selama 30 menit pada temperatur 4 oC. Supernatan yang diperoleh merupakan
ekstrak kasar enzim xilanase.
Uji Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Xilanase (Isil, 2005)
Disiapkan 5 buah tabung reaksi, masing-masing diisi substrat xilan 1 % (b/v) sebanyak 1,0 mL.
Kemudian diinkubasi dalam penangas air pada temperatur 60 oC selama 15 menit. Kemudian ditambah
ekstrak kasar enzim xilanase sebanyak 1,0 mL, buffer asetat pH 5,0 sebanyak 1,0 mL dan diinkubasi pada
temperatur 60 oC selama 50 menit. Setelah itu, masing-masing tabung diinkubasi pada penangas air
mendidih selama 15 menit dan didinginkan dalam air es hingga mencapai temperatur kamar. Kemudian
dianalisis kadar gula pereduksi secara spektrofotometri menggunakan reagen Nelson-Somogyi.
Penentuan Kondisi Optimum Enzim Xilanase
a. Penentuan pH optimum
Untuk menentukan pH optimum dilakukan uji aktivitas dengan menggunakan ekstrak kasar enzim
xilanase pada variasi pH 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 dengan cara sebagai berikut: disediakan 5 buah tabung
reaksi, masing-masing diisi dengan 1,0 mL substrat xilan 1 % (b/v), yang pHnya telah diatur sebelumnya,
yaitu pH 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0. Kemudian diinkubasi di atas penangas air pada temperatur 60 oC selama
15 menit. Selanjutnya ditambahkan 1,0 mL ekstrak kasar enzim xilanase dan 1,0 mL buffer asetat pH 5,0;
6,0; 7,0; 8,0; 9,0. Tiap campuran ini diinkubasi pada temperatur 60 oC selama 30 menit. Setelah selesai
diinkubasi, untuk menghentikan hidrolisis, tabung dimasukkan dalam penangas air mendidih selama 15
menit. Kemudian didinginkan dalam air es sampai temperatur sama dengan temperatur kamar. Kadar gula
pereduksi tiap tabung dianalisis secara spektrofotometri menggunakan reagen Nelson-Somogyi.
b. Penentuan temperatur optimum
Untuk menentukan temperatur optimum dilakukan uji aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase pada pH
optimum yang diperoleh pada percobaan sebelumnya (a). Temperatur divariasi, yaitu (40; 45; 50; 55; 60)
o
C selama 30 menit.
c. Penentuan waktu inkubasi optimum
BSS_265_1_2 - 6
Untuk menentukan waktu inkubasi optimum dilakukan uji aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase pada
pH dan temperatur optimum yang diperoleh pada percobaan sebelumnya (a) dan (b). Waktu inkubasi
divariasi selama (40; 45; 50; 55; 60) menit.
d.Penentuan Vm dan KM
Harga Vm dan KM ditentukan melalui uji aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase dengan substrat xilan
pada pH, temperatur dan waktu inkubasi optimum yang diperoleh pada percobaan sebelumnya. Variasi
konsentrasi substrat xilan sebesar (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0) % (b/v).
Pengukuran Aktivitas Enzim Xilanase
Aktivitas enzim xilanase dinyatakan dalam Unit. Satu Unit aktivitas enzim adalah banyaknya μg gula
pereduksi yang dihasilkan oleh 1 mL enzim dalam setiap menit. Pengukuran aktivitas enzim dilakukan
dengan mengkonversikan nilai absorbansi yang diperoleh ke dalam persamaan linier kurva standar gula
pereduksi, kemudian dihitung dengan rumus sebagai berikut (Lehninger, 1997)
x.V.fp
AE =
di mana:
AE = aktivitas enzim (µg/mL.menit)
V = volume total sampel tiap tabung (mL)
q = waktu reaksi (menit)
p.q
x = konsentrasi gula pereduksi (µg/mL)
p = jumlah enzim (mL)
fp = faktor pengenceran
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Xilanase dari A. niger
Tahap awal sebelum mengisolasi ekstrak kasar enzim xilanase adalah membuat inokulum dan
dilanjutkan dengan produksi enzim. Enzim xilanase dihasilkan oleh kapang A. niger dengan
menggunakan sumber xilan jerami padi. Jerami padi mengandung karbohidrat cukup tinggi, sehingga
dapat digunakan sebagai sumber energi kapang dalam menginduksi enzim xilanase. Proses isolasi ekstrak
kasar enzim dilakukan dengan metode sentrifugasi, dari 450 mL media cair yang digunakan dihasilkan
supernatan yang merupakan ekstrak kasar enzim xilanase sebanyak 400 mL.
Keberhasilan isolasi enzim ditentukan melalui uji aktivitas enzim dengan substrat xilan. Terbentuknya
gula pereduksi ditandai dengan terbentuknya endapan Cu2O berwarna merah bata. Pemilihan substrat
xilan untuk uji aktivitas ini didasarkan pada kandungan xilan yang merupakan hemiselulosa murni tanpa
adanya lignin, yang sulit untuk dihidrolisis oleh enzim xilanase, sehingga mengoptimalkan hidrolisis
xilan oleh ekstrak kasar enzim xilanase.
Penentuan Kondisi Optimum
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain pH, temperatur dan waktu inkubasi.
Untuk mengetahui aktivitas optimum, maka dilakukan pengukuran aktivitas dengan variasi kondisi yang
berbeda.
Penentuan pH Optimum
Enzim memiliki pH optimum yang karakteristik, yaitu pH yang dapat menghasilkan aktivitas
maksimal dalam mengkatalisis suatu reaksi. Perubahan pH berpengaruh terhadap aktivitas enzim, karena
muatan gugus-gugus yang terdapat di dalam protein enzim, yaitu gugus karboksil dan asam amino,
mengalami perubahan tingkat ionisasi.
Gambar 1. menunjukkan bahwa aktivitas optimum ekstrak kasar enzim xilanase adalah pada pH
optimum, yaitu pH 8 dengan aktivitas rata-rata sebesar (21,7721 unit ± 0,1848). Hasil pH optimum ini
sedikit berbeda dengan hasil penelitian yang dilakukan Coral, et al (2002), yang melaporkan bahwa
aktivitas maksimum enzim xilanase terjadi pada pH 7,5.
Enzim memiliki sisi aktif dengan gugus-gugus tertentu yang berperan sebagai katalis dalam
pembentukan kompleks enzim-substrat (ES). Xilanase mempunyai gugus aktif yang dapat menghidrolisis
xilan, yaitu gugus karboksil yang merupakan gugus aktif dari asam amino jenis asam glutamat (Yong eok
lee, et al., 1993) serta mengandung gugus sulfhidril (-SH) (Marsiati, 1995). Perubahan pH berpengaruh
BSS_265_1_3 - 6
Aktivitas Ekstrak
Kasar Enzim (Unit)
terhadap ionisasi gugus fungsi, yang dapat menyebabkan terjadinya perubahan konformasi enzim xilanase
dan sifat katalitiknya.
25
20
15
10
5
0
4
6
8
10
pH
Gambar 1. Kurva pengaruh pH terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase
Aktivitas Ekstrak Kasar
Enzim (Unit)
Penentuan Temperatur Optimum
Enzim memiliki temperatur optimum dalam melakukan fungsinya, sehingga diperoleh aktivitas enzim
maksimum. Gambar 2. menunjukkan bahwa aktivitas optimum ekstrak kasar enzim xilanase dicapai pada
temperatur 55 oC, dengan aktivitas rata-rata sebesar (22,6054 ± 1,1655) unit. Hal ini sesuai dengan
penelitian yang dilakukan oleh Sunna dan Antraniklan (1997) dalam Richana (2002), yaitu temperatur
optimum enzim xilanase berkisar antara (50-60) oC.
25
20
15
10
5
0
35
45
55
65
Temperatur
Gambar 4. Kurva pengaruh temperatur terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase
Peningkatan temperatur menyebabkan aktivitas ekstrak kasar enzim meningkat. Hal ini disebabkan
oleh temperatur yang makin tinggi akan meningkatkan energi kinetik, sehingga menambah intensitas
tumbukan antara substrat dengan enzim. Tumbukan yang sering terjadi akan mempermudah pembentukan
kompleks enzim-substrat, sehingga produk yang terbentuk makin banyak. Pada temperatur optimum,
tumbukan antara enzim dan substrat sangat efektif, sehingga pembentukan kompleks enzim-substrat
makin mudah dan produk yang terbentuk meningkat. Peningkatan temperatur lebih lanjut akan
menurunkan aktivitas ekstrak kasar enzim. Hal ini disebabkan karena enzim mengalami denaturasi.
Enzim mengalami perubahan konformasi pada temperatur yang terlalu tinggi, sehingga substrat terhambat
dalam memasuki sisi aktif enzim (Lakitan, 2004).
Penentuan Waktu Inkubasi Optimum
Waktu inkubasi adalah waktu yang dibutuhkan oleh enzim untuk berikatan dengan substrat.
Penentuan waktu inkubasi optimum ekstrak kasar enzim xilanase dilakukan pada kondisi optimum yang
telah diperoleh sebelumnya, yaitu pada pH 5 dan temperatur 60 oC.
Gambar 3. menunjukkan bahwa aktivitas optimum ekstrak kasar enzim dicapai pada waktu inkubasi
55 menit dengan aktivitas rata-rata sebesar (25,7331 ± 0,2521) unit.
BSS_265_1_4 - 6
Aktivitas Ekstrak Kasar
Enzim (Unit)
30
25
20
15
10
5
0
30
40
50
60
Waktu Inkubas i (menit)
70
Gambar 3. Kurva pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase
Penambahan waktu inkubasi akan meningkatkan aktivitas ekstrak kasar enzim. Sisi aktif enzim dalam
mengikat substrat secara optimum membutuhkan waktu yang cukup. Jika waktu yang dikondisikan pada
enzim dan substrat kurang dari cukup, maka sisi aktif enzim belum optimal dalam mengikat substrat,
sehingga produk yang terbentuk masih sedikit pada saat reaksi dihentikan. Pada saat waktu inkubasi
optimum, substrat terikat secara maksimum oleh sisi aktif enzim, sehingga pada saat ini dihasilkan
produk yang melimpah. Aktivitas enzim mengalami penurunan dengan penambahan waktu inkubasi lebih
lanjut. Produk gula pereduksi yang dihasilkan dari reaksi enzimatis sebanding dengan lama waktu
inkubasi, tetapi jika sisi aktif enzim telah jenuh oleh substrat, maka lama waktu inkubasi kurang
berpengaruh, sehingga produk yang dihasilkan hanya mengalami peningkatan yang relatif kecil.
Penentuan Parameter Kinetika Reaksi Enzimatis
Aktivitas ekstrak kasar Enzim
(unit)
Konsentrasi substrat merupakan salah satu faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Gambar
4. menunjukkan bahwa konsentrasi substrat sebanding dengan aktivitas ekstrak kasar enzim. Pada
konsentrasi substrat rendah, aktivitas ekstrak kasar enzim juga rendah, karena sisi aktif enzim hanya
sedikit mengikat substrat, sehingga produk gula pereduksi yang dihasilkan juga sedikit. Demikian juga
dengan konsentrasi substrat yang makin tinggi, maka sisi aktif enzim akan makin banyak mengikat
substrat, sehingga produk gula pereduksi yang dihasilkan juga makin banyak. Penambahan substrat lebih
lanjut hanya sedikit meningkatkan aktivitas ekstrak kasar enzim, karena hampir semua enzim telah
membentuk kompleks enzim-substrat, sehingga tidak terdapat lagi sisi aktif enzim yang bebas.
Berdasarkan kurva hubungan antara konsentrasi substrat terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim
(Gambar 4), menunjukkan adanya hubungan kuantitatif di antara konsentrasi substrat dan kecepatan
reaksi enzimatik. Makin tinggi konsentrasi substrat, maka makin besar probabilitas substrat dalam
berikatan dengan sisi aktif enzim. Gambar 4 sulit menyatakan berapa konsentrasi substrat yang
diperlukan untuk mencapai Vm, karena penambahan substrat berlebih akan terus meningkatkan kecepatan
reaksi enzimatik, tetapi hanya mengalami peningkatan yang sangat kecil, sehingga tidak dapat diketahui
pada konsentrasi berapa tercapai harga Vm.
25
20
15
10
5
0
0,1
0,5
1,0
1,5
2,0
Konsentrasi Substrat (mM)
Gambar 4. Kurva hubungan konsentrasi substrat xilan terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase
Harga Vm dan KM dapat ditentukan dengan menggunakan persamaan Lineweaver-Burk sebagai berikut
(Lehninger, 1997)
BSS_265_1_5 - 6
1
=
1
+
KM 1
Vm [ S ]
Vo Vm
Berdasarkan kurva hubungan antara 1/Vo dengan 1/[S] (Gambar 7), diperoleh intersep sebesar 0,0367
dan slope sebesar 0,0156, sehingga diperoleh nilai Vm sebesar 27,25 µg/menit dan KM sebesar 0,4251 %..
0,3
1/Vo
0,2
0,1
y = 0,0156x + 0,0367
R2 = 0,9997
0
0
5
10
15
1/[S]
Gambar 5. Kurva hubungan 1/Vo dengan 1/[S]
4. KESIMPULAN
Dari hasil penelitian yang dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa:
1. Kondisi kerja optimum aktivitas ekstrak kasar enzim xilanase dalam menghidrolisis substrat xilan
menjadi gula pereduksi terjadi pada pH 8,0, temperatur 55 oC dan waktu inkubasi selama 55 menit
dan dihasilkan aktivitas enzim sebesar (25,7331 ± 0,4268) unit.
2. Harga Vm dan KM yang diperoleh dari persamaan Lineweaver-Burk sebesar 27,25 µg/menit dan
0,4251 %.
DAFTAR PUSTAKA
Coral, G., Arikan, B., Unaldi, M.N., Guvenmez, H.K., 2002, Some Properties of Thermostable
Xylanase from an A. niger strain, Ann. Microbio., 52, 299-306, diakses tanggal 20 Januari 2009
Dashek, W.V., 1997, Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology,
http://www.en.wikipedia.org/wiki/xylanase, diakses tanggal 17 Juli 2006.
Haltrich, D., Nidetzky, B., Kulbe, K.D., Steiner, W. and Zupaneie, S., 1996, Production of fungal
xylanases,http://www2.psu.ac.th/PresidentOffice/EduService/journal/27-2-pdf/10xylanase.pdf, diak
ses tanggal 15 Juli 2006.
Isil, S. and N. Aksoz, 2005, Investigation of Factors Affecting Xylanase Activity from Trichoderma
harzianum 1073 D3,
Brazilian Journal of Biology and Technology 48(2):1516-8913, diakses
tanggal 15 Juni 2006.
Lakitan, B., 2004, Dasar-dasar Fisiologi Tumbuhan, PT Raja Grafindo Persada, Jakarta.
Marsiati, H. 1995, Isolasi dan Karakterisasi Enzim Selulase dari Jamur Volvariella volvacea, Jurnal
Matematika dan Sains Suplemen G. F-MIPA ITB, Bandung
Pearce, G.R., 1983, The Utilization of Fibrous Agricultural Residues, Australian Government
Publishing Service, Canberra.
Reis, S.,Costa, M.A.F., Peralta, R.M., 2003, Xylanase Production by a wild strain of A. nidulans, Acta
Scientiarum: Biological Sciences, 25 (1), 221-225, diakses tanggal 12 Juni 2008.
Richana, N., 2002, Produksi dan Prospek Enzim Xilanase dalam Pengembangan Bioindustri di
Indonesia, Jurnal AgroBio 5(1):29-36, diakses tanggal 14 Juni 2006
Schlegel, H.G. dan K. Schmidt, 1994, Mikrobiologi Umum, Edisi 6, Alih Bahasa: R.M. Tedjo Baskoro,
UGM Press, Yogyakarta.
Yong-Eok Lee, S.E. Lowe, B. Henrissat and J. Gregory Zeikus, 1993, Charactrization of the Active Site
and Thermostability Regions of Endoxylanase from Thermoanaerobacterium saccharolyticum
B6A-RI, Journal of Bacteriology 175(18):5890-5898, diakses tanggal 12 April 2007.
BSS_265_1_6 - 6