LAPORAN AKHIR MIKROBIOLOGI DAN VIROLOGI
LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN VIROLOGI
P-1
STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
Disusun Oleh:
Nama
: Zitta Afrida
NIM
: 1308010125
Golongan
: II
Kelompok : 3 B
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2013
P– 1
STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
I. TUJUAN
1.
2.
3.
4.
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
Mengetahui tujuan dan cara-cara sterilisasi.
Melakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf.
Mengetahui penggunaan dan macam medium.
Membuat medium.
II. ALAT DAN BAHAN
1. Pembuatan Medium Nutrien Cair
A. Alat
1) Gelas beker
2) Batang pengaduk
3) Kapas
4) Tabung reaksi
5) Rak tabung reaksi
6) Autoklaf
B. Bahan
1) Ekstrak daging ( beff extract ) atau daging segar
2) Pepton
3) NaCL
4) Akuadest
2. Pembuatan Medium Nurtien Agar
A. Alat
1) Gelas beker
2) Batang pengaduk
3) Kapas
4) Tabung reaksi
5) Rak tabung reaksi
6) Autoklaf
B. Bahan
1) Ekstrak daging
2) Pepton
3) Agar – agar
4) Akuadest
3. Pembuatan Medium Agar Darah
A. Alat
1) Labu erlenmeyer
2) Autoklaf
3) Cawan petri
B. Bahan
a) Media TSA 40 gr
b) Darah domba 50 ml
c) Akuadest 1000 ml
III. CARA KERJA
A. Sterilisasi Dengan Autoklaf
Tuangkan air secukupnya ke dalam sterilisator
↓
Tata alat - alat dan bahan - bahan yang akan disterilkan
↓
Letakkan tutup sterilisator pada tubuh sterilisator
↓
Buka klep pengaman
↓
Tutup klep pengaman apabila uap air mulai keluar dengan deras
↓
Pertahankan tekanan 1 atm selama 15 – 20 menit
↓
Matikan pemanasan dan tunggu sampai tekanan nol
↓
Buka pengatur klep
↓
Buang air yang bersisa dan keringkan semua bagiannya
↓
Saat mencuci tutupnya jaga agar alat pengukur tekanan tidak terkena air
B. Pembuatan Medium
a. Pembuatan Medium Nutrien
Larutkan 3 gr ekstrak daging
↓
Ditimbang pepton sebanyak 5 gram
↓
Dilarutkan kedua bahan (ekstrak daging dan pepton) dalam 1000 ml aquadest
sampai homogen
↓
Larutan dipanaskan dalam penangas air sampai larutan mendidih selama 5
menit
↓
Larutan didinginkan, kemudian dinetralkan dengan menggunakan NaOH 1 N
sedikit demi sedikit sampai mencapai pH 7,2
(cek pH dengan menggunakan pH meter)
↓
Aquadest yang hilang selama pemanasan diganti dengan aquadest sehingga
volumenya tepat 1000 ml kembali
↓
Larutan medium tersebut disaring dengan menggunakan kapas atau kain
penyaring yang bersih
↓
Disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada tekanan 2 atm, suhu 121⁰C
selama 20 menit
b. Pembuatan Medium Nurtien Agar
Disiapkan medium nutrien cair
↓
Timbang agar - agar sebanyak 15 – 20 gr untuk setiap 1 liter akuadest
↓
Masukkan agar - agar kedalam medium dan kemudian dipanaskan selama 20 - 30
menit
↓
Volume medium yang hilang selama pemanasan dikembalikan ke volume semula,
bila perlu dilakukan penyesuaian pH
↓
Dalam keadaan panas, medium disaring dengan kapas atau kain saring yang bersih
↓
Medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril, untuk medium agar miring
diisikan 5 ml dan untuk medium agar tegak diisikan 10 ml
↓
Disterilkan pada autoklaf dengan tekanan 2 atm, suhu 121⁰C, selama 20 menit
(untuk membuat agar miring, setela sterilisasi tabung diletakkan miring dengan
sudut 30⁰ terhadap bidang datar dan dibiarkan sampai medium menjadi padat,
sedangkan untuk medium agar tegak, tabung reaksi diletakkan tegak)
c. Pembuatan Medium Agar Darah
Larutkan 4 gr TSA dalam 100 ml akuadest
↓
Kemudian disterilkan menggunakan autoklaf
↓
Siapkan darah domba sebanyak 5 ml
↓
Campurkan darah ke dalam media TSA
↓
Tuang ke dalam cawan petri sebanyak 5 ml
↓
Tunggu hingga memadat dan uap panas menghilang
↓
Kemudian simpan dalam lemari pendingin dan dalam keadaan terbalik
IV. HASIL
A. Gambar autoklaf beserta bagian-bagiannya
Keterangan gambar :
1. Tombol pengatur waktu mundur (timer)
2. Katup pengeluaran uap
3. pengukur tekanan
4. kelep pengaman
5. Tombol on-off
6. Termometer
7. air Lempeng sumber panas
8. Aquades (dH2O)
9. Sekrup pengaman
10. batas penambahan
B. Gambar medium yang dibuat
V. PEMBAHASAN
Praktikum kali ini berjudul ” STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM “,yang
bertujuan agar setelah dilakukannya praktikum mahasiswa diharapkan dapat megetahui
tujuan dan cara - cara sterilisasi, dapat melakukan sterilisasi dengan menggunakan
autoklaf, mengetahui penggunaan dan macam medium, serta dapat membuat medium.
Sterilisasi sendiri dalam mikrobiologi merupakan proses penghilangan semua jenis
organisme hidup, dalam hal ini adalah mikroorganisme ( protozoa, fungi, bakteri,
mycoplasma, virus ) yang terdapat pada / di suatu benda. Sterilisasi didesain untuk
membunuh atau menghilangkan mikroorganisme.Target suatu metode inaktivasi
tergantung dari metode dan tipe mikroorganismenya, yaitu tergantung dari asam nukleat,
protein, atau membran mikroorganisme tersebut. Alat - alat dan bahan - bahan yang
digunakan dalam bidang mikrobiologi harus steril, yang berarti pada bahan ataupun
peralatan tersebut tidak terdapat mikrobayang kehadirannya tidak diharapkan, karena
dapat mengganggu atau merusak medium atau proses yang sedang dikerjakan.Sterilisasi
sendiri dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu sterilisasi secara fisik dengan
menggunakan pemanasan , sinar X, sinar ultraviolet dan sebagainya,kemudian sterilisasi
secara kimia dengan menggunakan desinfektan, fenol, bisfenol, halogen, klorin,alkohol,
aldehid, senyawa merkuri, etilen oksida, peroksigen dan sebagainya serta sterilisasi secara
mekanik yaitu filtrasi atau penyaringan. Tetapi metode atau cara sterilisasi yang lazim
digunakan adalah dengan menggunakan pemanasan yang dibagi menjadi dua jenis yang
pertama yaitu sterilisasi panas kering yaitu metode sterilisasai panas tanpa kelembaban
( tanpa penggunaan uap air ),yang berfungsi untuk mematikan organisme dengan cara
mengoksidasi komponen sel ataupun mendenaturasi enzim. Ada dua metode sterilisasai
panas kering yaitu dengan insinerasi ( incineration ) yaitu pembakaran dengan
menggunakan api dari bunsen dengan temperatur sekitar 350 o C serta dengan udara panas
oven yang lebih sederhana dan lebih murah dengan temperatur sekitar 160 – 170o C. Yang
kedua yaitu sterilisasi panas basah menggunakan uap air dengan menggunakan
autoklaf,alat serupa pressure cooker dengan pengatur tekanan dan klep pengaman, prinsip
autoklaf sendiri adalah terjadinya koagulasi yang lebih cepat dalam keadaan basah
dibandingkan dalam keadaan kering. Proses sterilisasi dengan autoklaf ini dapat
membunuh mikroorganisme dengan cara mendenaturasi atau memgkoagulasi protein pada
enzim dan membran selmikroorganisme. Proses ini juga dapat membunuh endospora
bakteri. Terdapat tiga tipe autoklaf yaitu, portable bench top, gravity displacement, dan
multicycle porous – load .
Medium juga sangat diperlukan karena medium digunakan untuk mengembangbiakan
milroorganisme seperti kapang, khamir, jamur, bakteri ataupu yang lainnya. Medium
adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan
mikroba,selain itu dapat puladigunakan untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba. Agar mikroba dapat tumbuh dan
berkembangbiak dengan baik di dalam suatu medium.maka medium tersebut harus
memenuhi syarat antara lain medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah
digunakan oleh mikroba, medium harus mempunyai tekanan osmosis,tegangan muka dan
pH yang sesuai, meddium tidak mengandung zat – zat yang menghambat pertumbuhan
mikroba, serta medium harus steril. Pada praktikum yang dilakuka kali ini terdapat
beberapa jenis medium yang dibuat antara lain medium nutrien cair dengan menggunakan
ekstrak daging, medium nutrien agar tegak yang digunakan untuk melihat pertumbuhan
mikroba, medium nutrien agar miring yang digunakan untuk melihat pergerakan mikroba,
medium nutrien agar cawan yang digunakan untuk proses perhitungan mikroba serta
medium nutrien agar darah( yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri Neiserria dan
Streptococcus, untuk menumbuhkan bakteri heterotrof, untuk membedakan bakteri
berdasarkan sifatnya bisa atau tidaknya bakteri tersebut menghemolisis darah ) tetapi
medium nutrien agar darah tidak dibuat dalam praktikum kali ini. Dan kelompok kami
hanya membuat medium nutrien agar miring saja.
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah tabung reaksi sebagai tempat
media pertumbuhan mikroba dalam bentuk medium tegak ataupun medium miring, beker
gelas yang digunakan untuk melarutkan bahan, batang pengaduk yang digunakan untuk
membantu dalam pelarutan bahan, kapas yang digunakan untuk menutup mulut tabung
reaksi yang sudah berisi larutan media untuk pertumbuhan bakteri, rak tabung reaksi yang
digunakan sebagai tempat tabung reaksi, serta autoklaf yang digunakan untuk
mensterilkan medium yang dibuat. Sementara bahan- bahan yang digunakan antara lain
campuran antara ekstrak daging dengan agar - agar yang berfungsi sebagai sumber
karbohidrat yang mengandung senyawa nitrogen yang banyak dibutuhkan oleh mikrona
dan agar - agar yang berfungsi untuk memadatkan medium, NaCL yang berfungsi sebagai
sumber mineral, pepton berfungsi untuk mempercepat pertumbuhan mikroba karena
mengandung banyak N2, dan akuadest yang berfungsi sebagai pelarut.
Langkah kerja yang pertama yaitu kita membersihkan meja yang akan digunakan
dalam praktikum dengan menggunakan alkohol, hal ini merupakan salah satu teknik
aseptis yang dilakukan agar segala pekerjaan yang akan kita lakukan dalam keadaan yang
steril dan terbebas dari zat yang kontaminan yang tidak diperlukan. Yang pertama
dilakukan adalah pembuatan medium nutrien agar miring yang dibuat dengan cara
memasukkan 1,2 gr Na ke dalam gelas beker kemudian ditambahkan akuadest sebanyak
60 ml dan diaduk sampai semua Na larut dan benar - benar homogen, setelah itu
menyiapkan tabung reaksi sebanyak 12 buah, lalu masukkan sebanyak 5 ml larutan Na ke
dalam tiap - tiap tabung reaksi yang telah disiapkan, setelah semua tabung reaksi terisi
tutup tabung reaksi menggunakan kapas hingga benar - banar rapat sehingga tidak ada
udara yang dapat masuk ke dalam tabung reaksi hal ini dilakukan agar medium tetap
terjaga kemurniannya karena apabila tidak ditutup dengan rapat udara dapat masuk
sedangkan udara mengandung banyak mikroorganisme dan kontaminan yang apabila
masuk ke dalam tabung reaksi dapat mempengaruhi kemurnian dari medium yang dibuat
serta dapat merusak medium,setelah itu ke 12 tabung tersebut dimasukkan ke dalam
plastik dan diikat kencang menggunakan karet gelang.
Selanjutnya adalah pembuatan medium nutrien agar tegak yang dibuat dengan cara
memasukkan 2,4 gr Na ke dalam gelas beker kemudian ditambahkan akuadest sebanyak
120 ml dan diaduk sampai semua Na larut dan benar - benar homogen, setelah itu
menyiapkan tabung reaksi sebanyak 12 buah, lalu masukkan sebanyak 10 ml larutan Na ke
dalam tiap -tiap tabung reaksi yang telah disiapkan, setelah semua tabung reaksi terisi
tutup tabung reaksi menggunakan kapas hingga benar - benar rapat tujuannya seperti yang
telah dijelaskan pada proses sebelumya,setelah itu ke 12 tabung tersebut dimasukkan ke
dalam plastik dan diikat kencang menggunakan karet gelang.
Setelah itu pembuatan medium NB yang dibuat dengan cara memasukkan 1,56 gr NB
ke dalam erlenmeyer kemudian ditambahkan akuadest sebanyak 120 ml dan diaduk hingga
homogen, setelah itu menyiapkan tabung reaksi sebanyak 12 buah, lalu masukkan
sebanyak 10 ml larutan NB kedalam tiap - tiap tabung reaksi yang telah disiapkan, setelah
semua tabung reaksi terisi tutup tabung reaksi menggunakan kapas hingga benar - benar
rapat tujuannya seperti yang sudah dijelaskan diatas, setelah itu ke 12 tabung tersebut
dimasukkan ke dalam plastik dan diikat kencang menggunakan karet gelang.
Setelah itu pembuatan medium nutrien cawan yang dibuat dengan cara memasukkan
3,6 gr Na kedalam gelas beker kemudian ditambahkan akuadest sebanyak 180 ml dan
diaduk hingga homogen,setelah itu menyiapkan tabung reaksi sebanyak 12 buah, lalu
masukkan sebanyak 15 ml larutan Na ke dalam tiap - tiap tabung reaksi yang telah
disiapkan,setelah semua tabung reaksi terisi tutup tabung reaksi menggunakan kapas
hingga benar - benar tertutup rapat tujuannya seperti yang sudah dijelaskan di atas, setelah
itu ke 12 tabung reaksi tersebut dimasukkan ke dalam plastik dan diikat kencang dengan
menggunakan karet gelang.
Selanjutnya adalah pembuatan medium TSA ( Tripton Soya Agar ) yang dibuat dengan
cara memasukkan 3,6 gr TSA ke dalam erlenmeyer 250 ml kemudian ditambahkan
akuadest sebanyak 90 ml, kemudian tutup erlenmeyer menggunakan kertas dan diikat
menggunakan karet gelang. Komposisi TSA sendiri antara lain glukosa sebagai sumber
gula, kasein sebagai sumber protein, kedelai sebagai sumber nutrisi seperti fungsi dari
ekstrak daging, agar berfungsi untuk memadatkan medium, NaCL sebagai sumber mineral,
dan fosfat sebagai penyangga.
Selanjutnya pembuatan medium NB yang dibuat dengan cara memasukkan 3,9 gr NB
ke dalam gelas beker, kemudian ditambahkan akuadest sebanyak 300 ml, kemudian
menyiapkan erlenmeyer sebanyak 6 buah, lalu masukkan sebanyak 50 ml larutan NB ke
dalam tiap - tiap tabung reaksi, setelah itu tutup semua erlenmeyer menggunakan kertas
dan diikat menggunakan karet gelang.
Setelah semua medium selesai dibuat kemudian disterilkan dengan menggunakan
autoklaf. Autoklaf adalah alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu
benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (121 0C, 15 lbs) selama kurang
lebih 15 menit. Penurunan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh
mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah
yang akan membunuh microorganisme. Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh
endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap
pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Pada spesies yang sama, endospora dapat bertahan
pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh sel vegetatif bakteri tersebut. Endospora
dapat dibunuh pada suhu 100 °C, yang merupakan titik didih air pada tekanan atmosfer
normal. Pada suhu 121 °C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit, dimana sel
vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu
65 °C.Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf
mencapai 121 °C. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas
pada bagian dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu
pemanasan total untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 °C untuk waktu 1015 menit. Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume besar akan
diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk
mencapai suhu sterilisasi.
VI. KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat diambil dari praktikum yang telah dilakukan adalah :
1. Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa dapat:
a. Mengetahui tujuan dan cara-cara sterilisasi.
b. Melakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf.
c. Mengetahui penggunaan dan macam medium.
d. Membuat medium.
2. Sterilisasai dalam mikrobiologi merupakan proses penghilangan semua jenis
organisme hidup, dalam hal ini adalah mikroorganisme ( protozoa, fungi, bakteri,
mycoplasma, dan virus ) yang terdapat di atau pada suatu benda.
3. Sterilisasi dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain :
a. Sterilisasi secara fisik
Metode sterilisasi panas
Metode sterilisasi dengan penyaringan
Metode sterilisasi dengan radiasi
Metode pasteurisasi
Metode sterilisasi dengan pengeringan
b. Sterilisasi secara kimia
c. Sterilisasi secara mrkanik
4. Metode sterilisasi yang digunakan dalam praktikum adalah metode sterilasi panas
basah menggunakan autoklaf dengan temperatur diatas 100o C
5. Prinsip kerja autoklaf adalah terjadinya koagulasi yang lebih cepat dalam keadaan
basah dibandingkan dalam keadaan kering, proses sterilisasi dengan autoklaf ini dapat
membunuh mikroorganisme dengancara mendenaturasi atau mengkoagulasi protein
pada enzim dan membran sel mikroorganisme.
6. Medium adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai untuk
menumbuhkan mikroba,selain itu dapat puladigunakan untuk isolasi, memperbanyak,
pengujian sifat - sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba.
7. Syarat - syarat medium yang baik :
a. Medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh
mikroba.
b. Medium harus mempunyai tekanan osmosis,tegangan muka dan pH yang
sesuai.
c. Meddium tidak mengandung zat – zat yang menghambat pertumbuhan
mikroba.
d. Medium harus steril.
8. Pada praktikum kali ini medium yang dibuat antara lain :
Medium nutrien agar cair dengan menggunakan ekstrak daging
Medium nutrien agar tegak
Medium nutrien agar miring
Medium NB
Medium TSA ( Tripton Soya Agar )
Medium nutrien cawan
9. Kelompok kami hanya membuat satu macam jenis medium yaitu medium agar
miring.
VII. DAFTAR PUSTAKA
Agus Syahrurachman, dkk. 1993 Buku Ajar Mikroboilogi Kedokteran. Jakarta :
Binarupa Aksara.
Dwirdjo, Seputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.
Michael Pelczar, dkk. 2008. Dasar – Dasar Mikrobiologi, Jakarta : Penerbit
Universitas Indonesia.
Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Erlangga.
LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN VIROLOGI
P-2
PENANAMAN, ISOLASI DAN PENGAMATAN
PERTUMBUHAN MIKROBA
Disusun Oleh:
Nama
: Zitta Afrida
NIM
: 1308010125
Golongan
: II
Kelompok : 3 B
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2013
P– 2
PENANAMAN, ISOLASI DAN PENGAMATAN PERTUMBUHAN MIKROBA
I.TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat melakukan isolasi
terhadap mikroba seta mengamati pertumbuhan bakteri.
II. ALAT DAN BAHAN
1. Menanam mikroba aerob
A. Alat
1) Ose tumpul
2) Ose runcing
3) Lampu spiritus
B. Bahan
1) Biakan murni Bacillus subtilis dalam medium nutrien cair umur 24 jam.
2) Biakan murni Escherichia coli dalam medium nutrien cair umur 24 jam.
3) Medium nutrien agar tegak, medium nutrien agar miring, dan medium
nutrien cair.
2. Isolasi mikroba
A. Alat
1) Cawan petri steril
B. Bahan
1) Suspensi mikroba / campuran mikroba
2) Medium nutrien agar tegak
3. Pengamatan pertumbuhan mikroba
A. A lat
1) Inkubator 37o C dengan shaker
2) Pipet steril
3) Spektrofotometer
4) Kuvet plastik
B. Bahan
1) Kultur bakteri E. coli dari media NA.
2) 100 ml medium pertumbuhan NB dalam 250 ml labu erlenmeyer.
3) Media tanpa bakteri sebagai blanko.
III. CARA KERJA
A. Menanam mikroba aerob
a) Biakan agar tegak
Sterilkan jarum ose runcing diatas nyala api lampu spiritus
↓
Ambil biakan murni dengan benar dan dalam keadaan aseptis diatas nyala
lampu spiritus
↓
Ambil inokulum menggunakan jarum ose runcing, panaskan bibir tabung lalu
tutup kembali
↓
Ambil medium aga tegak, lepas kapas penutupnya kemudian tusuk medium agar
tegak tersebut dengan ose inokulasi hingga 1cm di bawah permukaan tabung
secara hati - hati, panaskan bibir tabung lalu tutup kembali
↓
Pijarkan lampu ose sebelum diletakkan kembali
↓
Beri etiket pada tabung reaksi bertuliskan nama bakteri
↓
Diinkubasikan pada suhu 37o C
b) Biakan agar miring
Sterilkan jarum ose tumpul diatas nyala api lampu spiritus
↓
Ambil biakan murni dengan benar dan dalam keadaan aseptis diatas nyala
lampu spiritus
↓
Ambil inokulum menggunakan jarum ose tumpul, panaskan bibir tabung lalu
tutup kembali
↓
Ambil medium aga miring, lepas kapas penutupnya kemudian goreskan jarum
ose tumpul pada permukaan medium agar miring tersebut secara hati - hati,
panaskan bibir tabung lalu tutup kembali
↓
Pijarkan lampu ose sebelum diletakkan kembali
↓
Beri etiket pada tabung reaksi bertuliskan nama bakteri
↓
Diinkubasikan pada suhu 37o C
c) Biakan cair
Sterilkan jarum ose runcing diatas nyala api lampu spiritus
↓
Ambil biakan murni dengan benar dan dalam keadaan aseptis diatas nyala
lampu spiritus
↓
Ambil inokulum menggunakan jarum ose runcing, panaskan bibir tabung lalu
tutup kembali
↓
Ambil medium agar cair, lepas kapas penutupnya kemudian singgungkan ujung
ose tumpul yang mengandung inokulum pada permukaan medium agar cair
secara hati - hati, panaskan bibir tabung lalu tutup kembali
↓
Pijarkan lampu ose sebelum diletakkan kembali
↓
Beri etiket pada tabung reaksi bertuliskan nama bakteri
↓
Diinkubasikan pada suhu 37o C
B. Isolasi Mikroba
Cara Goresan ( Streaking plate )
Cairkan medium nutrien agar dalampenangas air, dinginkan hingga suhu 50o C
↓
Setelah medium mencair, tuangkan medium pada cawan petri steril secara
aseptik, biarkan dingin dan memadat
↓
Ambil inokulum menggunakan ose tumpul, secara aseptik dan kumudian buat
goresan pada permukaan agar
↓
cawan petri yang telah ditempel etiket kemudian dibungkus dengan koran dan
dibalik, kemudian diinkubasi pada suhu 37o C
↓
Setelah diinkubasi akan tampak koloni yang terpisah-pisah
↓
Satu koloni kemungkinan berasal dari satu sel mikroba yang berkembangbiak
↓
Ambil secara aseptik dari satu koloni yang mewakili satu jenis mikroba, dan
disuspensikan dalam air steril
↓
Dilakukan pengecatan gram dan diamati di bawah mikroskop
↓
Pindahkan masing – masing hasil isolasi dalam medium nutrien agar miring
↓
Diinkubasi pada suhu yang sesuai selama 24-48 jam
↓
Diuji kembali kemurniannya dengan pengecatan gram
↓
Isolasi berhasil jika terdapat satu jenis mikroba saja
C. Pengamatan Pertumbuhan Mikroba
Ambil satu ose koloni bakteri Escherichia coli dari media NA
↓
Diinokulasi ke dalam media pertumbuhan NB pada labu erlenmeyer (jam ke-0)
↓
Ambil 1 ml suspensi bakteri dan dipindahkan dalam kuvet plastik (media tanpa
suspensi bakteri sebagai blangko diukur pada spektrofotometer dengan panjang
gelombang 600 nm, kemudian dibaca absorbansi kuvet yang berisi suspensi
bakteri)
↓
Pembacaan absorbansi diulangi tiap 3 jam selama 27 jam
↓
Dibuat grafik hubungan antara absorbansi versus waktu pengukuran, baik grafik
standar linear maupun skala logaritmik
IV. HASIL
Absorbansi
1,917
1,516
1,319
1,207
0,7
09.16
16.15
19.25
07.00
17.15
Gambar 1.2. Kurva Absorbansi Pertumbuhan Mikroba
Keterangan tabel:
Jam
Absorbansi
Ke-0 (09.16)
Ke-1 (16.15)
Ke-2 (19.25)
Ke-3 (07.00)
0,78 abs
1,207 abs
1,516 abs
1,917 abs
Ke-4 (17.15)
1,319 abs
Gambar 1.3. Tabel Absorbansi Pertumbuhan Mikroba
V. PEMBAHASAN
Praktikum kali ini berjudul ” Penanaman, Isolasi dan Pengamatan Pertumbuhan
Mikroba “, yang bertujuan agar setelah dilakukannya praktikum mahasiswa diharapkan
dapat melakukan penanaman dan isolasi mikroba serta mengamati pertumbuhan bakteri.
Isolasi mikroba merupakan pemisahan mikroba yang dikehendaki dari
lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium
buatan. Ada beberapa cara penanaman mikroba, tergantung pada tujuan penanaman
tersebut. Yang berdasarkan bentuk dan cara penanamannya dapat dibedakan menjadi tiga
macam yaitu biakan agar tegak, biakan agar miring, dan biakan cair.
Dalam proses pengisolasian mikroba ada beberapa hal penting yang perlu
diperhatikan antara lain sifat – sifat spesies mikroba yang ditanam, tempat hidup atau
asal mikroba tersebut, cara menanam dan cara menginokulasikannya, cara menguji
bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa biakan biakan murni dan sesuai dengan yang
dimaksud, serta cara memelihara biakan murni tersebut.
Dalam masa pertumbuhannya bakteri mengalami empat macam fase pertumbuhan
yaitu yang pertama fase lag ( awal ) merupakan fase dimana mikroorganisme beradaptasi
dan penyesuaiannya terhadap lingkungan baru, ciri dari fase lag adalah tidak adanya
peningkatan jumlah sel, yang ada hanyalah peningkatan ukuran sel. Yang kedua adalah
fase log ( fase eksponensial ) merupakan fase dimana mikroorganisme tumbuh dan
membelah
dalam
kecepatan
yang
maksimum,
tergantung
pada
genetika
mikroorganismenya, sifat media, dan kondisi pertumbuhan dari mikroorganismenya.
Yang ketiga adalah fase stasioner merupakan
proses berhentinya pertumbuhan
mikroorganisme dan terjadinya keseimbangan antara jumlah sel yang membelah dengan
jumlah sel yang mati, pada fase ini juga terjadi akumulasi produk buangan yang toksik.
Dan yang terakhir adalah fase kematian, merupakan proses dimana jumlah sel yang mati
meningkat, faktor penyebabnya adalah ketidaktersediannya nutrisi dan akumulasi produk
buangan yang toksik.
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini antara lain ose runcing yang
digunakan untuk mengambil mikroba biakan murni tertentu (Bacillus subtilis dan
Escherichia coli) yang akan ditanam pada medium agar tegak, ose tumpul yang
digunakan untuk mengambil mikroba biakan murni tertentu (Bacillus subtilis dan
Escherichia coli) yang akan ditanam pada medium agar miring, lampu spiritus digunakan
saat memanaskan ose dan bibir tabung berisi biakan murni maupun medium, teknik
tersebut dinamakan teknik aseptis, yaitu suatu teknik untuk menghambat pertumbuhan
atau mematikan mikroba, cawan petri yang digunakan sebagai tempat untuk menanam,
mengisolasi, dan mengamati mikroba, inkubator yang digunakan untuk meningkatkan
pertumbuhan mikroba, pipet ukur yang digunakan untuk mengambil suspensi bakteri
(Bacillus subtilis) yang akan diamati absorbansinya, kuvet plastik yang digunakan
sebagai tempat suspensi bakteri uji, dan spektrofotometer yang digunakan untuk
pengukuran pada saat asorbansi suspensi bakteri uji dan menggunakan panjang
gelombng 600 nm. Sementara bahan – bahan yang digunakan antara lain biakan murni
Bacillus subtilis dalam medium nutrien cair berumur 24 jam, biakan murni Escherichia
coli dalam medium nutrien cair berumur 24 jam, medium nutrien agar tegak, suspensi
mikroba / campuran mikroba, kultur bakteri Escherichia coli, 100 ml medium
pertumbuhan NB dalam 250 ml labu erlenmeyer, dan media tanpa bakteri sebagai
blanko.
Pada praktikum kali ini digunakan bakteri Bacillus subttilis dan Escherichia coli, hal
ini dikarenakan bakteri-bakteri tersebut mudah dicari, mudah dibiakkan dan proses
penanamannya tidak rumit. Perbedaan dari kedua bakteri tersebut yaitu pada bakteri
Bacillus subtilis mengarah pada bentuk batang, bersifat saprofilik, aerob dan membentuk
spora, termasuk bakteri gram positif, berada dalam saluran pencernaan manusia,
memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal dan asam
teichoic. Sedangkan pada bakteri Escherichia coli berbentuk batang pendek, termasuk
bakteri fakultatif, tidak menghasilkan spora, aerob yang dapat hidup dalam keadaan
anaerob, termasuk bakteri gram negatif, memiliki lapisan luar lipopolisakarida terdiri
atas membran dan lapisan peptidoglikan yang tipis terletak pada periplasma (diantara
lapisan luar dan membran sitoplasmik).
Langkah kerja yang pertama yaitu kita membersihkan meja yang akan digunakan
dalam praktikum dengan menggunakan alkohol, hal ini merupakan salah satu teknik
aseptis yang dilakukan agar segala pekerjaan yang akan kita lakukan dalam keadaan
yang steril dan terbebas dari zat yang kontaminan yang tidak diperlukan. Proses yang
pertama dilakukan adalah menanam mikroba aerob, pada proses penanaman ini
pembiakanya dilakukan pada tiga macam jenis medium yang pertama pada medium agar
tegak yang dilakukan dengan cara pertama sterilkan jarum ose runcing diatas nyala api
lampu spiritus, pada proses penanaman mikroba pada agar tegak ini dilakukan
menggunakan ose runcing, selain jarum ose yang dipanaskan bibir tabung yang berisi
bakteri juga harus disterilkan dengan cara mendekatkan bibir tabungnya ke api lampu
spiritus dan diputar- putar agar api lampu tersebut secara merata mengenai semua bibir
tabung, proses sterilisasi secara aseptis dalam praktikum ini sangat diperlukan karena
untuk membunuh mikroba yang kehadirannya tidak di dikehendaki dan dapat
menggangu proses yang sedang dilakukan, setelah itu mengambil biakan murni dengan
benar yaitu dengan cara membuka kapas penutup tabungnya menggunakan jari
kelingking tangan kanan serta tabung diposisikan agak miring dan dilakukan diatas nyala
lampu spiritus juga. Setelah itu mengambil inokulumdengan menggunakan ose runcing
yang sebelumnya telah disterilkan, sebelum tabung reaksi ditutup kembali tabung reaksi
harus disterilkan trlebih dahulu di atas nyala lampu spiritus. Kemudian mengambil
medium agar tegak, lalu lepas kapas penutup tabungnya kemudian tusuk medium agar
tegak tersebut dengan ose inokulasi hingga 1cm di bawah permukaan tabung secara hati hati, lalu panaskan bibir tabung dan tutup kembali. Setelah itu ose yang telah digunakan
tadi disterilkan lagi di atas nyala api lampu spiritus karena ose tersebut masih
mengandung bakteri dan ditakutkan jika tidak segera disterilkan akan lupa, sehingga
ketika ada teman yang secara tidak sengaja memegang atau bersinngungan dengan ujung
ose tersebut bakterinya akan berpindah juga ke tangan atau bagian tubuh yang lain yang
bersinggungan. Setelah itu beri etiket pada tabung tersebut bertuliskan “Penanaman
Bacillus subtilis atau Escherichia coli dalam medium agar tegak ( kelompok 3 golongan
2 ), karena bakteri yang digunakan dalam praktikum adalah bakteri Bacillus subtilis dan
bakteri Escherichia coli. Kemudian inkubasi pada suhu 37⁰C, proses pengininkubasian
ini dilakukan dengan tujuan untuk mempertahankan kondisi pertumbuhan mikroba
hingga mencapai kondisi maksimal pertumbuhannya, dilakukan pada suhu 37⁰C karena
suhu tersebut sama dengan suhu tubuh manusia sehingga memungkinkan bakteri untuk
tumbuh karena suhunya yang sesuai atau sama dengan suhu tubuh manusia.
Penanaman mikroba pada medium nutrien agar tegak ini tujuan untuk memperlama
hidup mikroba, untuk lebih mudah mengambil bakteri yang digunakan, dan untuk
mengamati koloni secara tunggal dan untuk membedakan bakterinya. Setelah dilakukan
inkubasi pada suhu 37⁰C selama 24 jam, didapatkan hasil pada medium agar yang
ditanam Bacillus subtilis, letak koloni berada di dasar dan di permukaan medium. Pada
medium agar yang ditanam Escherichia coli, letak koloni berada di permukaan medium.
Dari hasil ini dapat diambil kesimpulan sementara bahwa Bacillus subtilis dan
Escherichia coli dalam pertumbuhannya membutuhkan oksigen untuk bertahan hidup
sehingga pertumbuhan koloninya muncul pada permukaan medium dimana pada
permukaan medium memungkinkan kontak langsung koloni tersebut dengan udara yang
mengandung oksigen, karena Bacillus subtilis memang merupakan bakteri yang bersifat
aerob, sedangkan Escherichia coli merupakan bakteri yang bersifat anaerob anaerob
yang dapat tumbuh pada keadaan dimana tidak ada oksigen sama sekali sehingga letak
koloninya berada pada permukaan medium. Yang kedua yaitu menggunakan agar miring
sebagai tempat pembiakan cara penanamam yang dilakukan pada medium agar miring
sama seperti yang dilakukan pada agar tegak, hanya saja pada pembiakan agar miring ose
yang digunakan adalah ose tumpul, dan pada saat penanaman ose tumpul digoreskan
pada permukaan medium agar miring tersebut. Dan setelah di inkubasikan selama 24 jam
di dalam inkubator dengan suhu 370C pada kelompok kami didapatkan hasil pada biakan
murni bakteri Bacillus subtilis yaitu bakteri Bacillus subtilis berada di bekas goresan dan
didasar, pada biakan murni bakteri Escherichia coli yaitu bakteri Escherichia coli berada
di bekas goresan. Penanaman mikroba pada medium agar miring ini bertujuan untuk
melihat pertumbuhan mikroba. Adakalanya juga medium yang dipakai untuk pembiakan
pecah atau rusak hal ini mungkin dikarenakan pada saat penggoresan terlalu kuat
sehinnga ose tumpul yang digunakan masuk kedalam medium atau pada saat penusukan
tidak dilakukan dengan cara yang benar menyebabkan medium pecah tetapi medium
yang pecah tidak akan mengganggu pertumbuhan mikroba tetapi medium yang pecah
akan mengganggu pada saat proses perhitungan mikroba hal ini dikarenakan jika ada
mikroba yang tumbuh pada retakan medium tersebut akan sangat sulit saat dilakukan
perhitungan. Dan yang ketiga menggunakan medium cair sebagai tempat pembiakan dan
dilakukan dengan cara yang sama seperti pada pembiakan agar miring, dan juga
menggunakan ose yang sama yaitu ose tumpul tetapi pada saat pemberian bakteri
kedalam mediumnya dilakukan dengan cara menyinggungkan ujung ose tumpul yang
mengandung inokulum pada permukaan medium cair tersebut. Dan Setelah di
inkubasikan selama 24 jam di dalam inkubator dengan suhu 370C pada kelompok kami
mendapatkan hasil pada biakan murni bakteri Bacillus subtilis yaitu bakteri Bacillus
subtilis berada di permukaan, pada biakan murni bakteri Escherichia coli yaitu bakteri
Escherichia coli berada di dasar. Bacillus subtilis merupakan bakteri aerob, sehingga
bakteri tersebut akan dapat hidup apabila ada oksigen atau dapat dikatakan letaknya ada
dipermukaan, sedangkan bakteri Escherichia coli bersifat anaerob fakultatif yang dapat
hidup pada keadaan aerob dan anaerob, jadi bakteri Escherichia coli letaknya bisa ada
didasar atau di permukaan dari tabung biakan. Penanaman mikroba pada medium nutrien
cair ini bertujuan untuk melihat pertumbuhan mikroba dan pergerakan mikroba.
Proses kedua yang dilakukan adalah pengisolasian mikroba dengan cara goresan /
streaking plate. Yang dilakukan dengan cara yang pertama dilakukan menyiapkan
medium nutrien agar setelah itu medium di cairkan dengan cara di masukkan dalam
penangas air, lalu setelah medium mencair sempurna didinginkan hingga suhunya kurang
lebih 500 C, Kemudian setelah medium agak dingin dituangkan pada cawan petri steril
prosesini juga harus dilakukan dalam keadaan aseptik, setelah itu biarkan medium dingin
dan memadat. Setelah medium dingin dan memadat ambil inokulum menggunakan ose
tumpul yang sebelumnya telah disterilkan dengan cara dipanaskan di atas nyala api
lampu spiritus , setelah itu buat goresan di permukaan agar dan goresan yang membentuk
zig –zag.
Pada saat penggoresan tidak boleh terputus dengan kata lain harus berlanjut hal ini
dilakukan agar koloni yang nantinya terbentuk berlanjut dan tidak terputus sementara
penggoresan secara zig- zag yang dilakukan bertujuan untuk melihat pergerakan bakteri
yang sedang di biakkan. Setelah itu cawan petri diberi etiket dan dibungkus
menggunakan kertas koran atau kertas lain seperti misalnya fotocopy dengan ukuran F4,
kemudian diinkubasiakan pada suhu 370 C selama 24 jam.Dan setelah diinkubasikan
pada kelompok kami didapatkan hasil bahwa koloni tersebut berada dibekas goresan dan
ada juga yang berada di luar goresan.
Proses yang terakhir adalah dilakukannya pengamatan pertumbuhan mikroba dengan
cara yang pertama adalah mengambil satu ose koloni bakteri Escherichia coli dari media
NA menggunakan ose tumpul yang sebelumnya telah di sterilkan terlebih dahulu,
kemudia menginokulasikannya ke dalam media pertumbuhan NB pada labu erlenmeyer (
jam ke – 0 ), setelah itu mengambil1 ml suspensibakteri dan memindahkannyake dalam
kuvet plastik, dan media tanpa suspensi bakteri digunakan sebagai blanko diukur pada
spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm pengukuran pada spektofotometer
berguna untuk melihat kepekatan mikroba, kuvet yang dindingnya keruh diletakkan
disebelah luar, sedangkan bagian yang dindingnya transparan diletakkan menghadap
sinar UV, hal ini tidak boleh terbalik, karena pada dinding yang transparan akan lebih
mudah menangkap sinar UV tersebut, kemudian baca adsorbansi kuvet yang berisi
suspensi bakteri Escherichia coli, setelah itu diinkubasikan pada suhu 370 C dengan
tujuan seperti yang sudah di jelaskan diatas. Ulangi pembacaan absorbansi setiap 3 jam
sekali selama 27 jam, hal ini dilakukan untuk mengetahui kestabilan serta mengontrol
pertumbuhan
bakteri
setiap
jamnya
untuk
disesuaikan
dengan
setiap
fase
pertumbuhannya.
Dan kelompok kami mendapatkan hasil yaitu pada absorbansi pertama 0,78 yang
dilakukan pada pukul 09.16. Lalu pada absorbansi kedua yaitu 1,207 yang dilakukan
pada pukul 16.15, kemudian pada absorbansi ke tiga yaitu 1,516 yang dilakukan pada
pukul 19.25, kemudian pada absorbansi keempat yaitu 1,917 yang dilakukan pada pukul
07.00, absorbansi terakhir yang dilakukan pada pukul 17.15 yaitu 1,319.
Absorbansi
1,917
1,516
1,319
1,207
0,7
09.16
16.15
19.25
07.00
17.15
Gambar 1.2. Kurva Absorbansi Pertumbuhan Mikroba
Keterangan tabel:
Jam
Absorbansi
Ke-0 (09.16)
Ke-1 (16.15)
Ke-2 (19.25)
Ke-3 (07.00)
0,78 abs
1,207 abs
1,516 abs
1,917 abs
Ke-4 (17.15)
1,319 abs
Gambar 1.3. Tabel Absorbansi Pertumbuhan Mikroba
VI. KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat diambil dari praktikum yang telah dilakukan adalah :
1. Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa dapat melakukan penanaman dan isolasi
mikroba serta mengamati pertumbuhan bakteri.
2. Isolasi mikroba merupakan pemisahan mikroba yang dikehendaki dari lingkungannya
di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan.
3. Ada beberapa hal penting yang perlu diperhatikan pada saat pengisolasian mikroba
antara lain :
a) Sifat-sifat spesies mikroba yang akan di tanam.
b) Tempat hidup atau asal mikroba tersebut.
c) Cara menanam dan cara mengisolasikannya.
d) Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa biakan murni dan sesuai
dengan yang dimaksud.
e) Cara memelihara biakan murni.
4. Dalam masa pertumbuhannya bakteri mengalami empat macam fase pertumbuhan
yaitu :
a) Fase lag ( awal )
b) Fase log ( fase eksponensial )
c) Fase stasioner
d) Fase kematian
5. Pembiakan mikroba menggunakan medium nutrien agar miring bertujuan untuk
melihat pergerakan mikroba, dan pembiakan mikroba pada medium nutrien agar tegak
bertujuan untuk memperlama hidup mikroba dan melihat pertumbuhan mikroba,
sementara pembiakan pada medium nutrien cair bertujuan untuk melihat pertumbuhan
dan pergerakan mikroba.
6. B. subtilis merupakan bakteri aerob, sehingga bakteri tersebut akan dapat hidup
apabila ada oksigen atau dapat dikatakan letaknya ada dipermukaan, sedangkan
bakteri E. coli bersifat anaerob fakultatif yang dapat hidup pada keadaan aerob dan
anaerob, jadi bakteri E. coli letaknya bisa ada didasar atau di permukaan dari tabung
biakan.
7. Medium yang pecah atau rusak tidak akan menggangu proses pertumbuhan mikroba,
tetapi akan menggangu pada saat proses perhitungan karena jika ada mikroba yang
tumbuh pada retakan medium tersebut mikroba akan sangat sulit saat dihitung.
8. Dari praktikum kali ini didapatkan hasil absosbansi sebagai berikut :
Jam
Absorbansi
Ke-0 (09.16)
Ke-1 (16.15)
Ke-2 (19.25)
Ke-3 (07.00)
0,78 abs
1,207 abs
1,516 abs
1,917 abs
Ke-4 (17.15)
1,319 abs
VII. DAFTAR PUSTAKA
Dwijoseputro, D. 2010. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan . Gramedia Pustaka Utama : Jakarta
Michael Pelczar, dkk. 2008. Dasar – Dasar Mikrobiologi, Jakarta : Penerbit
Universitas Indonesia.
LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN VIROLOGI
P-3
PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA
Disusun Oleh:
Nama
: Zitta Afrida
NIM
: 1308010125
Golongan
: II
Kelompok : 3 B
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2013
P– 3
PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA
I.TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
1. Mengetahui cara – cara perhitungan jumlah mikroba, baik secara langsung maupun
secara tidak langsung.
2. Melakukan perhitungan jumlah mikroba yang ada pada suatu bahan.
II. ALAT DAN BAHAN
1. Menggunakan Spektrofotometer
A. Alat
1) Kuvet plastik
2) Pipet steril
3) Spektrofotometer
B. Bahan
1) Kultur suspensi bakteri E. coli dalam media NB umur 18 – 24 jam
2) Media NB tanpa bakteri sebagai blanko
3) Akuadest
2. Berdasarkan Total Plate Count
A. Alat
1) Cawan petri
2) Kapas steril
3) Gelas ukur
4) Tabung reaksi
5) Pipet tetes steril
B. Bahan
1) Sampel bahan ( air sumur ) yang akan ditentukan jumlah bakterinya
2) Medium nutrieb agar tegak
3) Medium tripton glukosa yeast agar tegak
4) Akuades steril
III. CARA KERJA
A. Menggunakan Spektrofotometer
Ambil 1 ml suspensi bakteri dan pindahkan ke dalam kuvet plastik
↓
Diencerkan bila perlu untuk mendapatkan OD 600 kurang dari 1
↓
Sampel dimasukkan kedalam kuvet
↓
Sampel diukur OD 600
↓
Dihitung densitas dari sel dengan menggunakan table
B. Berdasarkan Total Plate Count
Ambil 1 ml sampel
↓
1 ml sampel ditambah dengan 9 ml aquadest (tabung 1)
↓
1 ml suspense tabung 1 ditambah 9 ml aquadest (tabung 2)
↓
1 ml suspense tabung 2 ditambah 9 ml aquadest (tabung 3) dan seterusnya sampai
pengenceran 10‾
↓
Medium agar dipanaskan (diambil 10 ml)
↓
Campuran medium ditambahkan dengan suspense pengenceran dalam cawan petri
↓
Digoyangkan dengan arah angka 8 secara hati-hati
↓
Dibungkus dengan kertas lalu diinkubasi selama 24 jam
↓
Didinginkan dan dihitung koloni yang tumbuh pada masing-masing cawan petri
IV. HASIL
Berdasarkan Toyal Plate Count
Pengenceran 10-5 (rep 1)
Pengenceran 10-4 (rep 1)
Pengenceran 10-5 (rep 2)
Pengenceran 10-4 (rep 2)
A. Hasil Perhitungan
Jumlahkolonipadatiapcawan
Pengenceran
Air sumur
A = 236 + 271
10-4
10-4
Replikasi 1
Replikasi 2
10-4
236
271
10-5
165
140
= 236 x 104 + 271 x 104
2
= 507 x 104
2
= 253,5 x 104
B = 165 + 140
10-5
10-5
= 165 x 105 + 140 x 105
2
5
= 305 x 10
2
= 152,5 x 105
B
= 152,5 x 105
A
253,5 x 10-4
= 1525 x 104
253,5 x 104
Ket :
B >2 = A
A
= 6,01 CFU (coloning forming unit)
B
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN VIROLOGI
P-1
STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
Disusun Oleh:
Nama
: Zitta Afrida
NIM
: 1308010125
Golongan
: II
Kelompok : 3 B
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2013
P– 1
STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM
I. TUJUAN
1.
2.
3.
4.
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
Mengetahui tujuan dan cara-cara sterilisasi.
Melakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf.
Mengetahui penggunaan dan macam medium.
Membuat medium.
II. ALAT DAN BAHAN
1. Pembuatan Medium Nutrien Cair
A. Alat
1) Gelas beker
2) Batang pengaduk
3) Kapas
4) Tabung reaksi
5) Rak tabung reaksi
6) Autoklaf
B. Bahan
1) Ekstrak daging ( beff extract ) atau daging segar
2) Pepton
3) NaCL
4) Akuadest
2. Pembuatan Medium Nurtien Agar
A. Alat
1) Gelas beker
2) Batang pengaduk
3) Kapas
4) Tabung reaksi
5) Rak tabung reaksi
6) Autoklaf
B. Bahan
1) Ekstrak daging
2) Pepton
3) Agar – agar
4) Akuadest
3. Pembuatan Medium Agar Darah
A. Alat
1) Labu erlenmeyer
2) Autoklaf
3) Cawan petri
B. Bahan
a) Media TSA 40 gr
b) Darah domba 50 ml
c) Akuadest 1000 ml
III. CARA KERJA
A. Sterilisasi Dengan Autoklaf
Tuangkan air secukupnya ke dalam sterilisator
↓
Tata alat - alat dan bahan - bahan yang akan disterilkan
↓
Letakkan tutup sterilisator pada tubuh sterilisator
↓
Buka klep pengaman
↓
Tutup klep pengaman apabila uap air mulai keluar dengan deras
↓
Pertahankan tekanan 1 atm selama 15 – 20 menit
↓
Matikan pemanasan dan tunggu sampai tekanan nol
↓
Buka pengatur klep
↓
Buang air yang bersisa dan keringkan semua bagiannya
↓
Saat mencuci tutupnya jaga agar alat pengukur tekanan tidak terkena air
B. Pembuatan Medium
a. Pembuatan Medium Nutrien
Larutkan 3 gr ekstrak daging
↓
Ditimbang pepton sebanyak 5 gram
↓
Dilarutkan kedua bahan (ekstrak daging dan pepton) dalam 1000 ml aquadest
sampai homogen
↓
Larutan dipanaskan dalam penangas air sampai larutan mendidih selama 5
menit
↓
Larutan didinginkan, kemudian dinetralkan dengan menggunakan NaOH 1 N
sedikit demi sedikit sampai mencapai pH 7,2
(cek pH dengan menggunakan pH meter)
↓
Aquadest yang hilang selama pemanasan diganti dengan aquadest sehingga
volumenya tepat 1000 ml kembali
↓
Larutan medium tersebut disaring dengan menggunakan kapas atau kain
penyaring yang bersih
↓
Disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada tekanan 2 atm, suhu 121⁰C
selama 20 menit
b. Pembuatan Medium Nurtien Agar
Disiapkan medium nutrien cair
↓
Timbang agar - agar sebanyak 15 – 20 gr untuk setiap 1 liter akuadest
↓
Masukkan agar - agar kedalam medium dan kemudian dipanaskan selama 20 - 30
menit
↓
Volume medium yang hilang selama pemanasan dikembalikan ke volume semula,
bila perlu dilakukan penyesuaian pH
↓
Dalam keadaan panas, medium disaring dengan kapas atau kain saring yang bersih
↓
Medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril, untuk medium agar miring
diisikan 5 ml dan untuk medium agar tegak diisikan 10 ml
↓
Disterilkan pada autoklaf dengan tekanan 2 atm, suhu 121⁰C, selama 20 menit
(untuk membuat agar miring, setela sterilisasi tabung diletakkan miring dengan
sudut 30⁰ terhadap bidang datar dan dibiarkan sampai medium menjadi padat,
sedangkan untuk medium agar tegak, tabung reaksi diletakkan tegak)
c. Pembuatan Medium Agar Darah
Larutkan 4 gr TSA dalam 100 ml akuadest
↓
Kemudian disterilkan menggunakan autoklaf
↓
Siapkan darah domba sebanyak 5 ml
↓
Campurkan darah ke dalam media TSA
↓
Tuang ke dalam cawan petri sebanyak 5 ml
↓
Tunggu hingga memadat dan uap panas menghilang
↓
Kemudian simpan dalam lemari pendingin dan dalam keadaan terbalik
IV. HASIL
A. Gambar autoklaf beserta bagian-bagiannya
Keterangan gambar :
1. Tombol pengatur waktu mundur (timer)
2. Katup pengeluaran uap
3. pengukur tekanan
4. kelep pengaman
5. Tombol on-off
6. Termometer
7. air Lempeng sumber panas
8. Aquades (dH2O)
9. Sekrup pengaman
10. batas penambahan
B. Gambar medium yang dibuat
V. PEMBAHASAN
Praktikum kali ini berjudul ” STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM “,yang
bertujuan agar setelah dilakukannya praktikum mahasiswa diharapkan dapat megetahui
tujuan dan cara - cara sterilisasi, dapat melakukan sterilisasi dengan menggunakan
autoklaf, mengetahui penggunaan dan macam medium, serta dapat membuat medium.
Sterilisasi sendiri dalam mikrobiologi merupakan proses penghilangan semua jenis
organisme hidup, dalam hal ini adalah mikroorganisme ( protozoa, fungi, bakteri,
mycoplasma, virus ) yang terdapat pada / di suatu benda. Sterilisasi didesain untuk
membunuh atau menghilangkan mikroorganisme.Target suatu metode inaktivasi
tergantung dari metode dan tipe mikroorganismenya, yaitu tergantung dari asam nukleat,
protein, atau membran mikroorganisme tersebut. Alat - alat dan bahan - bahan yang
digunakan dalam bidang mikrobiologi harus steril, yang berarti pada bahan ataupun
peralatan tersebut tidak terdapat mikrobayang kehadirannya tidak diharapkan, karena
dapat mengganggu atau merusak medium atau proses yang sedang dikerjakan.Sterilisasi
sendiri dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu sterilisasi secara fisik dengan
menggunakan pemanasan , sinar X, sinar ultraviolet dan sebagainya,kemudian sterilisasi
secara kimia dengan menggunakan desinfektan, fenol, bisfenol, halogen, klorin,alkohol,
aldehid, senyawa merkuri, etilen oksida, peroksigen dan sebagainya serta sterilisasi secara
mekanik yaitu filtrasi atau penyaringan. Tetapi metode atau cara sterilisasi yang lazim
digunakan adalah dengan menggunakan pemanasan yang dibagi menjadi dua jenis yang
pertama yaitu sterilisasi panas kering yaitu metode sterilisasai panas tanpa kelembaban
( tanpa penggunaan uap air ),yang berfungsi untuk mematikan organisme dengan cara
mengoksidasi komponen sel ataupun mendenaturasi enzim. Ada dua metode sterilisasai
panas kering yaitu dengan insinerasi ( incineration ) yaitu pembakaran dengan
menggunakan api dari bunsen dengan temperatur sekitar 350 o C serta dengan udara panas
oven yang lebih sederhana dan lebih murah dengan temperatur sekitar 160 – 170o C. Yang
kedua yaitu sterilisasi panas basah menggunakan uap air dengan menggunakan
autoklaf,alat serupa pressure cooker dengan pengatur tekanan dan klep pengaman, prinsip
autoklaf sendiri adalah terjadinya koagulasi yang lebih cepat dalam keadaan basah
dibandingkan dalam keadaan kering. Proses sterilisasi dengan autoklaf ini dapat
membunuh mikroorganisme dengan cara mendenaturasi atau memgkoagulasi protein pada
enzim dan membran selmikroorganisme. Proses ini juga dapat membunuh endospora
bakteri. Terdapat tiga tipe autoklaf yaitu, portable bench top, gravity displacement, dan
multicycle porous – load .
Medium juga sangat diperlukan karena medium digunakan untuk mengembangbiakan
milroorganisme seperti kapang, khamir, jamur, bakteri ataupu yang lainnya. Medium
adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan
mikroba,selain itu dapat puladigunakan untuk isolasi, memperbanyak, pengujian sifat sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba. Agar mikroba dapat tumbuh dan
berkembangbiak dengan baik di dalam suatu medium.maka medium tersebut harus
memenuhi syarat antara lain medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah
digunakan oleh mikroba, medium harus mempunyai tekanan osmosis,tegangan muka dan
pH yang sesuai, meddium tidak mengandung zat – zat yang menghambat pertumbuhan
mikroba, serta medium harus steril. Pada praktikum yang dilakuka kali ini terdapat
beberapa jenis medium yang dibuat antara lain medium nutrien cair dengan menggunakan
ekstrak daging, medium nutrien agar tegak yang digunakan untuk melihat pertumbuhan
mikroba, medium nutrien agar miring yang digunakan untuk melihat pergerakan mikroba,
medium nutrien agar cawan yang digunakan untuk proses perhitungan mikroba serta
medium nutrien agar darah( yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri Neiserria dan
Streptococcus, untuk menumbuhkan bakteri heterotrof, untuk membedakan bakteri
berdasarkan sifatnya bisa atau tidaknya bakteri tersebut menghemolisis darah ) tetapi
medium nutrien agar darah tidak dibuat dalam praktikum kali ini. Dan kelompok kami
hanya membuat medium nutrien agar miring saja.
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah tabung reaksi sebagai tempat
media pertumbuhan mikroba dalam bentuk medium tegak ataupun medium miring, beker
gelas yang digunakan untuk melarutkan bahan, batang pengaduk yang digunakan untuk
membantu dalam pelarutan bahan, kapas yang digunakan untuk menutup mulut tabung
reaksi yang sudah berisi larutan media untuk pertumbuhan bakteri, rak tabung reaksi yang
digunakan sebagai tempat tabung reaksi, serta autoklaf yang digunakan untuk
mensterilkan medium yang dibuat. Sementara bahan- bahan yang digunakan antara lain
campuran antara ekstrak daging dengan agar - agar yang berfungsi sebagai sumber
karbohidrat yang mengandung senyawa nitrogen yang banyak dibutuhkan oleh mikrona
dan agar - agar yang berfungsi untuk memadatkan medium, NaCL yang berfungsi sebagai
sumber mineral, pepton berfungsi untuk mempercepat pertumbuhan mikroba karena
mengandung banyak N2, dan akuadest yang berfungsi sebagai pelarut.
Langkah kerja yang pertama yaitu kita membersihkan meja yang akan digunakan
dalam praktikum dengan menggunakan alkohol, hal ini merupakan salah satu teknik
aseptis yang dilakukan agar segala pekerjaan yang akan kita lakukan dalam keadaan yang
steril dan terbebas dari zat yang kontaminan yang tidak diperlukan. Yang pertama
dilakukan adalah pembuatan medium nutrien agar miring yang dibuat dengan cara
memasukkan 1,2 gr Na ke dalam gelas beker kemudian ditambahkan akuadest sebanyak
60 ml dan diaduk sampai semua Na larut dan benar - benar homogen, setelah itu
menyiapkan tabung reaksi sebanyak 12 buah, lalu masukkan sebanyak 5 ml larutan Na ke
dalam tiap - tiap tabung reaksi yang telah disiapkan, setelah semua tabung reaksi terisi
tutup tabung reaksi menggunakan kapas hingga benar - banar rapat sehingga tidak ada
udara yang dapat masuk ke dalam tabung reaksi hal ini dilakukan agar medium tetap
terjaga kemurniannya karena apabila tidak ditutup dengan rapat udara dapat masuk
sedangkan udara mengandung banyak mikroorganisme dan kontaminan yang apabila
masuk ke dalam tabung reaksi dapat mempengaruhi kemurnian dari medium yang dibuat
serta dapat merusak medium,setelah itu ke 12 tabung tersebut dimasukkan ke dalam
plastik dan diikat kencang menggunakan karet gelang.
Selanjutnya adalah pembuatan medium nutrien agar tegak yang dibuat dengan cara
memasukkan 2,4 gr Na ke dalam gelas beker kemudian ditambahkan akuadest sebanyak
120 ml dan diaduk sampai semua Na larut dan benar - benar homogen, setelah itu
menyiapkan tabung reaksi sebanyak 12 buah, lalu masukkan sebanyak 10 ml larutan Na ke
dalam tiap -tiap tabung reaksi yang telah disiapkan, setelah semua tabung reaksi terisi
tutup tabung reaksi menggunakan kapas hingga benar - benar rapat tujuannya seperti yang
telah dijelaskan pada proses sebelumya,setelah itu ke 12 tabung tersebut dimasukkan ke
dalam plastik dan diikat kencang menggunakan karet gelang.
Setelah itu pembuatan medium NB yang dibuat dengan cara memasukkan 1,56 gr NB
ke dalam erlenmeyer kemudian ditambahkan akuadest sebanyak 120 ml dan diaduk hingga
homogen, setelah itu menyiapkan tabung reaksi sebanyak 12 buah, lalu masukkan
sebanyak 10 ml larutan NB kedalam tiap - tiap tabung reaksi yang telah disiapkan, setelah
semua tabung reaksi terisi tutup tabung reaksi menggunakan kapas hingga benar - benar
rapat tujuannya seperti yang sudah dijelaskan diatas, setelah itu ke 12 tabung tersebut
dimasukkan ke dalam plastik dan diikat kencang menggunakan karet gelang.
Setelah itu pembuatan medium nutrien cawan yang dibuat dengan cara memasukkan
3,6 gr Na kedalam gelas beker kemudian ditambahkan akuadest sebanyak 180 ml dan
diaduk hingga homogen,setelah itu menyiapkan tabung reaksi sebanyak 12 buah, lalu
masukkan sebanyak 15 ml larutan Na ke dalam tiap - tiap tabung reaksi yang telah
disiapkan,setelah semua tabung reaksi terisi tutup tabung reaksi menggunakan kapas
hingga benar - benar tertutup rapat tujuannya seperti yang sudah dijelaskan di atas, setelah
itu ke 12 tabung reaksi tersebut dimasukkan ke dalam plastik dan diikat kencang dengan
menggunakan karet gelang.
Selanjutnya adalah pembuatan medium TSA ( Tripton Soya Agar ) yang dibuat dengan
cara memasukkan 3,6 gr TSA ke dalam erlenmeyer 250 ml kemudian ditambahkan
akuadest sebanyak 90 ml, kemudian tutup erlenmeyer menggunakan kertas dan diikat
menggunakan karet gelang. Komposisi TSA sendiri antara lain glukosa sebagai sumber
gula, kasein sebagai sumber protein, kedelai sebagai sumber nutrisi seperti fungsi dari
ekstrak daging, agar berfungsi untuk memadatkan medium, NaCL sebagai sumber mineral,
dan fosfat sebagai penyangga.
Selanjutnya pembuatan medium NB yang dibuat dengan cara memasukkan 3,9 gr NB
ke dalam gelas beker, kemudian ditambahkan akuadest sebanyak 300 ml, kemudian
menyiapkan erlenmeyer sebanyak 6 buah, lalu masukkan sebanyak 50 ml larutan NB ke
dalam tiap - tiap tabung reaksi, setelah itu tutup semua erlenmeyer menggunakan kertas
dan diikat menggunakan karet gelang.
Setelah semua medium selesai dibuat kemudian disterilkan dengan menggunakan
autoklaf. Autoklaf adalah alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu
benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (121 0C, 15 lbs) selama kurang
lebih 15 menit. Penurunan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh
mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah
yang akan membunuh microorganisme. Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh
endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap
pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Pada spesies yang sama, endospora dapat bertahan
pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh sel vegetatif bakteri tersebut. Endospora
dapat dibunuh pada suhu 100 °C, yang merupakan titik didih air pada tekanan atmosfer
normal. Pada suhu 121 °C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit, dimana sel
vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu
65 °C.Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf
mencapai 121 °C. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas
pada bagian dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu
pemanasan total untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 °C untuk waktu 1015 menit. Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume besar akan
diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk
mencapai suhu sterilisasi.
VI. KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat diambil dari praktikum yang telah dilakukan adalah :
1. Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa dapat:
a. Mengetahui tujuan dan cara-cara sterilisasi.
b. Melakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf.
c. Mengetahui penggunaan dan macam medium.
d. Membuat medium.
2. Sterilisasai dalam mikrobiologi merupakan proses penghilangan semua jenis
organisme hidup, dalam hal ini adalah mikroorganisme ( protozoa, fungi, bakteri,
mycoplasma, dan virus ) yang terdapat di atau pada suatu benda.
3. Sterilisasi dapat dilakukan dengan beberapa cara antara lain :
a. Sterilisasi secara fisik
Metode sterilisasi panas
Metode sterilisasi dengan penyaringan
Metode sterilisasi dengan radiasi
Metode pasteurisasi
Metode sterilisasi dengan pengeringan
b. Sterilisasi secara kimia
c. Sterilisasi secara mrkanik
4. Metode sterilisasi yang digunakan dalam praktikum adalah metode sterilasi panas
basah menggunakan autoklaf dengan temperatur diatas 100o C
5. Prinsip kerja autoklaf adalah terjadinya koagulasi yang lebih cepat dalam keadaan
basah dibandingkan dalam keadaan kering, proses sterilisasi dengan autoklaf ini dapat
membunuh mikroorganisme dengancara mendenaturasi atau mengkoagulasi protein
pada enzim dan membran sel mikroorganisme.
6. Medium adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai untuk
menumbuhkan mikroba,selain itu dapat puladigunakan untuk isolasi, memperbanyak,
pengujian sifat - sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba.
7. Syarat - syarat medium yang baik :
a. Medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh
mikroba.
b. Medium harus mempunyai tekanan osmosis,tegangan muka dan pH yang
sesuai.
c. Meddium tidak mengandung zat – zat yang menghambat pertumbuhan
mikroba.
d. Medium harus steril.
8. Pada praktikum kali ini medium yang dibuat antara lain :
Medium nutrien agar cair dengan menggunakan ekstrak daging
Medium nutrien agar tegak
Medium nutrien agar miring
Medium NB
Medium TSA ( Tripton Soya Agar )
Medium nutrien cawan
9. Kelompok kami hanya membuat satu macam jenis medium yaitu medium agar
miring.
VII. DAFTAR PUSTAKA
Agus Syahrurachman, dkk. 1993 Buku Ajar Mikroboilogi Kedokteran. Jakarta :
Binarupa Aksara.
Dwirdjo, Seputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.
Michael Pelczar, dkk. 2008. Dasar – Dasar Mikrobiologi, Jakarta : Penerbit
Universitas Indonesia.
Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta: Erlangga.
LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN VIROLOGI
P-2
PENANAMAN, ISOLASI DAN PENGAMATAN
PERTUMBUHAN MIKROBA
Disusun Oleh:
Nama
: Zitta Afrida
NIM
: 1308010125
Golongan
: II
Kelompok : 3 B
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2013
P– 2
PENANAMAN, ISOLASI DAN PENGAMATAN PERTUMBUHAN MIKROBA
I.TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat melakukan isolasi
terhadap mikroba seta mengamati pertumbuhan bakteri.
II. ALAT DAN BAHAN
1. Menanam mikroba aerob
A. Alat
1) Ose tumpul
2) Ose runcing
3) Lampu spiritus
B. Bahan
1) Biakan murni Bacillus subtilis dalam medium nutrien cair umur 24 jam.
2) Biakan murni Escherichia coli dalam medium nutrien cair umur 24 jam.
3) Medium nutrien agar tegak, medium nutrien agar miring, dan medium
nutrien cair.
2. Isolasi mikroba
A. Alat
1) Cawan petri steril
B. Bahan
1) Suspensi mikroba / campuran mikroba
2) Medium nutrien agar tegak
3. Pengamatan pertumbuhan mikroba
A. A lat
1) Inkubator 37o C dengan shaker
2) Pipet steril
3) Spektrofotometer
4) Kuvet plastik
B. Bahan
1) Kultur bakteri E. coli dari media NA.
2) 100 ml medium pertumbuhan NB dalam 250 ml labu erlenmeyer.
3) Media tanpa bakteri sebagai blanko.
III. CARA KERJA
A. Menanam mikroba aerob
a) Biakan agar tegak
Sterilkan jarum ose runcing diatas nyala api lampu spiritus
↓
Ambil biakan murni dengan benar dan dalam keadaan aseptis diatas nyala
lampu spiritus
↓
Ambil inokulum menggunakan jarum ose runcing, panaskan bibir tabung lalu
tutup kembali
↓
Ambil medium aga tegak, lepas kapas penutupnya kemudian tusuk medium agar
tegak tersebut dengan ose inokulasi hingga 1cm di bawah permukaan tabung
secara hati - hati, panaskan bibir tabung lalu tutup kembali
↓
Pijarkan lampu ose sebelum diletakkan kembali
↓
Beri etiket pada tabung reaksi bertuliskan nama bakteri
↓
Diinkubasikan pada suhu 37o C
b) Biakan agar miring
Sterilkan jarum ose tumpul diatas nyala api lampu spiritus
↓
Ambil biakan murni dengan benar dan dalam keadaan aseptis diatas nyala
lampu spiritus
↓
Ambil inokulum menggunakan jarum ose tumpul, panaskan bibir tabung lalu
tutup kembali
↓
Ambil medium aga miring, lepas kapas penutupnya kemudian goreskan jarum
ose tumpul pada permukaan medium agar miring tersebut secara hati - hati,
panaskan bibir tabung lalu tutup kembali
↓
Pijarkan lampu ose sebelum diletakkan kembali
↓
Beri etiket pada tabung reaksi bertuliskan nama bakteri
↓
Diinkubasikan pada suhu 37o C
c) Biakan cair
Sterilkan jarum ose runcing diatas nyala api lampu spiritus
↓
Ambil biakan murni dengan benar dan dalam keadaan aseptis diatas nyala
lampu spiritus
↓
Ambil inokulum menggunakan jarum ose runcing, panaskan bibir tabung lalu
tutup kembali
↓
Ambil medium agar cair, lepas kapas penutupnya kemudian singgungkan ujung
ose tumpul yang mengandung inokulum pada permukaan medium agar cair
secara hati - hati, panaskan bibir tabung lalu tutup kembali
↓
Pijarkan lampu ose sebelum diletakkan kembali
↓
Beri etiket pada tabung reaksi bertuliskan nama bakteri
↓
Diinkubasikan pada suhu 37o C
B. Isolasi Mikroba
Cara Goresan ( Streaking plate )
Cairkan medium nutrien agar dalampenangas air, dinginkan hingga suhu 50o C
↓
Setelah medium mencair, tuangkan medium pada cawan petri steril secara
aseptik, biarkan dingin dan memadat
↓
Ambil inokulum menggunakan ose tumpul, secara aseptik dan kumudian buat
goresan pada permukaan agar
↓
cawan petri yang telah ditempel etiket kemudian dibungkus dengan koran dan
dibalik, kemudian diinkubasi pada suhu 37o C
↓
Setelah diinkubasi akan tampak koloni yang terpisah-pisah
↓
Satu koloni kemungkinan berasal dari satu sel mikroba yang berkembangbiak
↓
Ambil secara aseptik dari satu koloni yang mewakili satu jenis mikroba, dan
disuspensikan dalam air steril
↓
Dilakukan pengecatan gram dan diamati di bawah mikroskop
↓
Pindahkan masing – masing hasil isolasi dalam medium nutrien agar miring
↓
Diinkubasi pada suhu yang sesuai selama 24-48 jam
↓
Diuji kembali kemurniannya dengan pengecatan gram
↓
Isolasi berhasil jika terdapat satu jenis mikroba saja
C. Pengamatan Pertumbuhan Mikroba
Ambil satu ose koloni bakteri Escherichia coli dari media NA
↓
Diinokulasi ke dalam media pertumbuhan NB pada labu erlenmeyer (jam ke-0)
↓
Ambil 1 ml suspensi bakteri dan dipindahkan dalam kuvet plastik (media tanpa
suspensi bakteri sebagai blangko diukur pada spektrofotometer dengan panjang
gelombang 600 nm, kemudian dibaca absorbansi kuvet yang berisi suspensi
bakteri)
↓
Pembacaan absorbansi diulangi tiap 3 jam selama 27 jam
↓
Dibuat grafik hubungan antara absorbansi versus waktu pengukuran, baik grafik
standar linear maupun skala logaritmik
IV. HASIL
Absorbansi
1,917
1,516
1,319
1,207
0,7
09.16
16.15
19.25
07.00
17.15
Gambar 1.2. Kurva Absorbansi Pertumbuhan Mikroba
Keterangan tabel:
Jam
Absorbansi
Ke-0 (09.16)
Ke-1 (16.15)
Ke-2 (19.25)
Ke-3 (07.00)
0,78 abs
1,207 abs
1,516 abs
1,917 abs
Ke-4 (17.15)
1,319 abs
Gambar 1.3. Tabel Absorbansi Pertumbuhan Mikroba
V. PEMBAHASAN
Praktikum kali ini berjudul ” Penanaman, Isolasi dan Pengamatan Pertumbuhan
Mikroba “, yang bertujuan agar setelah dilakukannya praktikum mahasiswa diharapkan
dapat melakukan penanaman dan isolasi mikroba serta mengamati pertumbuhan bakteri.
Isolasi mikroba merupakan pemisahan mikroba yang dikehendaki dari
lingkungannya di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium
buatan. Ada beberapa cara penanaman mikroba, tergantung pada tujuan penanaman
tersebut. Yang berdasarkan bentuk dan cara penanamannya dapat dibedakan menjadi tiga
macam yaitu biakan agar tegak, biakan agar miring, dan biakan cair.
Dalam proses pengisolasian mikroba ada beberapa hal penting yang perlu
diperhatikan antara lain sifat – sifat spesies mikroba yang ditanam, tempat hidup atau
asal mikroba tersebut, cara menanam dan cara menginokulasikannya, cara menguji
bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa biakan biakan murni dan sesuai dengan yang
dimaksud, serta cara memelihara biakan murni tersebut.
Dalam masa pertumbuhannya bakteri mengalami empat macam fase pertumbuhan
yaitu yang pertama fase lag ( awal ) merupakan fase dimana mikroorganisme beradaptasi
dan penyesuaiannya terhadap lingkungan baru, ciri dari fase lag adalah tidak adanya
peningkatan jumlah sel, yang ada hanyalah peningkatan ukuran sel. Yang kedua adalah
fase log ( fase eksponensial ) merupakan fase dimana mikroorganisme tumbuh dan
membelah
dalam
kecepatan
yang
maksimum,
tergantung
pada
genetika
mikroorganismenya, sifat media, dan kondisi pertumbuhan dari mikroorganismenya.
Yang ketiga adalah fase stasioner merupakan
proses berhentinya pertumbuhan
mikroorganisme dan terjadinya keseimbangan antara jumlah sel yang membelah dengan
jumlah sel yang mati, pada fase ini juga terjadi akumulasi produk buangan yang toksik.
Dan yang terakhir adalah fase kematian, merupakan proses dimana jumlah sel yang mati
meningkat, faktor penyebabnya adalah ketidaktersediannya nutrisi dan akumulasi produk
buangan yang toksik.
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini antara lain ose runcing yang
digunakan untuk mengambil mikroba biakan murni tertentu (Bacillus subtilis dan
Escherichia coli) yang akan ditanam pada medium agar tegak, ose tumpul yang
digunakan untuk mengambil mikroba biakan murni tertentu (Bacillus subtilis dan
Escherichia coli) yang akan ditanam pada medium agar miring, lampu spiritus digunakan
saat memanaskan ose dan bibir tabung berisi biakan murni maupun medium, teknik
tersebut dinamakan teknik aseptis, yaitu suatu teknik untuk menghambat pertumbuhan
atau mematikan mikroba, cawan petri yang digunakan sebagai tempat untuk menanam,
mengisolasi, dan mengamati mikroba, inkubator yang digunakan untuk meningkatkan
pertumbuhan mikroba, pipet ukur yang digunakan untuk mengambil suspensi bakteri
(Bacillus subtilis) yang akan diamati absorbansinya, kuvet plastik yang digunakan
sebagai tempat suspensi bakteri uji, dan spektrofotometer yang digunakan untuk
pengukuran pada saat asorbansi suspensi bakteri uji dan menggunakan panjang
gelombng 600 nm. Sementara bahan – bahan yang digunakan antara lain biakan murni
Bacillus subtilis dalam medium nutrien cair berumur 24 jam, biakan murni Escherichia
coli dalam medium nutrien cair berumur 24 jam, medium nutrien agar tegak, suspensi
mikroba / campuran mikroba, kultur bakteri Escherichia coli, 100 ml medium
pertumbuhan NB dalam 250 ml labu erlenmeyer, dan media tanpa bakteri sebagai
blanko.
Pada praktikum kali ini digunakan bakteri Bacillus subttilis dan Escherichia coli, hal
ini dikarenakan bakteri-bakteri tersebut mudah dicari, mudah dibiakkan dan proses
penanamannya tidak rumit. Perbedaan dari kedua bakteri tersebut yaitu pada bakteri
Bacillus subtilis mengarah pada bentuk batang, bersifat saprofilik, aerob dan membentuk
spora, termasuk bakteri gram positif, berada dalam saluran pencernaan manusia,
memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal dan asam
teichoic. Sedangkan pada bakteri Escherichia coli berbentuk batang pendek, termasuk
bakteri fakultatif, tidak menghasilkan spora, aerob yang dapat hidup dalam keadaan
anaerob, termasuk bakteri gram negatif, memiliki lapisan luar lipopolisakarida terdiri
atas membran dan lapisan peptidoglikan yang tipis terletak pada periplasma (diantara
lapisan luar dan membran sitoplasmik).
Langkah kerja yang pertama yaitu kita membersihkan meja yang akan digunakan
dalam praktikum dengan menggunakan alkohol, hal ini merupakan salah satu teknik
aseptis yang dilakukan agar segala pekerjaan yang akan kita lakukan dalam keadaan
yang steril dan terbebas dari zat yang kontaminan yang tidak diperlukan. Proses yang
pertama dilakukan adalah menanam mikroba aerob, pada proses penanaman ini
pembiakanya dilakukan pada tiga macam jenis medium yang pertama pada medium agar
tegak yang dilakukan dengan cara pertama sterilkan jarum ose runcing diatas nyala api
lampu spiritus, pada proses penanaman mikroba pada agar tegak ini dilakukan
menggunakan ose runcing, selain jarum ose yang dipanaskan bibir tabung yang berisi
bakteri juga harus disterilkan dengan cara mendekatkan bibir tabungnya ke api lampu
spiritus dan diputar- putar agar api lampu tersebut secara merata mengenai semua bibir
tabung, proses sterilisasi secara aseptis dalam praktikum ini sangat diperlukan karena
untuk membunuh mikroba yang kehadirannya tidak di dikehendaki dan dapat
menggangu proses yang sedang dilakukan, setelah itu mengambil biakan murni dengan
benar yaitu dengan cara membuka kapas penutup tabungnya menggunakan jari
kelingking tangan kanan serta tabung diposisikan agak miring dan dilakukan diatas nyala
lampu spiritus juga. Setelah itu mengambil inokulumdengan menggunakan ose runcing
yang sebelumnya telah disterilkan, sebelum tabung reaksi ditutup kembali tabung reaksi
harus disterilkan trlebih dahulu di atas nyala lampu spiritus. Kemudian mengambil
medium agar tegak, lalu lepas kapas penutup tabungnya kemudian tusuk medium agar
tegak tersebut dengan ose inokulasi hingga 1cm di bawah permukaan tabung secara hati hati, lalu panaskan bibir tabung dan tutup kembali. Setelah itu ose yang telah digunakan
tadi disterilkan lagi di atas nyala api lampu spiritus karena ose tersebut masih
mengandung bakteri dan ditakutkan jika tidak segera disterilkan akan lupa, sehingga
ketika ada teman yang secara tidak sengaja memegang atau bersinngungan dengan ujung
ose tersebut bakterinya akan berpindah juga ke tangan atau bagian tubuh yang lain yang
bersinggungan. Setelah itu beri etiket pada tabung tersebut bertuliskan “Penanaman
Bacillus subtilis atau Escherichia coli dalam medium agar tegak ( kelompok 3 golongan
2 ), karena bakteri yang digunakan dalam praktikum adalah bakteri Bacillus subtilis dan
bakteri Escherichia coli. Kemudian inkubasi pada suhu 37⁰C, proses pengininkubasian
ini dilakukan dengan tujuan untuk mempertahankan kondisi pertumbuhan mikroba
hingga mencapai kondisi maksimal pertumbuhannya, dilakukan pada suhu 37⁰C karena
suhu tersebut sama dengan suhu tubuh manusia sehingga memungkinkan bakteri untuk
tumbuh karena suhunya yang sesuai atau sama dengan suhu tubuh manusia.
Penanaman mikroba pada medium nutrien agar tegak ini tujuan untuk memperlama
hidup mikroba, untuk lebih mudah mengambil bakteri yang digunakan, dan untuk
mengamati koloni secara tunggal dan untuk membedakan bakterinya. Setelah dilakukan
inkubasi pada suhu 37⁰C selama 24 jam, didapatkan hasil pada medium agar yang
ditanam Bacillus subtilis, letak koloni berada di dasar dan di permukaan medium. Pada
medium agar yang ditanam Escherichia coli, letak koloni berada di permukaan medium.
Dari hasil ini dapat diambil kesimpulan sementara bahwa Bacillus subtilis dan
Escherichia coli dalam pertumbuhannya membutuhkan oksigen untuk bertahan hidup
sehingga pertumbuhan koloninya muncul pada permukaan medium dimana pada
permukaan medium memungkinkan kontak langsung koloni tersebut dengan udara yang
mengandung oksigen, karena Bacillus subtilis memang merupakan bakteri yang bersifat
aerob, sedangkan Escherichia coli merupakan bakteri yang bersifat anaerob anaerob
yang dapat tumbuh pada keadaan dimana tidak ada oksigen sama sekali sehingga letak
koloninya berada pada permukaan medium. Yang kedua yaitu menggunakan agar miring
sebagai tempat pembiakan cara penanamam yang dilakukan pada medium agar miring
sama seperti yang dilakukan pada agar tegak, hanya saja pada pembiakan agar miring ose
yang digunakan adalah ose tumpul, dan pada saat penanaman ose tumpul digoreskan
pada permukaan medium agar miring tersebut. Dan setelah di inkubasikan selama 24 jam
di dalam inkubator dengan suhu 370C pada kelompok kami didapatkan hasil pada biakan
murni bakteri Bacillus subtilis yaitu bakteri Bacillus subtilis berada di bekas goresan dan
didasar, pada biakan murni bakteri Escherichia coli yaitu bakteri Escherichia coli berada
di bekas goresan. Penanaman mikroba pada medium agar miring ini bertujuan untuk
melihat pertumbuhan mikroba. Adakalanya juga medium yang dipakai untuk pembiakan
pecah atau rusak hal ini mungkin dikarenakan pada saat penggoresan terlalu kuat
sehinnga ose tumpul yang digunakan masuk kedalam medium atau pada saat penusukan
tidak dilakukan dengan cara yang benar menyebabkan medium pecah tetapi medium
yang pecah tidak akan mengganggu pertumbuhan mikroba tetapi medium yang pecah
akan mengganggu pada saat proses perhitungan mikroba hal ini dikarenakan jika ada
mikroba yang tumbuh pada retakan medium tersebut akan sangat sulit saat dilakukan
perhitungan. Dan yang ketiga menggunakan medium cair sebagai tempat pembiakan dan
dilakukan dengan cara yang sama seperti pada pembiakan agar miring, dan juga
menggunakan ose yang sama yaitu ose tumpul tetapi pada saat pemberian bakteri
kedalam mediumnya dilakukan dengan cara menyinggungkan ujung ose tumpul yang
mengandung inokulum pada permukaan medium cair tersebut. Dan Setelah di
inkubasikan selama 24 jam di dalam inkubator dengan suhu 370C pada kelompok kami
mendapatkan hasil pada biakan murni bakteri Bacillus subtilis yaitu bakteri Bacillus
subtilis berada di permukaan, pada biakan murni bakteri Escherichia coli yaitu bakteri
Escherichia coli berada di dasar. Bacillus subtilis merupakan bakteri aerob, sehingga
bakteri tersebut akan dapat hidup apabila ada oksigen atau dapat dikatakan letaknya ada
dipermukaan, sedangkan bakteri Escherichia coli bersifat anaerob fakultatif yang dapat
hidup pada keadaan aerob dan anaerob, jadi bakteri Escherichia coli letaknya bisa ada
didasar atau di permukaan dari tabung biakan. Penanaman mikroba pada medium nutrien
cair ini bertujuan untuk melihat pertumbuhan mikroba dan pergerakan mikroba.
Proses kedua yang dilakukan adalah pengisolasian mikroba dengan cara goresan /
streaking plate. Yang dilakukan dengan cara yang pertama dilakukan menyiapkan
medium nutrien agar setelah itu medium di cairkan dengan cara di masukkan dalam
penangas air, lalu setelah medium mencair sempurna didinginkan hingga suhunya kurang
lebih 500 C, Kemudian setelah medium agak dingin dituangkan pada cawan petri steril
prosesini juga harus dilakukan dalam keadaan aseptik, setelah itu biarkan medium dingin
dan memadat. Setelah medium dingin dan memadat ambil inokulum menggunakan ose
tumpul yang sebelumnya telah disterilkan dengan cara dipanaskan di atas nyala api
lampu spiritus , setelah itu buat goresan di permukaan agar dan goresan yang membentuk
zig –zag.
Pada saat penggoresan tidak boleh terputus dengan kata lain harus berlanjut hal ini
dilakukan agar koloni yang nantinya terbentuk berlanjut dan tidak terputus sementara
penggoresan secara zig- zag yang dilakukan bertujuan untuk melihat pergerakan bakteri
yang sedang di biakkan. Setelah itu cawan petri diberi etiket dan dibungkus
menggunakan kertas koran atau kertas lain seperti misalnya fotocopy dengan ukuran F4,
kemudian diinkubasiakan pada suhu 370 C selama 24 jam.Dan setelah diinkubasikan
pada kelompok kami didapatkan hasil bahwa koloni tersebut berada dibekas goresan dan
ada juga yang berada di luar goresan.
Proses yang terakhir adalah dilakukannya pengamatan pertumbuhan mikroba dengan
cara yang pertama adalah mengambil satu ose koloni bakteri Escherichia coli dari media
NA menggunakan ose tumpul yang sebelumnya telah di sterilkan terlebih dahulu,
kemudia menginokulasikannya ke dalam media pertumbuhan NB pada labu erlenmeyer (
jam ke – 0 ), setelah itu mengambil1 ml suspensibakteri dan memindahkannyake dalam
kuvet plastik, dan media tanpa suspensi bakteri digunakan sebagai blanko diukur pada
spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm pengukuran pada spektofotometer
berguna untuk melihat kepekatan mikroba, kuvet yang dindingnya keruh diletakkan
disebelah luar, sedangkan bagian yang dindingnya transparan diletakkan menghadap
sinar UV, hal ini tidak boleh terbalik, karena pada dinding yang transparan akan lebih
mudah menangkap sinar UV tersebut, kemudian baca adsorbansi kuvet yang berisi
suspensi bakteri Escherichia coli, setelah itu diinkubasikan pada suhu 370 C dengan
tujuan seperti yang sudah di jelaskan diatas. Ulangi pembacaan absorbansi setiap 3 jam
sekali selama 27 jam, hal ini dilakukan untuk mengetahui kestabilan serta mengontrol
pertumbuhan
bakteri
setiap
jamnya
untuk
disesuaikan
dengan
setiap
fase
pertumbuhannya.
Dan kelompok kami mendapatkan hasil yaitu pada absorbansi pertama 0,78 yang
dilakukan pada pukul 09.16. Lalu pada absorbansi kedua yaitu 1,207 yang dilakukan
pada pukul 16.15, kemudian pada absorbansi ke tiga yaitu 1,516 yang dilakukan pada
pukul 19.25, kemudian pada absorbansi keempat yaitu 1,917 yang dilakukan pada pukul
07.00, absorbansi terakhir yang dilakukan pada pukul 17.15 yaitu 1,319.
Absorbansi
1,917
1,516
1,319
1,207
0,7
09.16
16.15
19.25
07.00
17.15
Gambar 1.2. Kurva Absorbansi Pertumbuhan Mikroba
Keterangan tabel:
Jam
Absorbansi
Ke-0 (09.16)
Ke-1 (16.15)
Ke-2 (19.25)
Ke-3 (07.00)
0,78 abs
1,207 abs
1,516 abs
1,917 abs
Ke-4 (17.15)
1,319 abs
Gambar 1.3. Tabel Absorbansi Pertumbuhan Mikroba
VI. KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat diambil dari praktikum yang telah dilakukan adalah :
1. Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa dapat melakukan penanaman dan isolasi
mikroba serta mengamati pertumbuhan bakteri.
2. Isolasi mikroba merupakan pemisahan mikroba yang dikehendaki dari lingkungannya
di alam dan menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan.
3. Ada beberapa hal penting yang perlu diperhatikan pada saat pengisolasian mikroba
antara lain :
a) Sifat-sifat spesies mikroba yang akan di tanam.
b) Tempat hidup atau asal mikroba tersebut.
c) Cara menanam dan cara mengisolasikannya.
d) Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa biakan murni dan sesuai
dengan yang dimaksud.
e) Cara memelihara biakan murni.
4. Dalam masa pertumbuhannya bakteri mengalami empat macam fase pertumbuhan
yaitu :
a) Fase lag ( awal )
b) Fase log ( fase eksponensial )
c) Fase stasioner
d) Fase kematian
5. Pembiakan mikroba menggunakan medium nutrien agar miring bertujuan untuk
melihat pergerakan mikroba, dan pembiakan mikroba pada medium nutrien agar tegak
bertujuan untuk memperlama hidup mikroba dan melihat pertumbuhan mikroba,
sementara pembiakan pada medium nutrien cair bertujuan untuk melihat pertumbuhan
dan pergerakan mikroba.
6. B. subtilis merupakan bakteri aerob, sehingga bakteri tersebut akan dapat hidup
apabila ada oksigen atau dapat dikatakan letaknya ada dipermukaan, sedangkan
bakteri E. coli bersifat anaerob fakultatif yang dapat hidup pada keadaan aerob dan
anaerob, jadi bakteri E. coli letaknya bisa ada didasar atau di permukaan dari tabung
biakan.
7. Medium yang pecah atau rusak tidak akan menggangu proses pertumbuhan mikroba,
tetapi akan menggangu pada saat proses perhitungan karena jika ada mikroba yang
tumbuh pada retakan medium tersebut mikroba akan sangat sulit saat dihitung.
8. Dari praktikum kali ini didapatkan hasil absosbansi sebagai berikut :
Jam
Absorbansi
Ke-0 (09.16)
Ke-1 (16.15)
Ke-2 (19.25)
Ke-3 (07.00)
0,78 abs
1,207 abs
1,516 abs
1,917 abs
Ke-4 (17.15)
1,319 abs
VII. DAFTAR PUSTAKA
Dwijoseputro, D. 2010. Dasar-dasar mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan . Gramedia Pustaka Utama : Jakarta
Michael Pelczar, dkk. 2008. Dasar – Dasar Mikrobiologi, Jakarta : Penerbit
Universitas Indonesia.
LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DAN VIROLOGI
P-3
PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA
Disusun Oleh:
Nama
: Zitta Afrida
NIM
: 1308010125
Golongan
: II
Kelompok : 3 B
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2013
P– 3
PERHITUNGAN JUMLAH MIKROBA
I.TUJUAN
Setelah melakukan praktikum ini diharapkan mahasiswa dapat :
1. Mengetahui cara – cara perhitungan jumlah mikroba, baik secara langsung maupun
secara tidak langsung.
2. Melakukan perhitungan jumlah mikroba yang ada pada suatu bahan.
II. ALAT DAN BAHAN
1. Menggunakan Spektrofotometer
A. Alat
1) Kuvet plastik
2) Pipet steril
3) Spektrofotometer
B. Bahan
1) Kultur suspensi bakteri E. coli dalam media NB umur 18 – 24 jam
2) Media NB tanpa bakteri sebagai blanko
3) Akuadest
2. Berdasarkan Total Plate Count
A. Alat
1) Cawan petri
2) Kapas steril
3) Gelas ukur
4) Tabung reaksi
5) Pipet tetes steril
B. Bahan
1) Sampel bahan ( air sumur ) yang akan ditentukan jumlah bakterinya
2) Medium nutrieb agar tegak
3) Medium tripton glukosa yeast agar tegak
4) Akuades steril
III. CARA KERJA
A. Menggunakan Spektrofotometer
Ambil 1 ml suspensi bakteri dan pindahkan ke dalam kuvet plastik
↓
Diencerkan bila perlu untuk mendapatkan OD 600 kurang dari 1
↓
Sampel dimasukkan kedalam kuvet
↓
Sampel diukur OD 600
↓
Dihitung densitas dari sel dengan menggunakan table
B. Berdasarkan Total Plate Count
Ambil 1 ml sampel
↓
1 ml sampel ditambah dengan 9 ml aquadest (tabung 1)
↓
1 ml suspense tabung 1 ditambah 9 ml aquadest (tabung 2)
↓
1 ml suspense tabung 2 ditambah 9 ml aquadest (tabung 3) dan seterusnya sampai
pengenceran 10‾
↓
Medium agar dipanaskan (diambil 10 ml)
↓
Campuran medium ditambahkan dengan suspense pengenceran dalam cawan petri
↓
Digoyangkan dengan arah angka 8 secara hati-hati
↓
Dibungkus dengan kertas lalu diinkubasi selama 24 jam
↓
Didinginkan dan dihitung koloni yang tumbuh pada masing-masing cawan petri
IV. HASIL
Berdasarkan Toyal Plate Count
Pengenceran 10-5 (rep 1)
Pengenceran 10-4 (rep 1)
Pengenceran 10-5 (rep 2)
Pengenceran 10-4 (rep 2)
A. Hasil Perhitungan
Jumlahkolonipadatiapcawan
Pengenceran
Air sumur
A = 236 + 271
10-4
10-4
Replikasi 1
Replikasi 2
10-4
236
271
10-5
165
140
= 236 x 104 + 271 x 104
2
= 507 x 104
2
= 253,5 x 104
B = 165 + 140
10-5
10-5
= 165 x 105 + 140 x 105
2
5
= 305 x 10
2
= 152,5 x 105
B
= 152,5 x 105
A
253,5 x 10-4
= 1525 x 104
253,5 x 104
Ket :
B >2 = A
A
= 6,01 CFU (coloning forming unit)
B