PENGARUH FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETAN
PENGARUH FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK
DAUN AWAR-AWAR (Ficus septica Burm. f)
TERHADAP VIABILITAS SEL DAN DAUR SEL
KANKER PAYUDARA T47D
ISHMA ALIA
08/265184/FA/08079
Latar Belakang
Kanker
payudara
Prevalensi tinggi (Jemal et
al., 2011; SIRS, 2008)
Resistensi obat, target
tidak spesifik (AitMohammed et al., 2011)
BAHAN ALAM
Kemoterapi
Awar-awar (Ficus septica Burm. f)
Latar Belakang
1. Bersifat sitotoksik pada sel
kanker HCT-8, NUGC, HONE1, T47D dan MCF7 (Damu et
al., 2009; Pratama, 2010;
Sekti, 2009).
2. Menginduksi apoptosis
melalui penekanan ekspresi
Bcl-2 (Sekti, 2009).
Daun awar-awar (Ficus septica Burm. f)
Perumusan Masalah
Apakah fraksi etil asetat ekstrak etanolik
daun Ficus septica mempunyai pengaruh
terhadap viabilitas sel kanker payudara T47D
dan seberapa besar potensinya?
Apakah fraksi etil asetat ekstrak etanolik
daun Ficus septica mampu menghambat
daur sel kanker payudara T47D?
Tinjauan Pustaka
1. KANKER DAN KANKER PAYUDARA
Sel normal yang
mengalami transformasi
sehingga berploriferasi
secara terus menerus
(Panno, 2005)
Sel kanker mampu
menghindar dari
apoptosis dan growth
supressor (Hanahan et al.,
2011)
Terjadi mutasi pada gen
BRCA1, BRCA2 dan p53
(Panno, 2005)
Paparan estrogen yang
tinggi (Macdonald et
al., 2005)
Tinjauan Pustaka
2. SEL T47D
Sel kanker payudara dari
jaringan duktal.
Mengekspresikan protein
p53 yang termutasi.
Mengekspresikan reseptor
estrogen.
(Schafer, 2000)
Tinjauan Pustaka
3. Awar-awar (Ficus septica Burm. f)
Divisi
: Spermatophyta
Sub divisi : Angiospermae
Classis : Dicotyledonae
Ordo
: Urticales
Famili
: Moraceae
Genus : Ficus
Spesies : Ficus septica Burm. f
(Syamsuhidayat et al., 2000)
Daun awar-awar
mengandung alkaloid
fenantroindolisidin
(antofin, tyloforin,
ficuseptin), genistin,
fenolik, steroid,
saponin, triterpenoid
(Lansky et al., 2011).
3. Awar-awar (Ficus septica Burm. f)
a.
Alkaloid fenantroindolisidin bersifat sitotoksik pada sel kanker HCT8, NUGC, HONE-1, KB-3-1, KB-IV (Damu et al., 2009; Staerk et al., 2002).
b. Ekstrak etanolik daun awar-awar bersifat toksik pada sel kanker payudara
T47D dan sel MCF7, dan mampu menginduksi apoptosis melalui
penekanan ekspresi Bcl-2 (Pratama, 2010; Sekti, 2009).
c. Turunan fenantroindolisidin, tyloforin mampu mampu menghambat
pertumbuhan sel kanker HepG2, HONE-1, dan NUGC-3 pada fase G1.
Antofin mampu menghambat pertumbuhan sel kanker A549 dan sel HCT
116 pada fase G0/G1 (Wu et al., 2009; Min et al., 2010).
d. Senyawa fenolik resveratrol mampu menghambat proliferasi sel kanker
MCF7 (Corre et al., 2006).
Resveratrol
Fenantroindolisidin
Landasan Teori dan Hipotesis
Sitotoksik pada beberapa sel kanker dan
mampu mempengaruhi daur sel
Fraksinasi
Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun Ficus septica memiliki potensi cukup
tinggi dalam menghambat viabilitas sel kanker payudara T47D.
Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun Ficus septica mampu menghambat
daur sel kanker payudara T47D
METODE PENELITIAN
Metode Penelitian
Pembuatan ekstrak etanolik daun awar-awar
Fraksinasi bertahap dengan heksana dan etil asetat
Ekstraksi
Serbuk daun awarawar
Maserasi etanol 70%
Dipekatkan diatas
penangas air
Ekstrak
etanolik
kental
Fraksinasi
Ekstrak
etanolik
kental
Fraksi larut
heksana
Fraksi tidak larut
heksana (FTH)
Fraksi larut etil
asetat (FLEA)
Fraksi tidak larut
etil asetat (FTLEA)
Metode Penelitian
Pembuatan ekstrak etanolik daun awar-awar
Fraksinasi bertahap dengan heksana dan etil asetat
Pemanenan sel T47D
Uji sitotoksisitas, uji penghambatan daur sel
Analisis data
MTT Assay
MTT
Formazan
SPSS 16.0
Flowcytometry
Propidium Iodida
(Macey, 2007; McCarthy, 2007)
ModFit LT 3.0
HASIL DAN
PEMBAHASAN
HASIL & PEMBAHASAN
Determinasi
Ekstraksi dan Fraksinasi
Rendemen ekstrak etanolik = 10,86%
Rendemen
Rendemen fraksi larut etil asetat (FLEA) =1,97%
Rendemen fraksi tidak larut etil asetat (FTLEA) = 5,91%
Uji Sitotoksik FLEA
Kontrol
FLEA 100 µg/mL
FLEA 1 µg/mL
FLEA 250 µg/mL
FLEA 10 µg/mL
FLEA 50 µg/mL
FLEA 500 µg/mL
FLEA 700 µg/mL
Viabilitas
iabilitas Sel (%)
Uji Sitotoksik FLEA
Nilai IC50 FLEA =
13,72 µg/mL
Konsentrasi FLEA (µg/mL)
Uji Sitotoksik FTLEA
Kontrol
FTLEA 1 µg/mL
FTLEA 10 µg/mL
FTLEA 250 µg/mL
FTLEA 500 µg/mL
FTLEA 700 µg/mL
Viabilitas
bilitas Sel (%)
Uji Sitotoksik FTLEA
Nilai IC50 FTLEA =
4175,80 µg/mL
Konsentrasi FTLEA (µg/mL)
Perlakuan
IC50 (µg/mL)
Keterangan
FLEA
13,72
-
FTLEA
4175,80
-
EDA
13
Pratama et al. (2011)
FTH
9,3
Pratama (2012)
Ekstrak dikatakan mempunyai potensi
sebagai agen anti kanker apabila nilai IC50
dibawah 30 µg/mL (Joshi et al., 2011)
Uji Penghambatan Daur Sel
Kontrol
FLEA 7 µg/mL
Jumlah sel tiap fase
G1 (%)
S (%)
G2/M (%)
Perlakuan
Sub G1
(%)
Kontrol
3,59
37,33
47,31
15,36
FLEA 7 µg/mL
41,91
46,21
35,64
18,15
Kemungkinan Mekanisme
Antofin menurunkan ekspresi
cyclin E, cyclin D dan CDK4
(Min et al., 2010)
Akumulasi fase G1
Tyloforin menurunkan ekspresi
cyclin D1 dan cyclin A2
(Wu et al., 2009)
Resveratrol meningkatkan ekspresi
protein WAF1/p21 (Ahmad, 2001)
KESIMPULAN DAN SARAN
KESIMPULAN
Fraksi larut etil asetat ekstrak etanolik daun awar-awar
memiliki potensi lebih tinggi dalam menghambat viabilitas
sel T47D dengan nilai IC50 sebesar 13,72 µg/mL, sedangkan
nilai IC50 fraksi tidak larut etil asetat ekstrak etanolik daun
awar-awar sebesar 4175,80 µg/mL.
Fraksi larut etil asetat ekstrak etanolik daun awar-awar
konsentrasi 7 µg/mL mampu menghambat daur sel T47D
pada fase G1.
SARAN
Perlu dilakukan identifikasi profil kandungan senyawa yang terdapat
dalam fraksi larut etil asetat ekstrak etanolik daun awar-awar untuk
mengetahui kemungkinan senyawa yang memiliki efek sitotoksik.
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme aksi fraksi
larut etil asetat ekstrak etanolik daun awar-awar dalam menghambat
daur sel dengan menggunakan variasi konsentrasi, serta mekanisme
molekuler yang terlibat.
Pengujian fraksi larut etil asetat ekstrak etanolik daun awar-awar
secara in vivo perlu dilakukan untuk melihat keselarasan hasil antara uji
in vitro dan in vivo.
Struktur senyawa
(1) Ficuseptin B, C, D, (2) Ficuseptin A, (3) 10R,13aR-tylocrebrin N-oksida;
10R,13aR-tyloforin N-oksida, (4) 10S,13aS-isotylocrebrin N-oksida, (5)
10S,13aR-antofin N-oksida; 10S,13aR-isotylocrebrin N-oksida; 10S,13aRtylocrebrin N-oksida; 10S,13aR-tyloforin N-oksida,
(6) Genistin, (7) Kumarin (Lansky et al., 2011).
Saponin
Resin
Klorofil
Nekrosis dan apoptosis
Nekrosis
Apoptosis
Membran sel
Mengalami kerusakan
Integritas membran masih
terjaga
Nukleus
Degradasi DNA secara acak
Kondensasi kromatin, DNA
laddering, fragmentasi inti
Sitoplasma
Terjadi pembengkakan sel
Kemungkinan Mekanisme
Penurunan ekspresi Bcl-2
(Sekti, 2009)
Apoptosis
Antofin meningkatkan ekspresi TNF- α
(Wu et al., 2009)
Pengaruh berbagai ekstrak terhadap sel T47D
Perlakuan
IC50 (µg/mL)
Keterangan
Ekstrak daun sambung nyawa
90
Jenie dan Meiyanto, 2007
Ekstrak propolis
34,67
Syamsudin et al., 2009
Ekstrak herba leunca
47
Anindyajati, 2011
Fraksi kloroform daun sirih merah
105,43
Kurniawan, 2006
Fraksi etil asetat daun sambung nyawa
31
Jenie, 2007
Fraksi heksana daun sambung nyawa
40
Jenie, 2007
Perlakuan
Indeks Seletivitas
Keterangan
Fraksi kloroform daun sirih merah
3,02
Kurniawan, 2006
Fraksi heksana daun awar-awar
3,1
Pratama, 2012
Perhitungan sel
10 µl = 1 ml= 104 /ml
Jumlah sel = sel hitung X 104 = 100 x104 =106 /ml
Sel akan ditanam: 5000x100= 5 106/106= 5ml (ambil
dari suspensi sel 5 ml)
Yang dibutuhkan : 100 x100 well= 10000 µl= 10 ml
Maka ad sampai 10 ml
Jumlah reagen
Bahan:
FBS = 10%
Penisilin-strep = 1%
Tripsin 0,25% 450 µl
MTT =0,5mg/ml
DMSO max=1%
SDS =10% dalam 0,1 N HCl
Propidium iodida= 50 µg/ml
Rnase = 50 µg/ml
Triton X = 0,1%
Pemanenan Sel
Uji Flowcytometry
Bungkus
alufoil+vortex
Inkubasi 24 jam
Buang PBS
!
28/11/2014
"
!
#
!
!
!
$
%
DAUN AWAR-AWAR (Ficus septica Burm. f)
TERHADAP VIABILITAS SEL DAN DAUR SEL
KANKER PAYUDARA T47D
ISHMA ALIA
08/265184/FA/08079
Latar Belakang
Kanker
payudara
Prevalensi tinggi (Jemal et
al., 2011; SIRS, 2008)
Resistensi obat, target
tidak spesifik (AitMohammed et al., 2011)
BAHAN ALAM
Kemoterapi
Awar-awar (Ficus septica Burm. f)
Latar Belakang
1. Bersifat sitotoksik pada sel
kanker HCT-8, NUGC, HONE1, T47D dan MCF7 (Damu et
al., 2009; Pratama, 2010;
Sekti, 2009).
2. Menginduksi apoptosis
melalui penekanan ekspresi
Bcl-2 (Sekti, 2009).
Daun awar-awar (Ficus septica Burm. f)
Perumusan Masalah
Apakah fraksi etil asetat ekstrak etanolik
daun Ficus septica mempunyai pengaruh
terhadap viabilitas sel kanker payudara T47D
dan seberapa besar potensinya?
Apakah fraksi etil asetat ekstrak etanolik
daun Ficus septica mampu menghambat
daur sel kanker payudara T47D?
Tinjauan Pustaka
1. KANKER DAN KANKER PAYUDARA
Sel normal yang
mengalami transformasi
sehingga berploriferasi
secara terus menerus
(Panno, 2005)
Sel kanker mampu
menghindar dari
apoptosis dan growth
supressor (Hanahan et al.,
2011)
Terjadi mutasi pada gen
BRCA1, BRCA2 dan p53
(Panno, 2005)
Paparan estrogen yang
tinggi (Macdonald et
al., 2005)
Tinjauan Pustaka
2. SEL T47D
Sel kanker payudara dari
jaringan duktal.
Mengekspresikan protein
p53 yang termutasi.
Mengekspresikan reseptor
estrogen.
(Schafer, 2000)
Tinjauan Pustaka
3. Awar-awar (Ficus septica Burm. f)
Divisi
: Spermatophyta
Sub divisi : Angiospermae
Classis : Dicotyledonae
Ordo
: Urticales
Famili
: Moraceae
Genus : Ficus
Spesies : Ficus septica Burm. f
(Syamsuhidayat et al., 2000)
Daun awar-awar
mengandung alkaloid
fenantroindolisidin
(antofin, tyloforin,
ficuseptin), genistin,
fenolik, steroid,
saponin, triterpenoid
(Lansky et al., 2011).
3. Awar-awar (Ficus septica Burm. f)
a.
Alkaloid fenantroindolisidin bersifat sitotoksik pada sel kanker HCT8, NUGC, HONE-1, KB-3-1, KB-IV (Damu et al., 2009; Staerk et al., 2002).
b. Ekstrak etanolik daun awar-awar bersifat toksik pada sel kanker payudara
T47D dan sel MCF7, dan mampu menginduksi apoptosis melalui
penekanan ekspresi Bcl-2 (Pratama, 2010; Sekti, 2009).
c. Turunan fenantroindolisidin, tyloforin mampu mampu menghambat
pertumbuhan sel kanker HepG2, HONE-1, dan NUGC-3 pada fase G1.
Antofin mampu menghambat pertumbuhan sel kanker A549 dan sel HCT
116 pada fase G0/G1 (Wu et al., 2009; Min et al., 2010).
d. Senyawa fenolik resveratrol mampu menghambat proliferasi sel kanker
MCF7 (Corre et al., 2006).
Resveratrol
Fenantroindolisidin
Landasan Teori dan Hipotesis
Sitotoksik pada beberapa sel kanker dan
mampu mempengaruhi daur sel
Fraksinasi
Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun Ficus septica memiliki potensi cukup
tinggi dalam menghambat viabilitas sel kanker payudara T47D.
Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun Ficus septica mampu menghambat
daur sel kanker payudara T47D
METODE PENELITIAN
Metode Penelitian
Pembuatan ekstrak etanolik daun awar-awar
Fraksinasi bertahap dengan heksana dan etil asetat
Ekstraksi
Serbuk daun awarawar
Maserasi etanol 70%
Dipekatkan diatas
penangas air
Ekstrak
etanolik
kental
Fraksinasi
Ekstrak
etanolik
kental
Fraksi larut
heksana
Fraksi tidak larut
heksana (FTH)
Fraksi larut etil
asetat (FLEA)
Fraksi tidak larut
etil asetat (FTLEA)
Metode Penelitian
Pembuatan ekstrak etanolik daun awar-awar
Fraksinasi bertahap dengan heksana dan etil asetat
Pemanenan sel T47D
Uji sitotoksisitas, uji penghambatan daur sel
Analisis data
MTT Assay
MTT
Formazan
SPSS 16.0
Flowcytometry
Propidium Iodida
(Macey, 2007; McCarthy, 2007)
ModFit LT 3.0
HASIL DAN
PEMBAHASAN
HASIL & PEMBAHASAN
Determinasi
Ekstraksi dan Fraksinasi
Rendemen ekstrak etanolik = 10,86%
Rendemen
Rendemen fraksi larut etil asetat (FLEA) =1,97%
Rendemen fraksi tidak larut etil asetat (FTLEA) = 5,91%
Uji Sitotoksik FLEA
Kontrol
FLEA 100 µg/mL
FLEA 1 µg/mL
FLEA 250 µg/mL
FLEA 10 µg/mL
FLEA 50 µg/mL
FLEA 500 µg/mL
FLEA 700 µg/mL
Viabilitas
iabilitas Sel (%)
Uji Sitotoksik FLEA
Nilai IC50 FLEA =
13,72 µg/mL
Konsentrasi FLEA (µg/mL)
Uji Sitotoksik FTLEA
Kontrol
FTLEA 1 µg/mL
FTLEA 10 µg/mL
FTLEA 250 µg/mL
FTLEA 500 µg/mL
FTLEA 700 µg/mL
Viabilitas
bilitas Sel (%)
Uji Sitotoksik FTLEA
Nilai IC50 FTLEA =
4175,80 µg/mL
Konsentrasi FTLEA (µg/mL)
Perlakuan
IC50 (µg/mL)
Keterangan
FLEA
13,72
-
FTLEA
4175,80
-
EDA
13
Pratama et al. (2011)
FTH
9,3
Pratama (2012)
Ekstrak dikatakan mempunyai potensi
sebagai agen anti kanker apabila nilai IC50
dibawah 30 µg/mL (Joshi et al., 2011)
Uji Penghambatan Daur Sel
Kontrol
FLEA 7 µg/mL
Jumlah sel tiap fase
G1 (%)
S (%)
G2/M (%)
Perlakuan
Sub G1
(%)
Kontrol
3,59
37,33
47,31
15,36
FLEA 7 µg/mL
41,91
46,21
35,64
18,15
Kemungkinan Mekanisme
Antofin menurunkan ekspresi
cyclin E, cyclin D dan CDK4
(Min et al., 2010)
Akumulasi fase G1
Tyloforin menurunkan ekspresi
cyclin D1 dan cyclin A2
(Wu et al., 2009)
Resveratrol meningkatkan ekspresi
protein WAF1/p21 (Ahmad, 2001)
KESIMPULAN DAN SARAN
KESIMPULAN
Fraksi larut etil asetat ekstrak etanolik daun awar-awar
memiliki potensi lebih tinggi dalam menghambat viabilitas
sel T47D dengan nilai IC50 sebesar 13,72 µg/mL, sedangkan
nilai IC50 fraksi tidak larut etil asetat ekstrak etanolik daun
awar-awar sebesar 4175,80 µg/mL.
Fraksi larut etil asetat ekstrak etanolik daun awar-awar
konsentrasi 7 µg/mL mampu menghambat daur sel T47D
pada fase G1.
SARAN
Perlu dilakukan identifikasi profil kandungan senyawa yang terdapat
dalam fraksi larut etil asetat ekstrak etanolik daun awar-awar untuk
mengetahui kemungkinan senyawa yang memiliki efek sitotoksik.
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme aksi fraksi
larut etil asetat ekstrak etanolik daun awar-awar dalam menghambat
daur sel dengan menggunakan variasi konsentrasi, serta mekanisme
molekuler yang terlibat.
Pengujian fraksi larut etil asetat ekstrak etanolik daun awar-awar
secara in vivo perlu dilakukan untuk melihat keselarasan hasil antara uji
in vitro dan in vivo.
Struktur senyawa
(1) Ficuseptin B, C, D, (2) Ficuseptin A, (3) 10R,13aR-tylocrebrin N-oksida;
10R,13aR-tyloforin N-oksida, (4) 10S,13aS-isotylocrebrin N-oksida, (5)
10S,13aR-antofin N-oksida; 10S,13aR-isotylocrebrin N-oksida; 10S,13aRtylocrebrin N-oksida; 10S,13aR-tyloforin N-oksida,
(6) Genistin, (7) Kumarin (Lansky et al., 2011).
Saponin
Resin
Klorofil
Nekrosis dan apoptosis
Nekrosis
Apoptosis
Membran sel
Mengalami kerusakan
Integritas membran masih
terjaga
Nukleus
Degradasi DNA secara acak
Kondensasi kromatin, DNA
laddering, fragmentasi inti
Sitoplasma
Terjadi pembengkakan sel
Kemungkinan Mekanisme
Penurunan ekspresi Bcl-2
(Sekti, 2009)
Apoptosis
Antofin meningkatkan ekspresi TNF- α
(Wu et al., 2009)
Pengaruh berbagai ekstrak terhadap sel T47D
Perlakuan
IC50 (µg/mL)
Keterangan
Ekstrak daun sambung nyawa
90
Jenie dan Meiyanto, 2007
Ekstrak propolis
34,67
Syamsudin et al., 2009
Ekstrak herba leunca
47
Anindyajati, 2011
Fraksi kloroform daun sirih merah
105,43
Kurniawan, 2006
Fraksi etil asetat daun sambung nyawa
31
Jenie, 2007
Fraksi heksana daun sambung nyawa
40
Jenie, 2007
Perlakuan
Indeks Seletivitas
Keterangan
Fraksi kloroform daun sirih merah
3,02
Kurniawan, 2006
Fraksi heksana daun awar-awar
3,1
Pratama, 2012
Perhitungan sel
10 µl = 1 ml= 104 /ml
Jumlah sel = sel hitung X 104 = 100 x104 =106 /ml
Sel akan ditanam: 5000x100= 5 106/106= 5ml (ambil
dari suspensi sel 5 ml)
Yang dibutuhkan : 100 x100 well= 10000 µl= 10 ml
Maka ad sampai 10 ml
Jumlah reagen
Bahan:
FBS = 10%
Penisilin-strep = 1%
Tripsin 0,25% 450 µl
MTT =0,5mg/ml
DMSO max=1%
SDS =10% dalam 0,1 N HCl
Propidium iodida= 50 µg/ml
Rnase = 50 µg/ml
Triton X = 0,1%
Pemanenan Sel
Uji Flowcytometry
Bungkus
alufoil+vortex
Inkubasi 24 jam
Buang PBS
!
28/11/2014
"
!
#
!
!
!
$
%