Lowysa Wanti Silaban : Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Kulit Buah Sentul Sandoricum Koetjape Burm. f. Merr Terhadap Beberapa Bakteri Secara In Vitro, 2009.
USU Repository © 2009
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi FMIPA USU Medan dan Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi
USU Medan yang meliputi skrining fitokimia, pembuatan air rebusan, ekstrak etanol dan uji aktivitas antibakteri dari kulit buah sentul. Metodologi penelitian
yang digunakan adalah metode eksperimental parametrik. Parameter yang diukur adalah aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus,
Escherichia coli dan Shigella dysenteriae secara mikrobiologi dengan metode difusi agar menggunakan punch hole, kemudian daya hambat zona jernih diukur
dengan menggunakan jangka sorong.
3.1 Alat–alat
Lowysa Wanti Silaban : Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Kulit Buah Sentul Sandoricum Koetjape Burm. f. Merr Terhadap Beberapa Bakteri Secara In Vitro, 2009.
USU Repository © 2009
Alat–alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat–alat gelas, oven Gallenkamp, autoklaf Webeco, inkubator Fisher Scientific, pencetak lubang
punch hole, lemari pendingin, neraca analitik Metter Toledo, rotary evaporator Buchi 461, blender Philips, neraca kasar Ohauss, maat pipet, mikropipet
Gilson, jarum ose, jangka sorong Goldton, pinset, bola karet, aluminium foil, cawan petri dan lampu bunsen.
3.2 Bahan–bahan
Bahan–bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah sentul Sandoricum koetjape Burm. f. Merr, air suling, Nutrient Agar Difco, dan
bahan–bahan yang berkualitas proanalisa E. Merck: etanol, n-heksana, raksa II klorida, natrium hidroksida, iodium, bismuth III nitrat, besi III klorida, -
naftol, asam nitrat pekat, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, timbal II asetat, asam asetat anhidrat, isopropanol, kloroform, metanol, benzena, serbuk
magnesium, dan amil alkohol. Bakteri yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus ATTC 25923, Escherichia coli ATTC 25922 dan Shigella
dysenteriae
3.3 Pembuatan Larutan Pereaksi dan Media 3.3.1 Pembuatan Larutan Pereaksi
3.3.1.1 Pereaksi Meyer
Sebanyak 2,266 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml. Pada wadah lain, 50 g kalium iodida dilarutkan dalam 100 ml air suling.
Lowysa Wanti Silaban : Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Kulit Buah Sentul Sandoricum Koetjape Burm. f. Merr Terhadap Beberapa Bakteri Secara In Vitro, 2009.
USU Repository © 2009
Kemudian 60 ml larutan I dicampurkan dengan 10 ml larutan II dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1989.
3.3.1.2 Pereaksi Natrium Hidroksida 2 N
Sebanyak 8,002 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling hingga diperoleh 100 ml larutan Ditjen POM, 1979.
3.3..1.3 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling, ditambahkan sedikit demi sedikit Iodium 2 g, dicukupkan dengan air suling 100 ml Depkes
RI, 1989.
3.3.1.4 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8,0 g bismuth III nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat dan dilarutkan 27,2 g kalium iodida dalam 50 ml air suling. Campur kedua larutan dan
dicukupkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1989.
3.3.1.5 Pereaksi Besi III Klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1989.
3.3.1.6 Pereaksi Asam Klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Ditjen POM, 1979.
Lowysa Wanti Silaban : Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Kulit Buah Sentul Sandoricum Koetjape Burm. f. Merr Terhadap Beberapa Bakteri Secara In Vitro, 2009.
USU Repository © 2009
3.3.1.7 Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal asetat dilarutkan dalam air suling bebas CO
2
secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1989.
2.3.1.8 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g alfa naftol dilarutkan dalam 15 ml etanol 95 , ditambahkan dengan asam nitrat 0,5 N secukupnya hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes
RI, 1989.
3.3.1.9 Pereaksi Liebermann-Burchard
Sebanyak 10 tetes asam asetat anhidrat dicampur dengan 1 tetes asam sulfat pekat. Larutan dibuat baru Depkes RI, 1989.
3.3.2 Pembuatan Media 3.3.2.1 Pembuatan Media Nutrient Agar NA dibuat Menurut Difco 1977
Komposisi: Bacto beef extract
3,0 g Bacto peptone
5,0 g Bacto agar
15,0 g Cara Pembuatan:
Lowysa Wanti Silaban : Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Kulit Buah Sentul Sandoricum Koetjape Burm. f. Merr Terhadap Beberapa Bakteri Secara In Vitro, 2009.
USU Repository © 2009
Sebanyak 23 g NA ditimbang, disuspensikan ke dalam air suling 1000 ml, lalu dipanaskan sampai bahan larut sempurna. Disterilkan di dalam autoklaf pada
suhu 121
o
C selama 15 menit.
3.3.2.2 Larutan NaCl 0,9
Komposisi: Natrium Klorida
9,0 g Air Suling hingga
1000 ml Cara Pembuatan:
Sebanyak 9 g NaCl ditimbang dan dilarutkan dengan air suling steril, dimasukkan dalam labu tentukur 1000 ml sampai larut sempurna, ditambahkan air
suling steril sampai garis tanda, dimasukkan dalam erlenmeyer steril yang bertutup, kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Ditjen POM, 1995.
3.3.2.3 Pembuatan Agar Miring
Sebanyak 3 ml media NA cair, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, diletakkan pada sudut kemiringan 30-45
o
dan dibiarkan memadat, kemudian disimpan di dalam lemari pendingin Lay, 1994.
3.3.2.4 Larutan Standart Mc. Farland Anonim, 2009
Komposis: Larutan asam sulfat 1
9,95 ml
Lowysa Wanti Silaban : Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Kulit Buah Sentul Sandoricum Koetjape Burm. f. Merr Terhadap Beberapa Bakteri Secara In Vitro, 2009.
USU Repository © 2009
Larutan barium klorida 1,175 0,05 ml
Cara Pembuatan: Dicampurkan kedua larutan di atas ke dalam tabung reaksi dan dikocok
homogen. Apabila kekeruhan suspensi bakteri uji adalah sama dengan kekeruhan larutan standar, berarti konsentrasi suspensi bakteri adalah 10
8
CFUml.
3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini disterilkan lebih dahulu sebelum dipakai. Media pertumbuhan disterilkan di
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit dan alat-alat gelas disterilkan di oven pada suhu 160-170°C selama 1-2 jam. Jarum ose dibakar dengan nyala bunsen.
3.5 Pengambilan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan 3.5.1 Pengambilan Bahan Tumbuhan
Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan tumbuhan yang sama dengan daerah lain. Bahan tumbuhan yang
digunakan adalah kulit buah sentul segar Sandorici pericarpium, diambil dari Jl. Galang, Kelurahan Cemara, Kecamatan Lubuk Pakam, Kabupaten Deli Serdang,
Provinsi Sumatera Utara.
3.5.2 Identifikasi Tumbuhan.
Lowysa Wanti Silaban : Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Kulit Buah Sentul Sandoricum Koetjape Burm. f. Merr Terhadap Beberapa Bakteri Secara In Vitro, 2009.
USU Repository © 2009
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi LIPI Bogor.
3.5.3 Pengolahan Bahan Tumbuhan
Kulit buah segar dicuci bersih dari pengotoran kemudian diris tipis-tipis, dikeringkan di lemari pengering dengan suhu 40
o
C. Kulit buah dianggap kering apabila sudah rapuh diremas menjadi hancur, kemudian simplisia kulit buah
kering diserbuk menggunakan blender, serbuk simplisia disimpan dalam wadah plastik.
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining Fitokimia dari serbuk simplisia meliputi pemeriksaan golongan senyawa alkaloida, flavonoida, saponin, tanin, glikosida, glikosida antrakinon dan
steroidatriterpenoida.
3.6.1 Pemeriksaan Alkaloida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2
menit. Didinginkan dan disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: a.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi Meyer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau
kuning.
Lowysa Wanti Silaban : Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Kulit Buah Sentul Sandoricum Koetjape Burm. f. Merr Terhadap Beberapa Bakteri Secara In Vitro, 2009.
USU Repository © 2009
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi
Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam.
c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah dengan 2 tetes larutan pereaksi
Dragendorff, akan terbentuk endapan kekeruhan paling sedikit dua dari tiga percobaan diatas Depkes RI, 1989.
3.6.2 Pemeriksaan Flavonoida
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 10 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat
ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna
merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol Depkes RI, 1989.
3.6.3 Pemeriksaan Saponin Uji Busa
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok selama 10 detik, jika
terbentuk busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya
saponin Depkes RI, 1989.
3.6.4 Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil
sebanyak 2 ml dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida 1 .
Lowysa Wanti Silaban : Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Kulit Buah Sentul Sandoricum Koetjape Burm. f. Merr Terhadap Beberapa Bakteri Secara In Vitro, 2009.
USU Repository © 2009
Jika terjadi warna hijau, biru atau kehitaman menunjukkan adanya tanin Harbone, 1987.
3.6.5 Pemeriksaan Glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air suling 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, direfluks selama 1 jam,
didinginkan dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari
dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Kumpulan sari air diuapkan pada temperatur tidak lebih dari
50
o
C. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa dipakai untuk percobaan berikut:
a. Larutan sisa dimasukkan ke dalam tabung reaksi selanjutnya diuapkan di
atas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi molish. Tambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding
tabung, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya glikosida.
b. Larutan percobaan diuapkan di atas penangas air. Larutkan sisa dalam 5
ml asam asetat anhidrat. Tambahkan 10 tetes asam sulfat pekat, akan terjadi warna biru atau hijau, menunjukkan adanya glikosida Depkes RI,
1989.
3.6.6 Pemeriksaan Glikosida Antrakinon
Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia ditambah 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzena, dikocok dan
Lowysa Wanti Silaban : Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Kulit Buah Sentul Sandoricum Koetjape Burm. f. Merr Terhadap Beberapa Bakteri Secara In Vitro, 2009.
USU Repository © 2009
didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring. Kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan.Lapisan air berwarna merah dan lapisan
benzena tidak berwarna menunjukkan adanya glikosida antrakinon Depkes RI, 1989.
3.6.7 Pemeriksaan SteroidaTriterpenoida
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, disaring, filtrat diuapkan dalam cawan penguap, dan pada sisanya ditambahkan 10
tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Liebermann- Burchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru
hijau menunjukkan adanya steroidatriterpenoida Harbone, 1987.
3.7 Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol. Cara kerja:
Sebanyak 300 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 2250 ml etanol, dimasukkan ke dalam bejana bertutup dan dibiarkan pada suhu kamar selama 5
hari terlindung dari cahaya, sambil sering diaduk, kemudian diserkai, diperas, disaring. Dipisahkan maserat dengan ampas. Dicuci ampas dengan 750 ml etanol.
Dipindahkan ke dalam bejana tertutup, biarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari, enap tuangkan atau disaring. Seluruh maserat digabungkan,
diuapkan dengan alat rotary evaporator pada temperatur kurang lebih 40
o
C dan diperoleh ekstrak etanol kental Ditjen POM, 1979.
Lowysa Wanti Silaban : Skrining Fitokimia Dan Uji Aktivitas Antibakteri Dari Kulit Buah Sentul Sandoricum Koetjape Burm. f. Merr Terhadap Beberapa Bakteri Secara In Vitro, 2009.
USU Repository © 2009
3.8 Pembuatan Air Rebusan Kulit Buah Sentul
