Kerangka Teori Desain Penelitian Kerangka operasional Definisi Operasional

2.7 Kerangka Teori

Gambar 2.13 Kerangka Teori Reactive Oxygen Species ROS Stres oksidatif Peroksidasi lipid ginjal Ekstrak etanol kulit manggis Keterangan : menghambat : memacu Perubahan makroskopis, mikroskopis dan tampilan immunohistokimia antioksidan CU Zn SOD pada ginjal MSG Vitamin E Universitas Sumatera Utara 50 BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Desain Penelitian

Jenis penelitian ini adalah eksperimental laboratorium dengan rancangan the post test only control group dengan cara membandingkan hasil observasi pada kelompok perlakuan eksperimen dengan kelompok kontrol. 3.2. Tempat dan Waktu penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam MIPA USU sebagai tempat dimulainya proses aklimatisasi, pemberian perlakuan dan pembedahan hewan coba selama 6 minggu, Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran USU untuk pembuatan dan pembacaan preparat immunohistokimia dan laboratorium Farmasi USU untuk pembuatan ekstrak etanol kulit manggis. Penelitian ini di laksanakan dari Januari 2012 hingga Juli 2013. 3.3. Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1. Populasi Penelitian Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit Mus musculus.L, Strain DDW Double Distsch Webster dewasa, jenis kelamin jantan, sehat dan aktif, umur ± 8-12 minggu, mempunyai berat badan berkisar 25- 30g, belum pernah digunakan untuk penelitian, diperoleh dari FMIPA USU. Universitas Sumatera Utara

3.3.2. Sampel penelitian

Besar sampel yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan rumus Federer Wahyuni, 2010 Dimana : n = besar sampel dalam kelompok perlakuan t = banyaknya kelompok perlakuan 5 kelompok perlakuan Banyak sampel yang dibutuhkan dalam kelompok : {5 – 1 n -1} ≥ 15 4 n – 1 ≥ 15 4n – 4 ≥ 15 4n ≥ 19 n ≥ 5 Maka jumlahnya adalah 5 ekor per kelompok, sehingga jumlah keseluruhan hewan coba yang diperlukan dalam penelitian ini adalah 25 ekor mencit jantan dewasa Sampel penelitian adalah 25 ekor mencit jantan strain DDW yang dipilih dengan tekhnik acak sederhana. Sampel dikelompokkan atas lima kelompok, yakni kelompok I sebagai kontrol, sedangkan kelompok II sampai V adalah kelompok perlakuan. {t – 1 n -1} ≥ 15 Universitas Sumatera Utara

3.4. Kriteria sampel

3.4.1. Kriteria inklusi

- Mencit jantan strain DDW - Umur 8-12 minggu - Berat badan 25- 30 g - Selama observasi 7 hari sebelum perlakuan, mencit tidak sakit, aktivitas dan tingkah laku normal.

3.4.2. Kriteria ekslusi

- Mencit dalam kondisi sakit. - Gerakan tidak aktif. 3.5. Variabel Penelitian 3.5.1. Variabel Bebas Ekstrak kulit buah manggis MSG Vitamin E

3.5.2. Variabel tergantung

Gambaran makroskopik ginjal meliputi berat, warna dan konsistensi Gambaran mikroskopik ginjal mencit dengan pewarnaan HE. Gambaran immunohistokimia antioksidan copper zinc superoxide dismutase Cu Zn SOD ginjal mencit. Universitas Sumatera Utara

3.6. Kerangka operasional

Gambar 3.1 Kerangka operasional Aklimatisasi ± 1 minggu P0 n=5 Aquadest 0,3ml 35 hari Randomisasi kedalam 5 kelompok P1 n=5 MSG 8 mggBB 21 hari P3 n=5 MSG 8mggBB 21 hari + EKM 600mgkg BB hari ke-22 sd 35 P2 n=5 MSG 8 mggBB 21 hari + Vit. E 0,2 mgg BB hari ke-22 sd 35 Terminasi Jaringan ginjal Makroskopis IHC Cu Zn SOD - Berat - Warna - Konsistensi Mikroskopis Pewarnaan HE Mencit P4 n=5 EKM 600mggBB 14 hari Universitas Sumatera Utara

3.7 Definisi Operasional

- Mencit Mus musculus merupakan hewan mamali dengan diklasifikasikan sebagai berikut: Kingdom Animalia, Filum Chordata, Klas Mamalia, Ordo Rodentia, Famili Muridae, Genus Mus, Spesies M. musculus Wikipedia, 2012. Pada penelitian ini digunakan 25 ekor mencit jantan strain DDW, umur 8 - 12 minggu, berat badan 25 - 30 gr, yang berasal dari Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, USU. - Aklimatisasi merupakan suatu upaya penyesuaian fisiologis atau adaptasi dari suatu organisme terhadap suatu lingkungan baru yang akan dimasukinya, pada penelitian ini aklimatisasi hewan dilakukan selama satu minggu IACUC, 2012. - Kelompok perlakuan adalah kelompok hewan percobaan yang digunakan untuk penelitian, Pada penelitian ini hewan yang digunakan adalah mencit yang dibagi atas lima kelompok perlakuan sebagai berikut: - Kelompok I P0: kelompok kontrol tanpa diberi MSG, Vitamin E dan Ekstrak manggis, hanya diberi aquadest sebanyak 0,3 mlmencithari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral gavage dari hari pertama sampai hari ke- 35 - Kelompok II P1: kelompok perlakuan yang diberi MSG 8 mggr BB setiap hari sebanyak 0,3mlmencithari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral gavage setiap hari selama 21 hari. - Kelompok III P2: kelompok perlakuan yang diberi MSG 8 mgg bb setiap hari sebanyak 0,3mlmencithari dengan cara dicekok Universitas Sumatera Utara menggunakan jarum oral gavage setiap hari selama 21 hari dan pada hari ke-22 sampai hari ke-35 dilanjutkan dengan pemberian Ekstrak etanol kulit manggis 600 mgkbbb sebanyak 0,36 ml selama 14 hari. - Kelompok IV P3: kelompok perlakuan yang diberi MSG 8 mgg BB setiap hari sebanyak 0,3 mlmencithari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral gavage setiap hari selama 21 hari dan pada hari ke-22 sampai hari ke-35 dilanjutkan dengan pemberian pemberian vitamin E 0,2mgg bb selama 14 hari. - Kelompok V P4: kelompok perlakuan yang diberi ekstrak etanol kulit manggis dengan dosis 600 mgkbbb sebanyak 0,36 ml selama 14 hari dengan cara dicekok menggunakan jarum oral gavage setiap hari. Masing-masing dari setiap kelompok P0, P1, P2, P3 dan P4 secara acak 5 ekor mencit didekapitasi, kemudian dilakukan penilaian perubahan makroskopik berat, warna dan konsistensi ginjal, mikroskopis dengan pewarnaan HE dan kandungan antioksidan endogen Cu Zn SOD dengan pewarnaan immunohistokimia. - Ekstrak etanol kulit manggis adalah cairan yang berasal dari kulit manggis berwarna ungu tua yang telah di ekstraksi menggunakan pelarut etanol 96, diberikan dengan dosis 600 mgkg bb. Pemberian dilakukan selama 14 hari dicekok menggunakan jarum gavage Towatana, et al., 2010; Palupi, 2008. Universitas Sumatera Utara Buah manggis yang digunakan didapat dari daerah pantai Gemi, Stabat, Sumatera Utara. - Monosodium glutamat MSG dengan rumus kimia C 5 H 8 O 4 NNaH 2 O terdiri atas Natrium sebanyak 12, glutamat 78 dan air 10, adalah garam sodium “L glutamat acid” yang mudah larut dalam air dan tidak berbau, dibuat melalui proses fermentasi dari tetes gula molases oleh bakteri Brevibacterium lactofermentum. Dari fermentasi ini dihasilkan asam glutamat. Asam glutamat kemudian ditambah soda Natrium karbonat sehingga terbentuk monosodium glutamat MSG, kemudian dimurnikan dan dikristalisasi, sehingga merupakan serbuk kristal murni . Dosis yang diberikan adalah 8 mggr BB selama 21 hari dengan dicekok menggunakan jarum gavage Thomas, et al., 2009. Pada penelitian ini menggunakan Ajinomoto 29 gr BPOM RI MD245813034037, diproduksi oleh PT Ajinomoto Indonesia, Mojokerto 61352- INDONESIA. - Vitamin E merupakan antioksidan non enzimatis yang mampu mendonorkan ion hidrogen dan dapat mengubah radikal peroksil menjadi radikal tokoferol yang kurang reaktif sehingga tidak mampu menyerang rantai asam lemak. Dosis yang diiberikan sebanyak 0,2 mgkg BB Tawfik, et al., 2012 pada penelitian ini digunakan DL-A-TOCOPHERYL ACETATE, nomor produk: 0420085, lot no.: UT08010021, no. analisis: 03614504 - Cu Zn SOD merupakan antioksidan endogen yang berfungsi mencegah pembentukan radikal-radikal bebas. Antioksidan ini mengubah radikal superoxidea menjadi radikal bebas peroksida Kumar, 2010. Universitas Sumatera Utara - Gambaran makroskopis ginjal mencit yaitu penilaian yang meliputi berat ginjal, warna dan konsistensi. Ginjal normal berwarna merah kecoklatan, dan konsistensinya kenyal Anggraini, 2008. - Kriteria abnormal bila ditemukan: a. Perubahan berat ginjal b. Perubahan warna c. Perubahan konsistensi Derajat kerusakan ginjal: 0 normal =Tidak terdapat kelainan. + 1 ringan =Jika ditemukan 1 dari tiga kriteria di atas + 2 sedang =Jika ditemukan 2 dari tiga kriteria di atas + 3 berat =Jika ditemukan ketiga kriteria di atas - Mikroskopis ginjal adalah pemeriksaan ginjal secara mikroskopis menggunakan mikroskop cahaya merk Olympus CX21 dengan pembesaran 40x dan 400x. Pengamatan dilakukan dengan membagi preparat dalam 4 bagian, pada setiap bagian dilihat luasnya kerusakan sel pada glomerulus yang di tandai dengan adanya hiperseluleritas yang disebabkan oleh infiltrasi dan proliferasi pada sel endotel dan mesangial, atropi yang ditandai dengan dilatasi ruang Bowman serta kontraksi glomerulus, tubulus proksimal maupun tubulus distal berupa nekrosis yang ditandai dengan degenerasi inti berupa kariopiknotik, kariorhexis dan kariolisis. Persentase luas kerusakan ginjal dari Universitas Sumatera Utara ke-4 bagian tersebut kemudian dijumlahkan dan dibagi empat. Kemudian tingkat kerusakan ginjal dinilai sebagai berikut: Santoso, et al., 2006 - Skor 1 Normal = Bila tidak ditemukan kerusakan ginjal - Skor 2 Ringan = Bila luas kerusakan ginjal seluas 25 - Skor 3 Sedang = Bila kerusakan ginjal seluas 26-50 - Skor 4 Berat = Bila kerusakan ginjal seluas 50 - Untuk memeriksa antioksidan endogen Cu Zn SOD digunakan tehnik pewarnaan immunohistokimia menggunakan SOD-1 polyclonal Antibody 3458-100, PT. Bio Vision, pengenceran 1:50. Jaringan ginjal yang telah dipotong secara serial, diwarnai dengan pewarnaan immunohistokimia Cu Zn SOD dan diamati di bawah mikroskop cahaya, dengan pembesaran mulai 40x, 100x dan 400x - Hasil pulasan immunohistokimia antioksidan Cu Zn SOD adalah tampilan pulasan berwarna coklat pada inti dan sitoplasma dari sel epitel pelapis glomerulus, tubulus renalis, serta daerah medulla Wresdiyati, et al., 2006, dinilai tampilan pewarnaan berupa: - Positif: tertampil warna coklat pada inti dan sitoplasma dari sel epitel pelapis glomerulus, tubulus renalis, serta daerah medulla. - Negatif: bila tidak tertampilnya warna coklat pada inti dan sitoplasma dari sel epitel pelapis glomerulus, tubulus renalis, serta daerah medulla. Universitas Sumatera Utara - Untuk menilai hasil pewarnaan immunohistokimia antioksidan endogen Cu Zn SOD digunakan kontrol positif jaringan yang berasal dari hepar. - Penilaian pewarnaan immunohistokimia merupakan hasil perkalian antara intensitas tampilan coklat dengan luas tampilan, dan hasil tersebut dibuat skor sebagai berikut: Svensk, et al., 2004 - 0 = negatif - 1-3 = tampilan lemah - 4-6 = tampilan sedang - 7-9 = tampilan kuat Penilaian Intensitas tampilan warna coklat yang dibandingkan dengan warna coklat yang tertampil pada kontrol positif dan diberi kategori sebagai berikut: - 0 = Tidak tertampil negatif - 1 = Intensitas warna coklat tertampil lemah - 2 = Intensitas warna coklat tertampil sedang - 3 = Intensitas warna coklat tertampil kuat Sedangkan penilaian luas tampilan hasil pewarnaan diberi skor sebagai berikut: - 0 = Tidak tertampil - 1 = Luas tampilan warna coklat 25 yang terwarnai positif - 2 = Luas tampilan warna coklat 25 – 50 yang terwarnai positif Universitas Sumatera Utara - 3 = Luas tampilan warna coklat 50 yang terwarnai positif.

3.8. Bahan dan Alat Penelitian Bahan