LOKASI PENELITIAN BAHAN DAN PERALATAN EKSTRAK CRUDE PAPAIN DARI DAUN PEPAYA CARICA

15 BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 LOKASI PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan; Laboratorium Bioproses dan Laboratorium Penelitian Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.2 BAHAN DAN PERALATAN

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini daun pepaya. Bahan kimia yang digunakan adalah aquadest, buffer fosfat, ammonium sulfat, kasein, asam trikhloroasetat TCA, dan reagen ninhidrin, tirosin. Peralatan utama yang akan digunakan adalah blender, magnetic stirrer, timbangan elektrik, alat-alat gelas, incubator, kertas saring whatman No. 4, sentrifius, dan spektrofotometer. 3.3 PROSEDUR PENELITIAN 3.3.1 Ekstraksi Papain Noviyanti dkk [12] 100 gram daun pepaya ditimbang dan diblender dengan 200 ml buffer fosfat pH 7. Campuran kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring whatman No. 4, hasil residunya dibuang dan filtratnya ditambahkan ammonium sulfat pada tingkat kejenuhan 40, 50, 60, 70, 80 dan 90. Setelah itu filtrat distirer selama 20 menit pada temperatur 4 o C sampai tercampur rata. Kemudian disentrifius dengan kecepatan 8000 rpm selama 7 menit pada temperatur 4 o C. Endapan yang terbentuk dilarutkan dengan 0,5 ml larutan 0,05 buffer fosfat pH 7 dan didiamkan selama 0, 12, 24, dan 36 jam. 3.3.2 Uji Aktivitas Protease Enggel at al [27] Kualitas papain sangat ditentukan oleh kekuatan atau kemampuan papain untuk memecah protein. Kemampuan papain ini disebut aktivitas proteolitik Proteolytic activity yang sering dinyatakan dengan satuan unit [2]. Universitas Sumatera Utara 16 Ekstrak papain sebanyak 0,1 ml dilarutkan dengan 0,1 ml larutan buffer fosfat pH 7 dan dipreinkubasi pada temperature 37 o C selama 5 menit dan ditambahkan dengan substrat 2 kasein dalam 0,05 M buffer fosfat pH 7 sebanyak 0,1 ml. kemudian diinkubasi selama 10 menit pada temperatur 37 o C. Kemudian reaksi dihentikan dengan menambahkan 0,2 ml asam trikhloroasetat TCA 0,4 M serta disentrifius pada kecepatan 1000 rpm selama 10 menit. 0,2 ml filtrat yang dihasilkan diprainkubasi selama 50 menit. Setelah itu 1 ml reagen ninhidrin. Lalu absorbansi dapat diukur dengan menggukan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 274,80 nm. Sehingga aktivitas protease dapat dihitung dengan menggunakan Persamaan : 3.1 Keterangan : tirosin : konsentrasi tirosin yang terbentuk v : volume total sampel pada tiap tabung q : waktu inkubasi p : jumlah enzim mL Fp : faktor pengenceran 3.3.3 Analisa Rendemen AOAC [28] Penghitungan rendemen dilakukan dengan menimbang crude protease yang dihasilkan kemudian dibandingkan dengan berat sampel dikalikan 100. Penghitungan rendeman dapat menggunakan Persamaan : 3.2 Keterangan: A : berat crude papain gram B : berat sampel daun pepaya gram Universitas Sumatera Utara 17 3.3.4 Analisa Kadar Air British Standar [29] Sampel yang dihasilkan dikeringkan di dalam oven pada suhu 105 o C. Selanjutnya didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai diperoleh bobot yang konstan. Penghitungan kadar air dapat menggunakan Persamaan : Kadar air = x 100 3.3 Keterangan: a : kehilangan bobot papain gram b : bobot awal papain gram Universitas Sumatera Utara 18

3.4 FLOWCHART PROSEDUR PENELITIAN

3.4.1 Flowchart Ekstraksi Papain

Mulai 100 gram daun pepaya diblender dengan 200 ml buffer fosfat pH 7 Campuran disaring dengan menggunakan kertas saring whatman No. 4 Filtrat ditambah ammonium sulfat pada tingkat kejenuhan 40 Campuran distirer pada temperatur 4 o C selama 20 menit Campuran disentrifius pada temperatur 4 o C pada kecepatan 8000 rpm selama 7 menit Endapan yang terbentuk dilarutkan dengan 0,5 ml larutan 0,05 M buffer fosfat pH 7 Selesai Diamkan selama 0 menit pada temperatur ruangan Gambar 3.1 Flowchart Ekstraksi Papain Universitas Sumatera Utara 19

3.4.2 Flowchart Uji Aktivitas Protease

Mulai Diprainkubasikan pada 37 o C temperatur selama 5 menit 0,1 ml larutan enzim ditambahkan dengan 0,1 ml larutan 0,05 M buffer fosfat Ditambahkan 0,1 ml substrat 2 kasein dalam 0,05 M larutan buffer fosfat Diinkubasikan pada 50 o C temperatur selama 10 menit 0,2 ml asam trikhloroasetat TCA 0,4 M ditambahkan Campuran disentrifius pada kecepatan 1000 rpm selama 10 menit Diprainkubasikan selama 10 menit 1 ml reagen ninhidrin ditambahkan Absorbansi diukur dengan spektrofotometer Hitung aktivitas proteasenya selesai Diambil filtrat sebanyak 0,2 ml Gambar 3.2 Flowchart Uji Aktivitas Protease Universitas Sumatera Utara 20

3.4.3 Flowchart Analisa Rendemen

Mulai Crude papain ditimbang Sampel papain dibandingkan dengan crude papain dan dikalikan 100 Selesai Gambar 3.3 Flowchart Analisa Rendemen

3.4.4 Flowchart Analisa Kadar Air

Mulai Ditimbang cawan petri kosong Ditimbang sampel + cawan Dikeringkan dalam oven pada temperatur 105 o C sampai konstan Didinginkan dalam desikator Ditimbang cawan petri dengan residu Selesai Dihitung kadar air Gambar 3.4 Flowchart Analisa Kadar Air Universitas Sumatera Utara 21 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 EKSTRAK CRUDE PAPAIN DARI DAUN PEPAYA CARICA

PAPAYA L Daun papaya merupakan salah satu bahan baku yang digunakan untuk membuat ekstrak papain. Pada penelitian ini daun pepaya yang digunakan ialah daun pepaya yang berasal dari pohon pepaya jenis pepaya Bangkok. Pengambilan sampel dilakukan pada pukul 6 pagi. Hal ini dilakukan karena waktu yang tepat untuk pengambilan getah pepaya dilakukan pada pagi hari sebelum matahari terbit, sekitar pukul 05.30 – 08.00 atau pada sore hari sebelum matahari terbenam, sekitar pukul 17.30 – 18.30. Ekstrak crude papain merupakan hasil dari sentrifugasi yang diperoleh dari filtrat daun pepaya. Hasil sentrifugasi yang diperoleh berupa sludge berwarna hijau pekat. Filtrat diperoleh dari daun papaya yang dihaluskan dengan penambahan buffer fosfat dan disaring dengan menggunakan kertas saring. Hasil penyaringan ditambahkan ammonium sulfat dengan konsentrasi 40 sampai 90 kemudian distirer selama 20 menit sampai ammonium sulfat tercampur semua pada suhu 4 o C. Pemilihan temperatur 4 o C dilakukan untuk mencegah kerusakan enzim [12]. Garam ammonium sulfat sering digunakan untuk salting out protein enzim, karena kelarutannya sangat tinggi dan pada beberapa kasus memberikan efek menstabilkan enzim [8]. Kemudian dilakukan pemisahan dengan cara sentrifugasi selama 7 menit dengan kecepatan 8000 rpm pada suhu 4 o C. Endapan yang diperoleh dipisahkan dengan menggunakan kertas saring dan direndam dengan larutan buffer fosfat 0.05 M pH 7 sebanyak 0,5 ml selama sesuai perlakuan 0 jam, 12 jam, 24 jam, dan 36 jam. Perendaman dilakukan untuk memisahkan protein enzim dari ion logam, ion logam dan molekul-molekul kecil, sehingga dapat memurnikan protein enzim [11]. Universitas Sumatera Utara 22

4.2 PENENTUAN PANJANG GELOMBANG MAKSIMUM