3.7 Pembuatan Ekstrak Daun Bangun-bangun
Pembuatan ekstrak dilakukan secara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 96. Caranya, serbuk simplisia 700 g dimasukkan kedalam
bejana yang tertutup, cairan penyari dituangi sampai semua simplisia terendam dan ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sesekali
diaduk. Kemudian, setelah 5 hari campuran tersebut diserkai, ampasnya dimaserasi dengan etanol 96 disimpan dalam bejana tertutup dan dibiarkan di
tempat sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari, kemudian dienaptuangkan. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator sehingga
diperoleh ekstrak kental Depkes RI, 1979.
3.8 Pemeriksaan Karakterisasi Ekstrak Daun Bangun-bangun
Pemeriksaan karakterisasi ekstrak daun bangun-bangun sama seperti karakterisasi yang dilakukan pada simplisia meliputi penetapan kadar air,
penetapan adar abu total, dan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam.
3.9 Uji Aktivitas Penghambatan Degranulasi Mastosit
Uji aktivitas penghambatan degranulasi mastosit meliputi penyiapan sediaan, penyiapan hewan percobaan dan uji degranulasi mastosit tersentisasi aktif.
3.9.1 Penyiapan sediaan
Penyiapan sediaan meliputi penyiapan larutan antigen putih telur ayam 50, penyiapan larutan PBS Phosphate Buffered Saline, penyiapan larutan
biru toluidin, penyiapan larutan trypan blue 0,4, penyiapan larutan uji yaitu
Universitas Sumatera Utara
ekstrak etanol daun bangun-bangun EEDBB dengan berbagai konsentrasi, penyiapan larutan aminofilin 100 µgml Alvianti, dkk., 2012.
3.9.2 Penyiapan larutan antigen putih telur ayam 50
Sebanyak 5 ml putih telur ayam ditambahkan dalam 5 ml NaCl fisiologis 0,9, kemudian dilakukan pengenceran dengan mengambil 5 ml
larutan di atas lalu dicukupkan volumenya hingga 10 ml dengan larutan NaCl fisiologis 0,9 sehingga diperoleh induk, kemudian diambil 5 ml larutan induk
dan dicukupkan volumenya hingga 10 ml dengan larutan NaCl fisiologis 0,9 sehingga diperoleh konsentrasi 50 Alvianti, dkk., 2012.
3.9.3 Penyiapan larutan phosphate buffered saline PBS
Phosphate Buffered Saline PBS adalah larutan penyangga yang umum digunakan dalam penelitian. Pembuatan PBS dilakukan dengan cara sebagai
berikut: sebanyak 8 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 1,44 gram Na
2
HPO
4,
0,24 gram KH
2
PO
4
, dilarutkan dalam 800 ml aqua bidestilasi, kemudian dicek pH dengan indikator pH hingga pH ± 7 dan dapat disesuaikan dengan penambahan HCl
atau NaOH, tambahkan aqua bidestilasi hingga 1 L Alvianti, dkk., 2012.
3.9.4 Penyiapan larutan biru toluidin
Sebanyak 39 ml larutan NaCl fisiologis 0,9 dicampur dengan 1 ml asam asetat glasial, 10 ml formaldehid 37 vv dan 50 ml etanol 95 vv,
kemudian campuran dikocok dan ditambahkan biru toluidin sebanyak 100 mg dan dikocok lagi hingga larut Handayani, dkk., 2008.
3.9.5 Penyiapan larutan trypan blue 0,4
Sebanyak 200 mg serbuk trypan blue dilarutkan dalam 50 ml larutan PBS dengan pH ±7 dan dikocok hingga larut.
Universitas Sumatera Utara
3.9.6 Penyiapan larutan ekstrak etanol daun bangun-bangun EEDBB
Sebanyak 100 mg ekstrak etanol daun bangun-bangun dilarutkan dalam 1 ml larutan DMSO 1 sehingga didapatkan konsentrasi 100 mgml, kemudian
dilakukan pengenceran dengan mengambil 0,1 ml larutan ekstrak etanol daun bangun-bangun konsentrasi 100 mgml di atas lalu ditambahkan dengan larutan
DMSO 1 hingga 1 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10.000 μgml, kemudian diambil 0,1 ml larutan ekstrak etanol daun bangun-bangun
konsentr asi 10.000 μgml di atas dan ditambahkan dengan larutan DMSO 1
hingga volume 1 ml sehingga diperoleh k onsentrasi 1.000 μgml, lalu diambil
0,1 ml larutan ekstrak etanol daun bangun-bangun konsentrasi 1.000 μgml
ditambahkan dengan larutan DMSO 1 hingga 1 ml sehingga diperoleh konsentrasi 100 ugml, lalu diambil 0,36 ml larutan ekstrak etanol daun
bangun- bangun konsentrasi 100 μgml ditambahkan dengan larutan DMSO
1 hingga 6 ml sehingga diperoleh konsentrasi 6 ugml, demikian seterusnya sampai diperoleh konsentrasi 5 μgml, 4 μgml, γ μgml, β μgml. Perhitungan
terlampir pada Lampiran 9, halaman 71.
3.9.7 Penyiapan larutan aminofilin 100 µgml
Sebanyak β1 μl larutan aminofilin injeksi dengan konsentrasi dosis 24 mgml, dipipet dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam
labu tentukur 5 ml. Kemudian dilakukan pengenceran dengan penambahan larutan dimetil sulfoksida DMSO 1 hingga 5 ml, sehingga diperoleh
konsentrasi 100 μgml Alvianti, dkk., β01β. Perhitungan terlampir pada
Lampiran 10, halaman 73.
Universitas Sumatera Utara
3.9.8 Penyiapan hewan percobaan
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan sehat dengan berat 35 g berumur 3 bulan sebanyak 5 ekor yang mendapat perlakuan yang sama. Tiap 1
ekor mencit diambil cairan intraperitonealnya dan dibagi atas 8 kelompok: Kelompok 1 Normal:
Suspensi mastosit yang tidak diberi penambahan larutan antigen putih telur ayam maupun EEDBB dan aminofilin.
Kelompok 2 Kontrol positif: Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur
ayam 50 dan larutan aminofilin 100 µgml. Kelompok 3 Kontrol negatif:
Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur ayam 50 dan DMSO 1 tetapi tidak diberikan EEDBB
ataupun aminofilin. Kelompok 4 Uji 1:
Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur ayam 50 dan EEDBB 2µ gml.
Kelompok 5 Uji 2: Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur
ayam 50 dan EEDBB 3µ gml. Kelompok 6 Uji 3:
Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur ayam 50 dan EEDBB 4µ gml.
Universitas Sumatera Utara
Kelompok 7 Uji 4: Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur
ayam 50 dan EEDBB 5µ gml. Kelompok 8 Uji 5:
Suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen putih telur
ayam 50 dan EEDBB 6µ gml. 3.9.9 Perhitungan sel pada hemocytometer
Hemositometer terdiri dari 4 kamar hitung A, B, C, dan D, setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak, hitung sel pada 4 kamar hemositometer
dengan menggunakan mikroskop. Hitung jumlah sel per ml dengan rumus Louis, 2011:
3.9.10 Penyiapan suspensi mastosit tersensitisasi aktif
Sebanyak 5 ekor mencit sehat dengan berat badan 35 g disensitisasi oleh antigen putih telur ayam. Mencit disuntik secara intraperitoneal dengan
0,3 ml antigen putih telur ayam 50, pada hari ke-1. Pada hari ke-3 dan hari ke-5 diulangi lagi penyuntikan antigen putih telur ayam 50 sebanyak 0,05 ml
secara intra plantar. Pada hari ke-10 setelah penyuntikan pertama dilakukan isolasi mastosit dari cairan intraperitoneal Choudary, 2010; Vogel, 2008,
mencit dipuasakan selama 18 jam, kemudian mencit yang telah dipuasakan langsung dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan segera disuntik dengan
10 ml larutan PBS yang telah ditambah dengan gelatin 0,1 dan heparin 50 μgml secara intraperitoneal, lalu bagian perut dipijat secara perlahan-lahan
Universitas Sumatera Utara
selama 10 menit, dibedah secara hati-hati dan diambil cairan peritoneal sebanyak mungkin, masukkan ke dalam tabung sentrifuge dan sentrifuge
selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm, bagian supernatan dibuang dan endapan dicuci dua kali dengan larutan PBS sama banyak, kemudian endapan
diambil dan dicukupkan volume hingga 2 ml dengan larutan PBS dan siap untuk pengujian Alvianti, dkk., 2012.
3.9.11 Uji ketahanan sel Cell Viability Test
Uji ketahanan sel dilakukan untuk melihat sel uji yang tetap utuh dengan penambahan larutan uji dosis maksimal dan diinkubasi selama
beberapa jam. Pengujian ini menggunakan metode pewarnaan oleh trypan blue, sel yang utuh adalah sel yang tidak berwarna, sedangkan sel yang
terdegranulasi adalah sel yang berwarna biru. Sebanyak 50 µl suspensi mastosit yang telah diisolasi dari peritoneal mencit,
dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 50 µl larutan uji EEDBB 6 µgml dan ditepuk-tepuk secara perlahan sampai homogen. Inkubasi
pada suhu 37
o
C selama 1 jam. Diambil 100 µl larutan tersebut kemudian ditambahkan 100 µl larutan trypan blue 0,4 dan ditepuk-tepuk secara
perlahan sampai homogen. Teteskan larutan 10 µl di atas hemositometer dan hitung sel yang berwarna biru dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 40.
Persen ketahanan sel dihitung dengan rumus sebagai berikut Sudira, 2011: Vs =
100 x
Nsm Nsh
Nsh
Dimana: Vs = Persen viable sel
Nsh = Jumlah sel berwarna bening
Nsm = Jumlah sel biru.
Universitas Sumatera Utara
3.9.12 Uji degranulasi mastosit tersensitisasi aktif
Sebanyak 5 ekor mencit yang diambil cairan intraperitonialnya mendapat perlakuan yang sama sebagai berikut:
1. Penghitungan jumlah mastosit tersensitisasi kelompok normal.
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 40 µl PBS, 10 µl biru toluidin.
2. Penghitungan jumlah mastosit yang tidak terdegranulasi oleh DMSO 1
kelompok kontrol negatif. Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl DMSO 1, 10 µl
antigen putih telur ayam 50, dan 10 µl biru toluidin. 3.
Pengujian aktivitas penghambatan degranulasi mastosit oleh aminofilin kelompok kontrol positif.
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl Aminofilin 100 µgml, 10 µl antigen putih telur ayam 50, dan 10 µl biru toluidin.
4. Pengujian aktivitas penghambatan degranulasi mastosit oleh ekstrak etanol
daun bangun-bangun kelompok uji dengan konsentrasi sebagai berikut: -
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDBB 2 µgml, 10 µl antigen putih telur ayam 50, dan 10 µl biru toluidin.
- Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDBB 3 µgml,
10 µl antigen putih telur ayam 50, dan 10 µl biru toluidin. -
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDBB 4 µgml, 10 µl antigen putih telur ayam 50, dan 10 µl biru toluidin.
- Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDBB 5 µgml,
10 µl antigen putih telur ayam 50, dan 10 µl biru toluidin.
Universitas Sumatera Utara
- Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDBB 6 µgml,
10 µl antigen putih telur ayam 50, dan 10 µl biru toluidin. Tiap campuran yang diperoleh dari tiap kelompok ditepuk-tepuk secara
perlahan agar campuran homogen, kemudian diinkubasi selama 30 menit padasuhu 37
o
C. Kemudian campuran diteteskan di atas hemositometer dan dihitung jumlah mastosit di bawah mikroskop dengan pembesaran 10 x 40.
mastosit yang tidak terdegranulasi akan tampak berwarna keunguan karena adanya pewarnaan oleh larutan biru toluidin Handayani, dkk., 2008.
3.9.13 Penghitungan persen jumlah mastosit terdegranulasi
Efek penghambatan degranulasi mastosit oleh ekstrak etanol daun bangun- bangun ditentukan dengan menghitung jumlah mastosit yang tidak
terdegranulasi menggunakan alat hemositometer. Kemudian dari jumlah mastosit yang didapat, dihitung persentase degranulasi mastosit dengan cara
sebagai berikut Handayani, dkk., 2008. Degranulasi =
x 100 Dimana:
P = Jumlah mastosit sebelum perlakuan
S = Jumlah mastosit setelah perlakuan
3.10 Analisis Data
Kategori