dan Pasar Modern PG
4
dan PM
4
. Untuk ikan gurami diberi kode PG dan ikan mas diberi kode PM.
3.5 Prosedur Penelitian 3.5.1 Penyiapan Bahan
3.5.1.1 Pembuatan Pelarut
Pelarut terdiri dari campuran metanol HPLC grade dan air dengan perbandingan 55 : 45 perbandingan fase gerak hasil optimasi.
3.5.1.2 Pembuatan Fase Gerak Metanol - Air
Metanol 500 ml disaring dengan menggunakan penyaring PTFE 0,5 µm dan diawaudarakan selama 30 menit.
Air 500 ml disaring dengan menggunakan penyaring nitrat selulosa 0,45 µ m dan diawaudarakan selama 30 menit.
3.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Sejumlah 50 mg bahan baku kloramfenikol ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan 5 ml metanol lalu dicukupkan
sampai garis tanda dengan air dan dikocok sampai homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 µgml, larutan induk baku I LIB I. Dipipet
sebanyak 1,5 ml LIB I, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan sampai garis tanda dengan air dan dikocok sampai homogen, sehingga diperoleh
larutan dengan konsentrasi 15 µgml. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 200 - 400 nm.
3.5.3 Prosedur Analisis 3.5.3.1 Penyiapan Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Universitas Sumatera Utara
Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan C18 250 mm x 4,60 mm, detektor UV-VIS pada panjang gelombang analisis yang diperoleh. Pompa
menggunakan mode aliran tetap dengan sistem elusi isokratik. Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak
dibiarkan mengalir selama 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar, menandakan sistem tersebut telah stabil.
3.5.3.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Kloramfenikol
Sejumlah 50 mg Baku Pembanding kloramfenikol ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu tentukur 250 ml, dilarutkan dengan 5 ml metanol
kemudian dicukupkan sampai garis tanda dengan pelarut dan dikocok sampai homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 200 µgml, Larutan
Induk Baku LIB I.
3.5.3.3 Penentuan Perbandingan Komposisi Fase Gerak yang Optimum untuk Analisa
Larutan Induk Baku kloramfenikol dipipet 5 ml dan dimasukkan ke dalam
labu tentukur 100 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda dan dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 10
µgml, disaring dengan penyaring nitrat selulosa 0,2 µm, diawaudarakan selama 10 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam sistem KCKT menggunakan vial
autosampler sebanyak 10 µ l, menggunakan fase gerak metanol - air, dengan perbandingan 40 : 60, 50 : 50, 55 : 45, 60 : 40, 65 : 35, 70 : 30, dan 75 :
25, dengan laju alir 1 mlmenit, dan dideteksi pada panjang gelombang 278 nm.
3.5.3.4 Pembuatan Kurva Kalibrasi Kloramfenikol Baku
Larutan Induk Baku LIB I dipipet sebanyak 5 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, dikocok
Universitas Sumatera Utara
hingga homogen sehingga diperoleh larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 10 µgml, Larutan Induk Baku II LIB II. Larutan Induk Baku II dipipet 0,3 ; 0,7 ; 1
; 3 ; 5 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda, dikocok sampai homogen sehingga diperoleh konsentrasi 0,03
; 0,07 ; 0,1 ; 0,3 ; 0,5 µgml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan penyaring nitrat selulosa 0,2 µm, dan diinjeksikan ke sistem KCKT menggunakan
vial autosampler sebanyak 10 µ l dideteksi pada panjang gelombang maksimum yang dipilih 278 nm. Selanjutnya dari luas area yang diperoleh pada kromatogram
dibuat kurva kalibrasi, dihitung persamaan garis regresi dan faktor korelasinya.
3.5.3.5 Preparasi Sampel
Ikan gurami dan ikan mas dengan berat 500 g, dicuci bersih, sisiknya dibersihkan, dipisahkan seluruh bagian daging dari tulangnya, dikumpulkan
seluruh dagingnya, dihaluskan dengan blender, diaduk agar homogen, ditimbang kurang lebih sebanyak 5 g.
3.5.3.6 Penetapan Kadar Residu Kloramfenikol dalam Sampel
Sampel yang telah homogen dan ditimbang sebanyak 5 g, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus bertutup, ditambahkan 10 ml asetonitril dikocok dengan
vortex selama 30 detik, dan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipisahkan dari endapan. Kemudian ditambahkan Asetonitril
10 ml ke dalam endapan, dikocok dengan vortex selama 30 detik, dan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipisahkan dari endapan
dan digabungkan dengan supernatan pertama. Gabungan supernatan ditambahkan 1,5 g NaCl, dikocok dengan vortex selama 1 menit, dan disentrifus dengan
kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipisahkan dari endapan.
Universitas Sumatera Utara
Supernatan ditambahkan 5 ml n-heksana, dikocok dengan vortex selama 30 detik, dan didiamkan sampai terpisah sempurna hingga terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan
n-heksan di bagian atas dan lapisan asetonitril di bagian bawah. Lapisan n-heksan dibuang dengan menggunakan pipet secara hati-hati. Perlakuan n-heksan diulangi
sekali lagi. Lapisan asetonitril dikeringkan dengan alat penguap. Ekstrak dilarutkan hingga 5 ml dengan pelarut kemudian disaring dengan penyaring nitrat
selulosa 0,2 µ m, dan diawaudarakan selama 10 menit, kemudian diinjeksikan sebanyak 10 µ l ke sistem KCKT menggunakan vial autosampler dan dideteksi
pada panjang gelombang maksimum yang dipilih 278 nm dengan perbandingan fase gerak metanol : air 55:45 dan laju alir 1 mlmenit. Dilakukan sebanyak 6
kali pengulangan untuk setiap sampel. Kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas area sampel pada Y dari persamaan regresi : Y = aX + b.
Bagan penetapan kadar residu kloramfenikol dalam sampel dapat dilihat pada gambar 1.
Universitas Sumatera Utara
Berdasarkan metode SNI 7541.1:09, bagan penetapan kadar residu kloramfenikol dalam ikan adalah sebagai berikut:
5 gram ikan yang telah dihomogenkan ditambah 10 ml asetonitril
disentrifus 10 menit dikocok 30 detik dengan vortex
supernatan I endapan
ditambah 10 ml asetonitril dikocok 30 detik dengan vortex
disentrifus 10 menit
supernatan II endapan
kumpulan supernatan I dan II ditambah 1,5 g NaCl
dikocok 60 detik dengan vortex disentrifus 5 menit
endapan supernatan
ditambah 5 ml n-heksan dikocok 30 detik dengan vortex
dua lapisan
Universitas Sumatera Utara
Lanjutan
Gambar 5 . Bagan Prosedur Penetapan Kadar Residu Kloramfenikol dalam
Sampel.
3.5.3.7 Analisis Data Secara Statistik
Menurut Usman dan Purnomo 2006 data perhitungan kadar dianalisis secara statistik menggunakan uji t.
Rumus yang digunakan untuk menghitung simpangan baku adalah:
1
2
− −
=
∑
n X
X SD
Sedangkan untuk mendapatkan t
hitung
digunakan rumus: t
hitung
n SD
X X
− =
Dua lapisan
lapisan atas n-heksan
lapisan bawah asetonitril
diuapkan hingga hampir kering dilarutkan dengan fase gerak
sampai 5ml larutan uji
Diulangi perlakuan n-heksan dengan cara yang sama
Hasil dianalisis secara KCKT
dengan fase gerak metanol – air 55:45, laju alir 1
mlmenit, pada panjang gelombang 278 nm.
dibuang
Universitas Sumatera Utara
Data diterima jika -t
tabel
t
hitung
t
tabel
pada interval kepercayaan 95 dengan derajat kebebasan dk= n-
1 dan nilai α = 0,05 Keterangan :
SD = Standard deviationsimpangan baku
X = Kadar dalam satu perlakuan
X
= Kadar rata-rata dalam satu sampel n
= Jumlah perlakuan Untuk menghitung kadar kloramfenikol dalam sampel secara statistik
dapat digunakan rumus: Kadar Kloramfenikol
μ=
X
n SD
x t
dk .
2 1
1 α
−
± Keterangan:
μ = Kadar sebenarnya X = Kadar sampel
n = Jumlah perlakuan t = Harga t
tabel
sesuai dengan derajat kepercayaan dk= Derajad kebebasan.
3.5.4 Metode Validasi 3.5.4.1 Akurasi