Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Prosedur Analisis .1 Penyiapan Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

dan Pasar Modern PG 4 dan PM 4 . Untuk ikan gurami diberi kode PG dan ikan mas diberi kode PM. 3.5 Prosedur Penelitian 3.5.1 Penyiapan Bahan

3.5.1.1 Pembuatan Pelarut

Pelarut terdiri dari campuran metanol HPLC grade dan air dengan perbandingan 55 : 45 perbandingan fase gerak hasil optimasi.

3.5.1.2 Pembuatan Fase Gerak Metanol - Air

Metanol 500 ml disaring dengan menggunakan penyaring PTFE 0,5 µm dan diawaudarakan selama 30 menit. Air 500 ml disaring dengan menggunakan penyaring nitrat selulosa 0,45 µ m dan diawaudarakan selama 30 menit.

3.5.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Sejumlah 50 mg bahan baku kloramfenikol ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml, dilarutkan dengan 5 ml metanol lalu dicukupkan sampai garis tanda dengan air dan dikocok sampai homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 µgml, larutan induk baku I LIB I. Dipipet sebanyak 1,5 ml LIB I, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan sampai garis tanda dengan air dan dikocok sampai homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 15 µgml. Larutan diukur serapannya pada panjang gelombang 200 - 400 nm. 3.5.3 Prosedur Analisis 3.5.3.1 Penyiapan Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Universitas Sumatera Utara Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan C18 250 mm x 4,60 mm, detektor UV-VIS pada panjang gelombang analisis yang diperoleh. Pompa menggunakan mode aliran tetap dengan sistem elusi isokratik. Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir selama 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar, menandakan sistem tersebut telah stabil.

3.5.3.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Kloramfenikol

Sejumlah 50 mg Baku Pembanding kloramfenikol ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu tentukur 250 ml, dilarutkan dengan 5 ml metanol kemudian dicukupkan sampai garis tanda dengan pelarut dan dikocok sampai homogen, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 200 µgml, Larutan Induk Baku LIB I.

3.5.3.3 Penentuan Perbandingan Komposisi Fase Gerak yang Optimum untuk Analisa

Larutan Induk Baku kloramfenikol dipipet 5 ml dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda dan dikocok sampai homogen sehingga diperoleh larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 10 µgml, disaring dengan penyaring nitrat selulosa 0,2 µm, diawaudarakan selama 10 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam sistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10 µ l, menggunakan fase gerak metanol - air, dengan perbandingan 40 : 60, 50 : 50, 55 : 45, 60 : 40, 65 : 35, 70 : 30, dan 75 : 25, dengan laju alir 1 mlmenit, dan dideteksi pada panjang gelombang 278 nm.

3.5.3.4 Pembuatan Kurva Kalibrasi Kloramfenikol Baku

Larutan Induk Baku LIB I dipipet sebanyak 5 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, dikocok Universitas Sumatera Utara hingga homogen sehingga diperoleh larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 10 µgml, Larutan Induk Baku II LIB II. Larutan Induk Baku II dipipet 0,3 ; 0,7 ; 1 ; 3 ; 5 ml dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda, dikocok sampai homogen sehingga diperoleh konsentrasi 0,03 ; 0,07 ; 0,1 ; 0,3 ; 0,5 µgml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan penyaring nitrat selulosa 0,2 µm, dan diinjeksikan ke sistem KCKT menggunakan vial autosampler sebanyak 10 µ l dideteksi pada panjang gelombang maksimum yang dipilih 278 nm. Selanjutnya dari luas area yang diperoleh pada kromatogram dibuat kurva kalibrasi, dihitung persamaan garis regresi dan faktor korelasinya.

3.5.3.5 Preparasi Sampel

Ikan gurami dan ikan mas dengan berat 500 g, dicuci bersih, sisiknya dibersihkan, dipisahkan seluruh bagian daging dari tulangnya, dikumpulkan seluruh dagingnya, dihaluskan dengan blender, diaduk agar homogen, ditimbang kurang lebih sebanyak 5 g.

3.5.3.6 Penetapan Kadar Residu Kloramfenikol dalam Sampel

Sampel yang telah homogen dan ditimbang sebanyak 5 g, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus bertutup, ditambahkan 10 ml asetonitril dikocok dengan vortex selama 30 detik, dan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipisahkan dari endapan. Kemudian ditambahkan Asetonitril 10 ml ke dalam endapan, dikocok dengan vortex selama 30 detik, dan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipisahkan dari endapan dan digabungkan dengan supernatan pertama. Gabungan supernatan ditambahkan 1,5 g NaCl, dikocok dengan vortex selama 1 menit, dan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipisahkan dari endapan. Universitas Sumatera Utara Supernatan ditambahkan 5 ml n-heksana, dikocok dengan vortex selama 30 detik, dan didiamkan sampai terpisah sempurna hingga terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan n-heksan di bagian atas dan lapisan asetonitril di bagian bawah. Lapisan n-heksan dibuang dengan menggunakan pipet secara hati-hati. Perlakuan n-heksan diulangi sekali lagi. Lapisan asetonitril dikeringkan dengan alat penguap. Ekstrak dilarutkan hingga 5 ml dengan pelarut kemudian disaring dengan penyaring nitrat selulosa 0,2 µ m, dan diawaudarakan selama 10 menit, kemudian diinjeksikan sebanyak 10 µ l ke sistem KCKT menggunakan vial autosampler dan dideteksi pada panjang gelombang maksimum yang dipilih 278 nm dengan perbandingan fase gerak metanol : air 55:45 dan laju alir 1 mlmenit. Dilakukan sebanyak 6 kali pengulangan untuk setiap sampel. Kadar dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas area sampel pada Y dari persamaan regresi : Y = aX + b. Bagan penetapan kadar residu kloramfenikol dalam sampel dapat dilihat pada gambar 1. Universitas Sumatera Utara Berdasarkan metode SNI 7541.1:09, bagan penetapan kadar residu kloramfenikol dalam ikan adalah sebagai berikut: 5 gram ikan yang telah dihomogenkan ditambah 10 ml asetonitril disentrifus 10 menit dikocok 30 detik dengan vortex supernatan I endapan ditambah 10 ml asetonitril dikocok 30 detik dengan vortex disentrifus 10 menit supernatan II endapan kumpulan supernatan I dan II ditambah 1,5 g NaCl dikocok 60 detik dengan vortex disentrifus 5 menit endapan supernatan ditambah 5 ml n-heksan dikocok 30 detik dengan vortex dua lapisan Universitas Sumatera Utara Lanjutan Gambar 5 . Bagan Prosedur Penetapan Kadar Residu Kloramfenikol dalam Sampel.

3.5.3.7 Analisis Data Secara Statistik

Menurut Usman dan Purnomo 2006 data perhitungan kadar dianalisis secara statistik menggunakan uji t. Rumus yang digunakan untuk menghitung simpangan baku adalah: 1 2 − − = ∑ n X X SD Sedangkan untuk mendapatkan t hitung digunakan rumus: t hitung n SD X X − = Dua lapisan lapisan atas n-heksan lapisan bawah asetonitril diuapkan hingga hampir kering dilarutkan dengan fase gerak sampai 5ml larutan uji Diulangi perlakuan n-heksan dengan cara yang sama Hasil dianalisis secara KCKT dengan fase gerak metanol – air 55:45, laju alir 1 mlmenit, pada panjang gelombang 278 nm. dibuang Universitas Sumatera Utara Data diterima jika -t tabel t hitung t tabel pada interval kepercayaan 95 dengan derajat kebebasan dk= n- 1 dan nilai α = 0,05 Keterangan : SD = Standard deviationsimpangan baku X = Kadar dalam satu perlakuan X = Kadar rata-rata dalam satu sampel n = Jumlah perlakuan Untuk menghitung kadar kloramfenikol dalam sampel secara statistik dapat digunakan rumus: Kadar Kloramfenikol μ= X n SD x t dk . 2 1 1 α − ± Keterangan: μ = Kadar sebenarnya X = Kadar sampel n = Jumlah perlakuan t = Harga t tabel sesuai dengan derajat kepercayaan dk= Derajad kebebasan. 3.5.4 Metode Validasi 3.5.4.1 Akurasi