Penentuan Kondisi Kromatografi untuk Mendapatkan Hasil Analisis yang Optimum Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Kloramfenikol Baku Penetapan Kadar Residu Kloramfenikol dalam Sampel

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penentuan Kondisi Kromatografi untuk Mendapatkan Hasil Analisis yang Optimum

Panjang gelombang analisis ditentukan dengan membuat kurva serapan kloramfenikol baku menggunakan spektrofotometer Ultraviolet UV . Spektrum hasil pengukuran kloramfenikol baku dapat dilihat pada gambar 6 Gambar 6. Kurva Serapan Kloramfenikol Baku 15 ppm Secara S pektrofotometri UV Dari kurva diatas, dapat dilihat bahwa kloramfenikol memberikan serapan pada panjang gelombang 278 nm. Hasil yang diperoleh berbeda dengan panjang gelombang yang digunakan dalam prosedur SNI 7541.1:2009 yang menjadi pedoman pada penelitian ini. Dimana menurut SNI 7541.1:2009, panjang gelombang kloramfenikol yang digunakan adalah 270 nm. Namun menurut Ditjen POM 1979 dan Moffat et all 2005, kloramfenikol memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang 278 nm. Selisih panjang gelombang Universitas Sumatera Utara maksimum yang didapat adalah 8 nm. Berdasarkan hal tersebut maka analisis kloramfenikol dalam penelitian ini digunakan panjang gelombang 278 nm.

4.2 Penentuan Linearitas Kurva Kalibrasi Kloramfenikol Baku

Kurva kalibrasi kloramfenikol Baku dibuat dengan konsentrasi 0,03 ; 0,07 ; 0,1 ; 0,3 ; 0,5 µgml. Dari kurva kalibrasi diperoleh hubungan yang linier antara luas area dan konsentrasi dengan koefisien korelasi r = 0,9997. Koefisien korelasi yang diperoleh ini masih dalam batas penerimaan nilai koefisien korelasi yaitu r = 0,995 Moffat, et all. Dari hasil perhitungan, diperoleh persamaan regresi 5765 , 44 4589 , 15754 − = X Y . Kurva kalibrasi kloramfenikol dapat dilihat pada gambar 7. Gambar 7. Kurva Kalibrasi Kloramfenikol Baku Universitas Sumatera Utara Kromatogram hasil penyuntikan larutan kloramfenikol Baku untuk penentuan kurva kalibrasi dapat dilihat pada lampiran 2. Hal. 49 dan perhitungan persamaan regresi dapat dilihat pada lampiran 3, Hal. 52.

4.3 Penetapan Kadar Residu Kloramfenikol dalam Sampel

Penetapan kadar residu kloramfenikol dalam ikan gurami dan ikan mas telah dilakukan mengikuti prosedur SNI 7541.1:2009, menggunakan fase gerak metanol – air dengan perbandingan 50:50. Tetapi dari hasil penelitian tidak diperoleh kondisi yang sesuai dan hasil yang kurang baik, dimana waktu tambat yang dihasilkan terlalu lama dan jumlah lempeng yang kurang begitu besar. Oleh karena itu, di lakukan optimasi fase gerak dengan memvariasikan komposisi metanol dan air. Waktu tambat kloramfenikol yang diperoleh pada perbandingan 50:50 adalah 7,71 menit dengan nilai asimetris 2,05 sedangkan pada perbandingan 55:45 diperoleh waktu tambat yang relatif singkat yaitu 5,95 menit dengan nilai asimetri 1,83 dan nilai lempeng teoritis yang paling besar diantara perbandingan fase gerak lainnya. Menurut Rohman, 2007, Jumlah lempeng merupakan salah satu parameter yang digunakan untuk menilai kualitas pemisahan kromatografi yakni efisiensi. Oleh karena itu, semakin besar jumlah lempeng yang dihasilkan akan menunjukkan bahwa kolom mampu memisahkan komponen dalam campuran dengan baik berarti efisiensi kolom besar. Berdasarkan hal tersebut maka perbandingan komposisi fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah metanol – air 55:45 dengan laju alir 1mlmenit. Data hasil analisis perbandingan komposisi fase gerak dapat dilihat pada tabel 1. Kromatogram kloramfenikol baku untuk mencari perbandingan komposisi fase gerak yang optimal dapat dilihat pada lampiran 1 Hal. 45. Universitas Sumatera Utara Tabel 1. Data Hasil Analisis Kloramfenikol Baku 10 ppm pada Berbagai Perbandingan Komposisi Fase Gerak Perbandingan Fase Gerak Waktu tambat menit Asym Jumlah Lempeng Teoritis N Metanol Air 40 60 14,49 2,56 3685 50 50 7,71 2,05 2840 55 45 5,95 1,83 4050 60 40 4,83 1,91 3705 65 35 4,11 1,86 3355 70 30 3,61 1,87 2889 75 25 3,29 2,04 2673 Dari hasil penyuntikan larutan sampel diperoleh waktu tambat salah satu puncak yaitu 6,02 menit. Waktu tambat ini berdekatan dengan waktu tambat kloramfenikol baku yang dianalisis dengan KCKT pada kondisi yang sama yaitu 5,96 menit. Meskipun waktu tambat yang dihasilkan tidak sama persis, namun puncak yang diamati dalam kromatogram sampel dapat diterima sebagai puncak kloramfenikol karena waktu tambat 6,02 menit masih berada pada rentang waktu tambat yang diterima dan pada sampel blanko tidak terlihat adanya puncak kloramfenikol pada menit 5-6 gambar 8D . Menurut Wetson and Brown 1997, rentang waktu tambat yang dapat diterima yaitu ± 5 dari waktu tambat baku. Kedua kromatogram hasil analisis KCKT dapat dilihat pada gambar 8A dan 8B. Maka untuk mempertegas hal tersebut, ditambahkan sedikit larutan kloramfenikol baku ke dalam larutan sampel spiking method, lalu dianalisis kembali dengan KCKT pada kondisi yang sama. Hasil analisis menunjukkan terjadi peningkatan luas dan tinggi puncak kloramfenikol dari yang diamati sebelumnya. Jadi dapat disimpulkan bahwa puncak yang diamati dalam larutan sampel adalah benar merupakan puncak kloramfenikol. Kromatogram larutan sampel yang dianalisis setelah spiking dapat dilihat pada gambar 8C. Universitas Sumatera Utara RT Luas Puncak 5,95 166900 A RT Luas Puncak 6,05 2762 B C RT Luas Puncak 6,02 34807 D Gambar 8. Kromatogram Hasil Penyuntikan Kloramfenikol Baku 10 ppm A, Larutan Sampel Ikan B, dan Larutan Sampel yang telah di-Spike dengan Larutan Baku Pembanding Kloramfenikol C Larutan Sampel Blanko D dengan Kondisi KCKT yang Sama. Universitas Sumatera Utara Hasil pengolahan data penyuntikan larutan sampel secara KCKT menggunakan kolom C18 Phenomenex dengan perbandingan fase gerak metanol - air 55 : 45, volume penyuntikan 10 µ l, laju alir 1 mlmenit, detektor UV - V is L - 2420 pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh 278 nm. Kadar residu kloramfenikol dapat dihitung dengan mensubtitusikan luas area pada Y dari persamaan regresi 5765 , 44 4589 , 15754 − = X Y . Hasil perhitungan residu kloramfenikol dalam sampel setelah diuji secara statistik dapat dilihat pada tabel2. Tabel 2. Hasil Penetapan Kadar Kloramfenikol dalam Sampel Ikan Gurami dan Ikan Mas Secara Statistik NO. Ikan Gurami Osphronemus goramy Rentang Kadar Residu Kloramfenikol mgkg 1 Ikan Gurami PG 1 0,0617±0,0162 2 Ikan Gurami PG 2 0,0786 ±0,0045 3 Ikan Gurami PG 3 0,1190±0,0111 4 Ikan Gurami PG 4 0,0767±0,0048 NO. Ikan Mas Cyprinus carpio Rentang Kadar Residu Kloramfenikol mgkg 1 Ikan Mas PM 1 0,0676±0,0035 2 Ikan Mas PM 2 0,0735±0,0094 3 Ikan Mas PM 3 0,2169±0,0448 4 Ikan Mas PM 4 0,2092±0,0075 Berdasarkan data tersebut, residu kloramfenikol yang di peroleh dari empat pasar di kota Binjai tidak memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan oleh RSNI No. : 05 – TAN – 1996.

4.4 Hasil Uji Validasi