b. Inokulasi dengan 1 mL kultur yang telah didiamkan semalam.
c. Inkubasi dalam shaker dengan kecepatan 150 rpm selama 12 jam pada suhu
50 C.
d. Diperoleh cairan fermentasi enzimatik.
e. Selanjutnya cairan fermentasi tersebut disentrifuge dengan kecepatan 5000
rpm selama 15 menit, sehingga diperoleh supernatant Guangrong, 2006.
3.4.5. Karakterisasi Aktivitas Katalitik Protease Isolat Bakteri Termofilik.
a. Penentuan Waktu Inkubasi Optimum Protease Termofilik
1. 400 µL larutan kasein 1 dalam buffer fosfat pH 7,2.
2. Tambahkan 100 µL cairan enzimatis, aduk pelan-pelan.
3. Diperoleh campuran reaksi enzimatis aktif.
4. Inkubasi dengan waktu inkubasi divariasi : 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 dan 40
menit pada suhu 65 C.
5. Tambahkan 1 ml 10 asam trikloro asetat untuk menghentikan aktivitas
enzimnya. 6.
Disentrifuge dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. 7.
Diperoleh pelet dan supernatan, supernatan diukur absorbansinya pada λ 275 nm melawan blanko.
8. Untuk menentukan waktu optimum, kita membuat kurva kalibrasi larutan
Tirosin metode Horikoshi kemudian mengalurkannya dengan absorbansi. Setelah diperoleh persamaan y = ax + b, aktivitas enzim dapat dihitung dengan
rumus aktivitas enzim yaitu : x volume
-1
x waktu
-1
Se bagai kontrol digunakan 100 µL cairan enzimatis yang sudah dimatikan
dengan pemanasan dalam penangas air, dan dilakukan perlakuan yang sama dengan supernatan Guangrong, 2006.
b. Penentuan Suhu Optimum Protease Termofilik
1. 400 µL kasein 1 dalam buffer fosfat pH 7,2.
2. Tambahkan 100 µL cairan enzimatis, aduk pelan-pelan.
3. Diperoleh campuran reaksi enzimatis aktif.
4. Inkubasi dengan suhu inkubasi divariasi : 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75 dan
80 C selama 30 menit.
5. Tambahkan 1 ml 10 asam trikloro asetat untuk menghentikan aktivitas
enzimnya. 6.
Disentrifuge dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. 7.
Diperoleh pelet dan supernatan, supernatan diukur absorbansiny a pada λ 275
nm melawan blanko Guangrong, 2006. 8.
Sebagai kontrol digunakan 100 µL cairan enzimatis yang sudah dimatikan dengan pemanasan dalam penangas air, dan dilakukan perlakuan yang sama
dengan supernatan. 9.
Untuk menentukan suhu optimum, kita membuat kurva kalibrasi larutan Tirosin metode Horikoshi kemudian mengalurkannya dengan absorbansi.
Setelah diperoleh persamaan y = ax + b, aktivitas enzim dapat dihitung dengan rumus aktivitas enzim.
c. Penentuan pH Optimum Protease Termofilik
