BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental. Penelitian meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, identifikasi bahan
tumbuhan, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak n- heksan, pembuatan ekstrak etil asetat, pembuatan ekstrak etanol, dan uji
aktivitas antioksidan dengan metode β-karoten-asam linoleat dengan
menggunakan alat spektrofotometer visibel.
3.1 Alat-Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi alat-alat gelas laboratorium, aluminium foil, blender National, lemari pengering, oven
listrik, neraca kasar O’Haus, neraca digital Vibra, seperangkat alat destilasi penetapan kadar air, desikator, stopwatch, kaca objek, kaca penutup, cawan
porselin, lemari pengering, krus tang dan pisau, rotary evaporator Heidolph VV-300, freeze dryer Edwards, mikroskop Boeco, BM-180, Halogen
Lamp, tanur Gallenkamp, kamera digital, spektofotometer UVVis Shimadzu UV-1800.
3.2 Bahan-Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian adalah rumput laut coklat Sargassum polycystum C.A. Agardh dan air suling. Bahan-bahan kimia yang
lainnya adalah berkualitas pro analisis adalah sebagai berikut: β-karoten,
Universitas Sumatera Utara
Tween 40, asam linoleat, butil hidrokswitoluena BHT, kuersetin, produksi E- Merck: etanol, toluen, raksa II klorida, kalium iodida, bismuth III nitrat,
asam nitrat pekat, besi III klorida, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, timbal II asetat, kloralhidrat, kloroform, isopropanol, benzen, asam asetat
anhidrida, natrium hidroksida, amil alkohol. Bahan kimia berkualitas teknis: etanol 96, n-heksan dan etilasetat.
3.3 Pengumpulan Bahan Tumbuhan
Pengambilan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan daerah lain. Bahan penelitian adalah talus
rumput laut coklat yang diperoleh dari Desa Pal 7, Kecamatan Sosorgadong Kabupaten Tapanuli Tengah, Provinsi Sumatera Utara dan dikumpulkan pada
bulan Desember 2012. Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah sama dengan sampel yang digunakan pada penelitian Roni Aritonang.
3.3.1 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Pusat penelitian Oseanografi LIPI, Jakarta. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman
46. Gambar rumput laut coklat dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 47.
3.3.2 Pembuatan simplisia rumput laut coklat
Rumput laut coklat Sargassum polycystum C.A. Agardh yang telah dikumpulkan, dibersihkan, dicuci, ditiriskan kemudian ditimbang sebagai berat
basah. Bahan ini kemudian dikeringkan di lemari pengering hingga kering, yaitu jika simplisia tersebut diremas akan hancur, kemudian ditimbang sebagai
Universitas Sumatera Utara
berat kering. Bahan kemudian diserbuk dengan menggunakan blender. Diperoleh berat basah sebesar 15 kg dan berat kering sebesar 1,9 kg.
3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi besi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air suling sampai 100 ml Depkes, 1995.
3.4.2 Pereaksi asam klorida 2 N
Sebanyak 17 ml asam klorida pekat diencerkan dengan air suling sampai 100 ml Depkes, 1995.
3.4.3 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Timbal II asetat sebanyak 15,17 g dilarutkan dalam air suling bebas CO2 hingga 100 ml Depkes, 1995.
3.4.4 Pereaksi Mayer
Sebanyak 1,4 g raksa II klorida, kemudian dilarutkan dalam air suling hingga 60 ml. Pada wadah lain ditimbang sebanyak 5 g kalium iodida lalu
dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kedua larutan dicampurkan dan ditambahkan air suling hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes, 1995.
3.4.5 Pereaksi Mollish
Sebanya k 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga 100
ml Depkes, 1995.
3.4.6 Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 0,8 g bismut nitrat dilarutkan dalam asam nitrat pekat 20 ml kemudian dicampurkan dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 g dalam
Universitas Sumatera Utara
50 ml air suling. Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih diambil dan diencerkan dengan air suling secukupnya hingga 100 ml
Depkes, 1995.
3.4.7 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes, 1995.
3.4.8 Pereaksi asam sulfat 2 N
Sebanyak 5,5 ml asam sulfat pekat diencerkan dengan air suling hingga diperoleh 100 ml Depkes, 1995.
3.4.9 Pereaksi natrium hidroksida 2 N
Sebanyak 8 g kristal natrium hidroksida dilarutkan dengan air suling sebanyak 100 ml Depkes, 1995.
3.4.10 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling secukupnya kemudian ditambahkan 2 g iodida sedikit demi sedikit cukupkan dengan air
suling Depkes, 1995.
3.4.11 Pereaksi Liebermann-Burchard
Campur secara perlahan 5 ml asam asetat anhidrit dengan 5 ml asam sulfat pekat tambahkan etanol hingga 50 ml Harborne, 1984.
3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air,
Universitas Sumatera Utara
penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam WHO, 1998.
3.5.1 Identifikasi makroskopik simplisia
Identifikasi makroskopik simplisia dilakukan dengan mengamati bentuk luar dari simplisia rumput laut coklat Sargassum polycystum C.A. Agardh.
3.5.2 Identifikasi mikroskopik simplisia
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia rumput laut coklat. Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah ditetesi
dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop.
3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung
penyambung dan tabung penerima.
a. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 ml toluena dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi
selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml.
b. Penetapan kadar air simplisia
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu yang berisi toluen jenuh tersebut, lalu dipanaskan
hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2
Universitas Sumatera Utara
tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air
terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin
pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan
kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen vb WHO, 1998.
3.5.4 Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml dalam labu
bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam
air dihitung Depkes, 1995.
3.5.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam
pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan
Universitas Sumatera Utara
pada suhu 105ºC sampai bobot tetap. Hitung persen kadar sari yang larut dalam etanol 96 Depkes, 1995.
3.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu
600ºC
selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Hitung persen kadar abu
Depkes, 1995.
3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Hitung persen kadar yang tidak larut
dalam asam Depkes, 1995.
3.6 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia dilakukan menurut Depkes 1979 dan Farnsworth 1966 untuk mengetahui golongan senyawa alkaloida, flavonoid, glikosida,
glikosida antrakinon, saponin, tanin, dan steroidatriterpenoida.
3.6.1 Pemeriksaan alkaloida
Ekstrak diitimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit,
didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji alkaloida:
Universitas Sumatera Utara
diambil tabung reaksi, lalu kedalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi
1. ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer 2. ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat
3. ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhkan pada paling sedikit dua
hari tiga percobaan diatas Depkes, 1995.
3.6.2 Pemeriksaan flavonoida
Sebanyak 10 g ekstrak ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan
0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terjadi warna merah
atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
3.6.3 Pemeriksaan glikosida
Ekstrak ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 95 dengan air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2
jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit lalu
disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, dilakukan berulang sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan dan diuapkan
pada temperatur tidak lebih dari 50ºC. Sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan percobaan
dimasukan dalam tabung reaksi dan diuapkan diatas penangas air. Pada sisa
Universitas Sumatera Utara
ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Mollish. Kemudian secara perlahan- lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung,
terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan glikosida Depkes, 1995.
3.6.4 Pemeriksaan glikosida antrakinon
Ekstrak ditimbang sebanyak 0,2 g, kemudian ditambahkan 5 ml asam sulfat 2 N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzena,
dikocok dan didiamkan. Lapisan benzena dipisahkan dan disaring, kocok lapisan benzena dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah dan
lapisan benzena tidak berwarna menunjukan adanya antrakinon
Depkes, 1995. 3.6.5 Pemeriksaan saponin
Ekstrak ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, dinginkan kemudian dikocok kuat-
kuat selama 10 detik. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida
2N menunjukan adanya saponin Depkes, 1995.
3.6.6 Pemeriksaan tanin
Ekstrak ditimbang sebanyak 1 g, dididihkan selama 3 menit dalam 100 ml air suling lalu didinginkan dan disaring. Pada filtrat ditambahkan 1-2 tetes
peraksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukan adanya tanin Depkes, 1995.
Universitas Sumatera Utara
3.6.7 Pemeriksaan steroidatriterpenoida
Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan 20 ml n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan
beberapa tetes pereaksi Liebermann-Burchard. Timbulnya warna biru atau biru hijau menunjukan adanya steroida, sedangkan warna merah, merah muda atau
ungu menunjukkan adanya triterpenoida Harborne, 1984.
3.7 Pembuatan Ekstrak Rumput Laut Coklat
Pembuatan ekstrak rumput laut coklat dilakukan secara perkolasi bertahap. Prosedur pembuatan ekstrak: sebanyak 500 g serbuk simplisia dibasahi dengan n-
heksan dan dibiarkan selama 3 jam. Kemudian dimasukkan ke dalam alat perkolator, lalu dituang cairan penyari n-heksan sampai semua simplisia terendam
dan terdapat selapis cairan penyari diatasnya, mulut tabung perkolator ditutup dengan alumunium foil dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan
dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan perkolat diatur 1 mlmenit, perkolat ditampung.
Perkolasi dihentikan jika 500 mg perkolat yang keluar terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa.
Perkolat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan alat rotary evaporator setelah itu di freeze dryer hingga
diperoleh ekstrak kental. Ampas dikeringkan lalu diekstraksi dengan menggunakan pelarut berturut-turut etilasetat dan etanol dengan prosedur yang
sama dengan di atas.
Universitas Sumatera Utara
3.8 Pengujian Kemampuan Antioksidan dengan Spektrofotometer Visibel 3.8.1 Metode
Kategori