menusuk vena tersebut dengan jarum suntik, kemudian darah yang keluar dihisap dengan spoit 3 ml, sampai didapat darah sebanyak satu sampai dua ml. Spoit
tersebut kemudian ditutup kembali dan diberi tanda sesuai jenis vaksin yang digunakan.
Setelah didapat cukup darah, spoit ditarik sampai ma ksimal, dan diletakkan dengan posisi miring. Hal ini bertujuan untuk memperbesar luas
permukaan darah, sehingga serum akan lebih mudah keluar. Selanjutnya serum ini disimpan dalam refrigerator pada suhu 4
o
C selama 24 jam, kemudian serum dipisahka n dengan mengambil cairan bening yang telah memisah. Serum ini
kemudian dimasukkan ke dalam microtube dan diberi tanda sesuai dengan jenis
vaksin yang digunakan. Apabila serum yang didapat warnanya masih merah, maka harus disentrifugasi sampai didapat serum yang benar-benar jernih dan tidak
lagi berwarna merah. Serum yang diperoleh dari pengambilan darah pertama dua minggu
setelah vaksinasi ke dua selanjutnya disebut serum I, serum dari pengambilan darah ke dua satu minggu setelah vaksinasi ke tiga disebut serum II, dan serum
dari pengambilan darah terakhir satu minggu setelah vaksinasi dengan antigen tanpa adjuvan disebut serum III.
3.4.4 Pengujian Serum
Serum yang telah didapat harus segera diuji, apabila digunakan pada lain waktu, harus disimpan dalam
freezer. Uji yang dilakukan terhadap serum ini adalah untuk mengukur titer antibodi terhadap antigen virus AI H5N1, yaitu
dengan uji hemaglutinasi inhibisi HI. Dan untuk menguji tingkat kehomologan antibodi dalam serum tersebut terhadap antigen AI H5N1, yaitu dengan uji agar
gel presipitasi AGP.
A. Prosedur Uji Hemaglutinasi inhibisi HI
Uji HI yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan metode beta dan mikrotitrasi, dengan urutan sebagai berikut :
1. Sebanyak 25 µl NaCl fisiologis 0,85 dimasukkan kedalam lubang- lubang
microplate yang terdiri dari 96 lubang dengan menggunakan mikropipet.
2. Pada jajaran lubang pertama ditambahkan 25 µl serum-serum yang akan diuji dan serum positif sebagai kontrol positif kemudian dilakukan
pengenceran serial kelipatan dua dari lubang pertama hingga lubang ke sebelas, sedangkan lubang ke dua belas dipergunakan sebagai kontrol sel
darah merah. 3. Sebanyak 25 µl antigen virus AI sebesar 4 HAU ditambahkan pada setiap
lubang, kecuali lubang ke dua belas ditambah dengan 25 µl NaCl fisiologis dan selanjutnya dicampur dengan cara menggoyang-goyangkan secara
perlahan selama 30 detik kemudian didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang.
4. Sebanyak 25 µl suspensi sel darah merah SDM ayam 0,5 ditambahkan ke dalam setiap lubang, kemudian dicampur kembali dan didiamkan
selama 30 menit pada suhu ruang. Interpretasi hasil titer HI ditunjukkan pada pengenceran serum tertinggi yang
masih memberikan hambatan inhibisi pada antigen 4 HAU. Inhibisi ditetapkan dengan melakukan pengamatan sel darah merah SDM pada
lubang-lubang cawan mikro, bila cawan mikro dimiringkan terlihat SDM membentuk tetesan air mata serupa dengan SDM kontrol.
Rataan titer antibodi hasil uji HI dihitung dengan menggunakan Geometric Mean Titer GMT, dengan rumus :
Log
2
GMT = Log
2
t
1
S
1
+ Log
2
t
2
S
2
+ ... + Log
2
t
n
S
n
N Keterangan :
N = Jumlah contoh serum yang diamati
t = Titer antibodi pada pengenceran tertinggi yang masih
dapat menghambat aglutinasi sel darah merah S
= Jumlah contoh serum yang bertiter t n
= Sampel ke-n
B. Prosedur Uji Agar Gel Presipitasi AGP
Prosedur uji Agar Gel Presipitasi adalah sebagai berikut : 1. Pertama-tama disiapkan bahan-bahan agar sebagai berikut : agarose 0,4 g,
polietilen glikol 6000 1,2 g, Na azide 0,01 g, 25 ml akuades, dan 25 ml PBS.
2. Semua bahan-bahan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang tahan panas lalu dipanaskan dengan mikrowave pada suhu 100
o
C sampai mendidih dan semua bahan tersebut benar-benar homogen, yang
ditandai dengan warnanya yang jernih sempurna. 3. Kemudian disiapkan gelas obyek secukupnya, dan dengan menggunakan
pipet mohr, bahan agar yang telah dipanaskan masih dalam keadaan panas dihisap sebanyak 4 ml, lalu dituang secara hati-hati di atas gelas
obyek. Langkah ini diulangi denga n gelas obyek baru, sampai semua bahan agar habis, kemudian ditunggu sampai bahan agar pada obyek gelas
tersebut memadat. 4. Setelah agar memadat, selanjutnya dibuat lubang-lubang pada agar
tersebut dengan menggunakan cetakan puncher yang terdiri dari tujuh
lubang berbentuk heksagonal, dalam satu gelas obyek dapat dibuat dua heksagonal.
5. Selanjutnya disiapkan serum yang akan diuji dan suspensi antigen virus AI H5N1.
6. Suspensi antigen dimasukkan ke dalam lubang di bagian tengah heksagonal sebanyak 25 µl, dan serum yang akan diuji dimasukkan ke
dalam lubang-lubang pada sudut heksagonal sebanyak 25 µl. 7. Masing-masing gelas obyek ditandai, dicatat, dan digambar untuk
keperluan identifikasi. 8. Agar tersebut kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada tempat yang
lembab dan suhu ruang. Sebagai inkubator dapat digunakan kotak plastik bertutup, dimana didalamnya diletakkan tisu yang telah dibasahi dengan
akuades, dan sterofoam sebagai alas agar diletakkan d atas tisu tersebut.
9. Setelah 24-48 jam hasil uji AGPT dapat dibaca, hasil positif ditunjukkan dengan adanya garis putih garis presipitasi yang terbentuk diantara
lubang yang berisi antigen dan antibodi serum, dan hasil positif menunjukkan bahwa antigen dan antibodi dalam serum yang diuji tersebut
homolog.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
