pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
Namun, pada penelitian ini tidak dilakukan pembuatan media bakteri di Laboratorium karena media yang diperlukan dibeli dalam keadaan sudah jadi.
3.7.4 Pembiakan Spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
.Fusobacterium nucleatum yang digunakan adalah specimen stem cell Fusobacterium nucleatum
ATCC 25586 yang telah dibiakkan secara murni pada media NA yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob.
Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai
diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mc Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10
8
CFUml.
3.7.5 Pembuatan Kontrol Positif
Kontrol 0,5Mc Farland diperoleh dengan pencampuran 0,05 mlBarium Klorida Dihidrat BaCl
2
•2H
2
O 1,175 dengan 9,95 ml Asam Sulfat H
2
SO
4
1. Kontrol ini menghasilkan suspensi bakteri dengan jumlah sekitar 1x10
8
CFUml. Penggunaan kontrol 0,5Mc Farland berdasarkan standar kekeruhan yang sesuai
dalam penelitian bakteri.
42
Jumlah kontrol yang digunakan yaitu 0,3 ml.
Gambar 14. Kontrol Positif 0,5Mc Farland
Universitas Sumatera Utara
3.7.6 Pembuatan Kontrol Negatif
Kontrol negatif yang digunakan adalah media Nutrient Agar tanpa suspensi bakteri. Media ini diambil sebanyak 0,3 ml dengan menggunakan mikropipet dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
3.7.7 Penentuan KHM Bahan Coba
Bahan coba ekstrak Jahe Merah yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, dan 6,25. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil
sebanyak 0,1ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya diambil suspensi bakteri dan media masing-masing 0,1
ml yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label
kemudian divorteks. Lalu tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO
2
dan diamati kekeruhan yang terjadi secaravisual dan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai
KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal
ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Fusobacterium nucleatum
dalam media perbenihan setelah diikubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut.
Gambar 15. Penentuan KHMmenggunakan metode dilusi
Gambar 16.Tabung dilusi di dalam inkubator
Universitas Sumatera Utara
3.7.8 Penentuan KBM Bahan Coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah
koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, dan 6,25dengan metode swab. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing-masing
divorteks dan diambil 0,05 ml untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat Nutrient Agar, diratakan ke seluruh permukaan agar, direplikasi sebanyak 5
petri, didiamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37 C selama 24 jam dan media padat akan tumbuh
menjadi beberapa koloni bakteri. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan nilai KBM secara visual.Perhitungannya adalah bila bentuk koloni
melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni.
Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi.Jumlah koloni yang terhitung langsung dalam satuan CFUml.
Gambar 17. Proses perhitungan bakteri dengan metode swab
Universitas Sumatera Utara
3.8 Skema Alur Penelitian
