3.4.3 Variabel Terkendali
− Asal Jahe Merah Kutacane, Aceh Tenggara
− Konsentrasi etanol yang digunakan 96
− Cara ekstraksi
− Suspensi Fusobacterium nucleatum ATCC 25586
− Media pertumbuhan Nutrient Agar NA
− Suhu yang digunakan untuk menumbuhkan Fusobacterium nucleatum
37
o
C −
Cara pengeringan −
Waktu pengeringan −
Waktu pengamatan bakteri −
Lingkungan tempat Jahe Merah ditanam
3.4.4 Variabel Tak Terkendali
− Keseragaman kondisi Jahe Merah
− Pola pemeliharaan Jahe Merah
− Lama penyimpanan Jahe Merah
− Lama pengiriman dan suhu saat pengiriman Jahe Merah ke laboratorium
− Lingkungan tempat Jahe Merah ditanam
3.5 Definisi Operasional
No. Variabel
Definisi Operasional Cara Ukur
Skala Ukur
Alat Ukur
1 Ekstrak
Jahe Merah
dengan konsentrasi
100 Ekstrak yang
didapatkan setelah melakukan penguapan
dengan Vacuum Rotary Evaporator
Sesuai SOP dari
Laboratorium Biologi Oral
UNAIR Nominal
Timbangan analitik, Gelas
Ukur, Pipet Tetes
2 Ekstrak
Jahe Merah
dengan konsentrasi
50 Ekstrak yang
didapatkan dengan melarutkan 1 gram
dari ekstrak Jahe Merah konsentrasi
100 ke dalam 1 ml DMSO
Universitas Sumatera Utara
No. Variabel
Definisi Operasional Cara Ukur
Skala Ukur
Alat Ukur
3 Ekstrak
Jahe Merah
dengan konsentrasi
25 Ekstrak yang
didapatkan dengan melarutkan ½ dari
ekstrak Jahe Merah konsentrasi 50 ke
dalam 1 ml DMSO Sesuai SOP
dari Laboratorium
Biologi Oral UNAIR
Nominal Timbangan
analitik, Gelas Ukur,
Pipet Tetes 4
Ekstrak Jahe
Merah dengan
konsentrasi 12,5
Ekstrak yang didapatkan dengan
melarutkan ½ dari ekstrak Jahe Merah
konsentrasi 25 ke dalam 1 ml DMSO
5 Ekstrak
Jahe Merah
dengan konsentrasi
6,25 Ekstrak yang
didapatkan dengan melarutkan ½ dari
ekstrak Jahe Merah konsentrasi 12,5 ke
dalam 1 ml DMSO 6
KHM Kadar
Hambat Minimal
Konsentrasi minimal bahan coba yang
mampu menghambat pertumbuhan bakteri
setelah diinkubasi selama 24 jam
Dalam satuan CFUml
Colony Forming
Unit Suspensi
Rasio Visual
7 KBM
Kadar Bunuh
Minimal Konsentrasi minimal
bahan coba yang dapat membunuh bakteri
setelah dilakukan uji dilusi selama 24 jam,
dengan cara menghitung jumlah
koloni bakteri pada media padat dengan
menggunakan metode swab.
Visual
3.6 Bahan dan Alat Penelitian 3.6.1 Bahan Penelitian
− Jahe Merah sebanyak 1500 gram Kutacane, Aceh
− Pelarut etanol 96 sebanyak 5 liter Kimia Farma, Indonesia
− Suspensi Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 UNAIR, Indonesia
− Media Nutrient Agar UNAIR
− NaCl 0,9 1 liter Kimia Farma, Indonesia
− DMSO 100 ml
Universitas Sumatera Utara
3.6.2 Alat Penelitian
− Lemari pengering
− Kertas perkamen
− Aluminium foil 1 gulungan
− Spreader
− Blender Panasonic, Japan
− Perkolator
− Kapas Bio Panca, Indonesia
− Kertas saring Whatman no.42, England
− Vaccum Rotary Evaporator Heidolph VV 2000, Germany
− Erlenmeyer Pyrex, USA
− Lemari penyimpan petri
− Piring petri Pyrex, Japan
− Inkubator CO
2
Sanyo, Japan −
Autoklaf Tomy, Japan −
Electronic Balance Ohyo JP2 6000, Japan −
Vortexwhirli mixer Iwaki model TM 100, Japan −
Pipet mikro dan tipsGilson, France −
Ose dan spiritus
3.7 Proses Pengambilan dan Pengolahan Data 3.7.1 Proses Pembuatan EkstrakJahe Merah
Buah yang dipakai adalah buah yang segar. Bahan baku Jahe Merah sebanyak 1500 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, ditimbang, dan dikupas kulitnya.
Selanjutnya Jahe Merah dikeringkan di lemari pengering selama 5 hari. Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk
simplisia. Kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 96. Diaduk sesekali dengan kondisi etanol tersebut cukup
untuk merendam sampel. Setelah 3 jam, simplisia diperkolasi dengan menggunakan
Universitas Sumatera Utara
perkulator yang ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Bagian ujung alat perkulator disumbat
dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring. Setelah 24 jam, bagian ujung perkulator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat
dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetes menit. Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga dalam kondisi terendam dalam etanol selama dilakukan penampungan
perkolat.Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih.Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan
Vacuum Rotary Evaporator pada tekanan
1 ATM dengan termperatur ≤ 40˚C. Hasil
akhir yang didapat adalah ekstrak kental Jahe Merah.
Gambar 4.Jahe Merah yang telah
dicuci bersih
Gambar 5. Jahe Merah yang telah dikupas
Gambar 6. Jahe Merah yang telah diiris tipis
Gambar 7. Jahe Merah ditimbang sebelum dikeringkan
Universitas Sumatera Utara
Gambar 8. Jahe Merah yang telah dikeringkan di lemari pengering
selama 5 hari
Gambar 9. Jahe Merah yang telah selesai dikeringkan lalu dihaluskan,
dan setelah itu ditimbang
Gambar 10. Jahe Merah yang sedang diperkolasi
Gambar 11. Cairan hasil perkolasi diuapkan menggunakan Vacuum
Rotary Evaporator sampai ekstrak
menjadi kental
Gambar 12.Estrak kental Jahe Merah dimasukkan
ke dalam wadah tertutup dan dalam lemari
Universitas Sumatera Utara
3.7.2 Pengenceran Bahan Coba
Ekstrak Jahe Merah ditimbang dengan timbangan analitik dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan
media DMSO. Disediakan 4 buah tabung, karena konsentrasi 100 tidak perlu diencerkan.Masing-masing tabung diisi 1 g DMSO Dimethyl Sulfoxide sebagai
pelarut.Adapun keunggulan dari pelarut ini adalah jernih seperti air, menambah kelarutan dan tidak memiliki sifat antibakteri. Pada tabung pertama diambil 1 g
ekstrak kental Jahe Merah 100 kemudian divorteks sehingga diperoleh ekstrak Jahe Merah dengan konsentrasi 50. Kemudian pada tabung kedua, pengenceran
dilakukan dengan cara mengambil 1 g
dari ekstrak Jahe Merah konsentrasi 50 menggunakan pipet tetesdan divorteks untuk mendapatkan ekstrak Jahe Merah 25
pengenceran ganda. Demikian seterusnya sampai tabung sehingga dihasilkan konsentrasi 12,5, dan 6,25. Tabung-tabung tersebut kemudian diberi label sesuai
konsentrasinya.
Gambar 13. Pengenceran ekstrak kental Jahe Merah
3.7.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media NA, sebanyak 12 gram bubuk yang dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest untuk 40 petri 20 mlpetri, lalu
dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak, disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan
udara 2 ATM, suhu 121°C. Setelah disterilkan, media disimpan di dalam lemari
Universitas Sumatera Utara
pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
Namun, pada penelitian ini tidak dilakukan pembuatan media bakteri di Laboratorium karena media yang diperlukan dibeli dalam keadaan sudah jadi.
3.7.4 Pembiakan Spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
.Fusobacterium nucleatum yang digunakan adalah specimen stem cell Fusobacterium nucleatum
ATCC 25586 yang telah dibiakkan secara murni pada media NA yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob.
Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai
diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mc Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10
8
CFUml.
3.7.5 Pembuatan Kontrol Positif
Kontrol 0,5Mc Farland diperoleh dengan pencampuran 0,05 mlBarium Klorida Dihidrat BaCl
2
•2H
2
O 1,175 dengan 9,95 ml Asam Sulfat H
2
SO
4
1. Kontrol ini menghasilkan suspensi bakteri dengan jumlah sekitar 1x10
8
CFUml. Penggunaan kontrol 0,5Mc Farland berdasarkan standar kekeruhan yang sesuai
dalam penelitian bakteri.
42
Jumlah kontrol yang digunakan yaitu 0,3 ml.
Gambar 14. Kontrol Positif 0,5Mc Farland
Universitas Sumatera Utara
3.7.6 Pembuatan Kontrol Negatif
Kontrol negatif yang digunakan adalah media Nutrient Agar tanpa suspensi bakteri. Media ini diambil sebanyak 0,3 ml dengan menggunakan mikropipet dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
3.7.7 Penentuan KHM Bahan Coba
Bahan coba ekstrak Jahe Merah yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, dan 6,25. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil
sebanyak 0,1ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya diambil suspensi bakteri dan media masing-masing 0,1
ml yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label
kemudian divorteks. Lalu tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO
2
dan diamati kekeruhan yang terjadi secaravisual dan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai
KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal
ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Fusobacterium nucleatum
dalam media perbenihan setelah diikubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut.
Gambar 15. Penentuan KHMmenggunakan metode dilusi
Gambar 16.Tabung dilusi di dalam inkubator
Universitas Sumatera Utara
3.7.8 Penentuan KBM Bahan Coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah
koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, dan 6,25dengan metode swab. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing-masing
divorteks dan diambil 0,05 ml untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat Nutrient Agar, diratakan ke seluruh permukaan agar, direplikasi sebanyak 5
petri, didiamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37 C selama 24 jam dan media padat akan tumbuh
menjadi beberapa koloni bakteri. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan nilai KBM secara visual.Perhitungannya adalah bila bentuk koloni
melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni.
Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi.Jumlah koloni yang terhitung langsung dalam satuan CFUml.
Gambar 17. Proses perhitungan bakteri dengan metode swab
Universitas Sumatera Utara
3.8 Skema Alur Penelitian
3.9 Analisis Data
Analisis data dilakukan dengan membandingkan efektivitas antar konsentrasi ekstrak terhadap bakteri Fusobacterium nucleatum dengan uji KHM dan KBM.
Analisis Data Penentuan KBM Bahan Coba
Penentuan KHM Bahan Coba Pembiakan Spesimen
Pembuatan Media Bakteri Pengenceran Bahan Coba
Pembuatan Ekstrak Jahe Merah
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL PENELITIAN
4.1 Ekstrak Kental Jahe Merah
Jahe Merah yang digunakan diidentifikasi terlebih dahulu di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI.Hasil identifikasi menunjukkan bahwa Jahe Merah
yang digunakan pada penelitian ini adalah dari jenis Zingiber officinale Roscoe dengan suku Zingiberaceae Lampiran 2.Ekstrak kental Jahe Merah diperoleh dari
ekstrak cair rimpang Jahe Merah. Ekstrak cair ini diuapkan dengan vacuum rotavapor pada suhu 46
o
C selama 1 jam hingga diperoleh ekstrak kental dengan konsistensi hampir seperti madu. Ekstrak kental tersebut ditimbang dengan timbangan analitik
dan diperoleh hasil ekstrak kental Jahe Merah berwarna coklat kekuningan sebanyak 30 gram.Kemudian ekstrak kental Jahe Merah dimasukkan ke dalam botol kaca
tertutup dan disimpan di tempat yang sejuk.
4.2 Uji Efektivitas Antibakteri
Pada pengujian efek antibakteri ekstrak etanol Jahe Merah terhadap F. nucleatum
, nilai KHM dan KBM ditentukan dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada media pertumbuhan bakteri yang dilakukan secara visual oleh minimal 3
pengamat untuk menghindari kesalahan perhitungan. Nilai KHM diperoleh dari konsentrasi minimal ekstrak Jahe Merah yang
mampu menghambat pertumbuhan bakteri yang tampak secara visual. Sedangkan nilai KBM diperoleh dari konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh
99,9 bakteri. Pada penelitian ini, penentuan nilai KHM dengan menggunakan metode dilusi
cair tidak dapat dilakukan karena kelima konsentrasi ekstrak kental Jahe Merah memiliki kekeruhan dan warna yang samadengan kontrol positif. Sehingga pada
tabung percobaan, tidak satu tabung pun yang terlihat jernih walaupun ekstrak Jahe
Universitas Sumatera Utara
Kategori