BAB 4 METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian :
Posttest Only Control Group Design
Jenis Penelitian :
Eksperimental Laboratorium
4.2 Populasi, sampel dan besar sampel 4.2.1 Populasi
: Bakteri Porphyromonas gingivalis
4.2.2 Sampel :
Koloni Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 yang telah diisolasi dan dibiakkan dengan media Mueller Hinton Agar MHA.
4.2.3 Besar sampel
Penentuan besar sampel sesuai dengan SOP Standard Operational Prosedure yang ada di Laboratorium Pusat Penyakit Tropis, Universitas Airlangga,
yaitu dengan menggunakan rumus Federer 1995:
t = jumlah perlakuan yang diberikan r = besar sampel
6-1 r-1 ≥ 15
5 r-1 ≥ 15
r-1 ≥ 3
r ≥ 4
t-1 r-1 ≥ 15
Universitas Sumatera Utara
Adapun penentuan besar sampel dilakukan sebagai berikut: a.
Penentuan nilai Kadar Hambat Minimum KHM Bahan coba dibagi ke dalam 6 kelompok dengan 2 kontrol, yaitu:
• Kelompok 1 : ekstrak etanol pegagan 100 → 4 sampel • Kelompok 2 : ekstrak etanol pegagan 50 → 4 sampel
• Kelompok 3 : ekstrak etanol pegagan 25 → 4 sampel • Kelompok 4 : ekstrak etanol pegagan 12,5 → 4 sampel
• Kelompok 5 : ekstrak etanol pegagan 6,25 → 4 sampel • Kelompok 6 : ekstrak etanol pegagan 3,125 → 4 sampel
• Kelompok 7 : kontrol Mc Farland → 1 sampel • Kelompok 8 : kontrol negatif ekstrak pegagan tanpa diberi suspensi
Porphyromonas gingivalis → 1 sampel
Dari masing-masing konsentrasi dilakukan dilusi pengenceran untuk memastikan konsentrasi minimal yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Pada
penentuan nilai KHM, jumlah keseluruhan sampel adalah 26 sampel. b. Penentuan nilai Kadar Bunuh Minimum KBM
Kelompok yang dilanjutkan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan metode Drop Plate Miles Misra, adalah:
• Kelompok 1 : ekstrak etanol pegagan 100 → 4 sampel • Kelompok 2 : ekstrak etanol pegagan 50 → 4 sampel
• Kelompok 3 : ekstrak etanol pegagan 25 → 4 sampel
Universitas Sumatera Utara
• Kelompok 4 : ekstrak etanol pegagan 12,5 → 4 sampel • Kelompok 5 : ekstrak etanol pegagan 6,25 → 4 sampel
• Kelompok 6 : ekstrak etanol pegagan 3,125 → 4 sampel • Kelompok 7 : kontrol Mc Farland → 1 sampel
• Kelompok 8 : kontrol negatif ekstrak pegagan tanpa diberi suspensi Porphyromonas gingivalis
→ 1 sampel Pada penentuan nilai KBM, jumlah keseluruhan sampel adalah 26 sampel.
Universitas Sumatera Utara
4.3 Variabel Penelitian Variabel tergantung
Pertumbuhan bakteri Porphyromonas
gingivalis pada media MHA dengan penentuan
nilai KHM
dan KBM
Variabel bebas
Ekstrak etanol pegagan 100, 50, 25, 12,5,
6,25 dan 3,125
Variabel terkendali
a. Jenis dan asal tumbuhan pegagan Centella
asiatica L Urban, Desa Durian, Kec. Pantai Labu Deli Serdang
b. Berat pegagan sebelum pengeringan 3 kg
c. Lama penyimpanan pegagan sampai proses
ekstraksi 1 minggu d.
Waktu dan suhu pengeringan pegagan 3 hari dan 40
C e.
Berat pegagan setelah pengeringan 390 gram
f. Konsentrasi etanol yang digunakan etanol
96 g.
Jumlah etanol yang digunakan 12 L h.
Waktu maserasi dilakukan 24 jam i.
Suhu pada saat maserasi 25 C
j. Nomor kertas saring yang digunakan
Whatman No.42 k.
Jumlah kertas saring saat perkolasi 3 lapis l.
Kecepatan tetes cairan dalam perkolator 20 tetesmenit
m. Suhu penguapan dengan rotavapor 46
C n.
Waktu penguapan rotavapor 20 jam o.
Media pertumbuhan bakteri yaitu MHA dan MHB
p. Sterilisasi alat, bahan coba dan media
q. Porphyromonas gingivalis ATCC 33277
r. Jumlah bahan coba yang diteteskan ke MHA
dan MHB MHA=50 µ l, MHB=1 ml s.
Suhu inkubasi 37 C
t. Teknik pembiakan Porphyromonas
gingivalis u.
Waktu pembiakan Porphyromonas gingivalis 24 jam
v. Waktu pengamatan 24 jam
w.
Keterampilan operator
Variabel tidak terkendali
a. Lingkungan kondisi tanah dan
iklim tempat tumbuh pegagan b.
Perlakuan terhadap pegagan selama tumbuh
c. Suhu penyimpanan pegagan
sebelum dilakukan ekstraksi d.
Waktu dan suhu saat pengiriman dari bahan coba
sampai ke LaboratoriumPusat
Universitas Sumatera Utara
4.3.1 Variabel bebas
Ekstrak etanol pegagan 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125.
4.3.2 Variabel tergantung : pertumbuhan bakteri Porphyromonas gingivalis
pada media MHA dengan pengukuran nilai KHM dan KBM.
4.3.3 Variabel terkendali
a. Jenis dan geografis asal pegagan Centella asiatica L Urban, Desa
Durian, Kec. Pantai Labu, Deli Serdang b.
Berat pegagan sebelum pengeringan 3 kg c.
Lama penyimpanan pegagan sampai proses ekstraksi 1 minggu d.
Waktu dan suhu pengeringan pegagan 3 hari dan 40 C
e. Berat pegagan setelah pengeringan 390 gram
f. Konsentrasi etanol yang digunakan etanol 96
g. Jumlah etanol yang digunakan 12 L
h. Waktu maserasi dilakukan 24 jam
i. Suhu pada saat maserasi 25
C j.
Nomor kertas saring yang digunakan Whatman No. 42 k.
Jumlah kertas saring saat perkolasi 3 lapis l.
Kecepatan tetes cairan dalam perkolator 20 tetesmenit m.
Suhu penguapan dengan rotavapor 46 C
n. Waktu penguapan rotavapor 20 jam
o. Media pertumbuhan bakteri yaitu MHA dan MHB
p. Sterilisasi alat, bahan coba dan media
Universitas Sumatera Utara
q. Porphyromonas gingivalis ATCC 33277
r. Jumlah bahan coba yang diteteskan ke MHA dan MHB MHA=50 µl,
MHB=1 ml s.
Suhu inkubasi 37 C
t. Teknik pembiakan Porphyromonas gingivalis
u. Waktu pembiakan Porphyromonas gingivalis 24 jam
v. Waktu pengamatan 24 jam
w. Keterampilan operator
4.3.4 Variabel tidak terkendali
a. Lingkungan kondisi tanah dan iklim tempat tumbuh Pegagan
b. Perlakuan terhadap Pegagan selama tumbuh
c. Suhu penyimpanan pegagan sebelum dilakukan ekstraksi.
d. Waktu dan suhu saat pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium
Penyakit Tropis Surabaya
Universitas Sumatera Utara
4.4 Definisi Operasional
NO VARIABEL
DEFINISI OPERASIONAL
CARA UKUR SKALA
UKUR ALAT
UKUR
Variabel Bebas
1 Ekstrak etanol
pegagan 100 Ekstrak yang didapat
dengan melarutkan 1gr ekstrak kental pegagan
dalam 1 ml MHB Sesuai SOP di
Laboratorium Pusat Penyakit
Tropis UNAIR Rasio
Electronic balance
dan mikropipet
2 Ekstrak etanol
pegagan 50 Ekstrak yang didapat
dengan mengambil setengah dari konsentrasi ekstrak
etanol pegagan 100 Sesuai SOP di
Laboratorium Pusat Penyakit
Tropis UNAIR Rasio
Mikropipet
3 Ekstrak etanol
pegagan 25 Ekstrak yang didapat
dengan mengambil setengah dari konsentrasi ekstrak
etanol pegagan 50 Sesuai SOP di
Laboratorium Pusat Penyakit
Tropis UNAIR Rasio
Mikropipet
4 Ekstrak etanol
pegagan 12,5
Ekstrak yang didapat dengan mengambil setengah
dari konsentrasi ekstrak etanol pegagan 25
Sesuai SOP di Laboratorium
Pusat Penyakit Tropis UNAIR
Rasio Mikropipet
5 Ekstrak etanol
pegagan 6,25
Ekstrak yang didapat dengan mengambil setengah
dari konsentrasi ekstrak etanol pegagan 12,5
Sesuai SOP di Laboratorium
Pusat Penyakit Tropis UNAIR
Rasio Mikropipet
6 Ekstrak etanol
pegagan 3,125
Ekstrak yang didapat dengan mengambil setengah
dari konsentrasi ekstrak etanol pegagan 6,25
Sesuai SOP di Laboratorium
Pusat Penyakit Tropis UNAIR
Rasio Mikropipet
NO VARIABEL
DEFINISI OPERASIONAL HASIL
UKUR SKALA
UKUR ALAT
UKUR
Variabel Tergantung
1 KHM Kadar
Hambat Minimum
konsentrasi minimal bahan coba yang mampu
menghambat pertumbuhan bakteri 50 setelah
diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri pada
media perbenihan. Dalam satuan
CFUml Colony
forming unitmilliliter
Rasio Spektrofoto
meter
2 KBM Kadar
Bunuh Minimum
konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh
bakteri 99,9-100 setelah dilakukan uji dilusi selama
24jam Dalam satuan
CFUml Colony
forming unitmilliliter
Rasio Kaca
Pembesar
Universitas Sumatera Utara
4.5 Bahan dan Alat Penelitian 4.5.1 Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang dipakai adalah : 1.
Pegagan 3 kg Desa Durian, Kec. Pantai Labu, Deli Serdang, Indonesia 2.
Media Mueller Hinton Difco, USA
3. Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 Laboratorium Pusat Penyakit
Tropis Surabaya, Indonesia 4.
Etanol 96 Kimia Farma, Indonesia 12 liter 5.
NaCl 0,9 Kimia Farma, Indonesia 1 liter
6. Aquadest Kimia Farma, Indonesia 1 liter
4.5.2 Alat Penelitian
1. Timbangan Home Line, China
2. Kertas perkamen 3 kajang
3. Perkolator
4. Kapas 250 gram Bio Panca, Indonesia
5. Alumunium foil 1 gulungan Total Wrap, Indonesia
6. Blender Panasonic, Japan
7. Kertas saring Whatman no.42, England
8. Autoklaf Tomy, Japan
9. Vaccum rotavapor Antriebs ATB, England
10. Electronic balance Ohyo JP2 6000, Japan dan Denver Instrument
Company, USA
Universitas Sumatera Utara
11. Erlenmeyer Pyrex, USA
12. Vortexwhirli mixer Iwaki model TM-100, Japan
13. Inkubator CO
2
Sanyo, Japan 14.
Pipet mikro Gilson, France 15.
Piring petri Pyrex, Japan
4.6. Tempat dan Waktu Penelitian 4.6.1 Tempat Penelitian
1. Laboratorium Farmasi USU
2. Laboratorium Lembaga Pusat Penyakit Tropis UNAIR
4.6.2 Waktu penelitian
Waktu penelitian adalah 7 bulan
4.7 Prosedur Penelitian 4.7.1 Ekstraksi Pegagan
Pegagan dicuci bersih dengan air mengalir lalu diambil seluruh bagian yang berada di atas tanah kecuali akar dan stolonnya, kemudian ditimbang seberat 3 kg lalu
dikeringkan pada lemari pengering Gambar 4 selama 3 hari dengan suhu 40 C
sampai dapat diremas rapuh Gambar 5. Pegagan yang telah kering kemudian ditimbang kembali dan didapatkan berat 390 gram Gambar 6, kemudian dihaluskan
dengan blender Gambar 7, diayak sehingga didapat serbuk Gambar 8 lalu diletakkan di dalam wadah.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 6. Penimbangan pegagan
Gambar 7. Pegagan kering dihaluskan
Gambar 4. Pengeringan pegagan dalam lemari pengering
Gambar 5. Pegagan yang sudah kering
Gambar 8. Pegagan yang telah dihaluskan
Universitas Sumatera Utara
Kemudian ditambahkan etanol destilasi sebanyak 1,5 liter untuk perendaman lalu disimpan dalam wadah tertutup dan didiamkan selama satu jam Gambar 9 pada
suhu 25 C. Massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator dengan hati-
hati sambil sesekali ditekan dengan menggunakan sendok, kemudian tuangkan etanol destilasi sebanyak 300 ml dan disaring dengan 3 lapis kertas saring. Biarkan sampai
cairan mulai menetes, perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam Gambar 10. Cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan ± 20 tetesmenit, etanol destilasi
ditambahkan berulang-ulang secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari diatas simplisia. Ekstrak cair diuapkan dengan alat vacuum rotavapor Gambar 11
pada suhu 46 C hingga diperoleh ekstrak kental dengan konsistensi seperti madu.
Ekstrak Pegagan dimasukkan ke dalam botol kaca lalu disimpan di tempat yang sejuk.
Gambar 9. Proses perendaman pegagan
Gambar 10. Simplisia dalam perkolator
Universitas Sumatera Utara
4.7.2 Pembuatan Suspensi Bahan Uji
Ekstrak pegagan dalam pelarut etanol ditimbang menggunakan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara
dilarutkan dengan media Mueller Hinton Broth MHB. Sediakan 6 buah tabung, pada masing–masing tabung berisi 1 ml MHB. Pada tabung pertama diberi 1 gr
ekstrak kental pegagan kemudian dicampur menggunakan vorteks sehingga didapatkan ekstrak etanol pegagan dengan konsentrasi 100. Kemudian dilakukan
pengenceran dengan cara mengambil setengah dari konsentrasi ekstrak etanol pegagan 100 menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung kedua untuk
mendapatkan ekstrak etanol pegagan 50 pengenceran berganda. Cara yang sama dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi 25, 12,5, 6,25 dan 3,125. Tabung-
tabung tersebut kemudian diberi label sesuai konsentrasinya.
Gambar 11. Proses penguapan dengan rotavapor
Universitas Sumatera Utara
4.7.3 Pembuatan media bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media MHA. Sebanyak 12 gram MHA dilarutkan dalam 240 ml akuades untuk 40 petri 20 mlpetri, lalu
dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Setelah masak, media disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121
C, lalu simpan dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan, media dipanaskan kembali
hingga mendidih lalu dituang ke dalam petri.
4.7.4 Pembiakan spesimen
Porphyromonas gingivalis yang digunakan adalah spesimen stem sel Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 yang dibiakkan secara murni pada media
MHA dalam suasana anaerob hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur Gambar 12. Ambil beberapa koloni bakteri lalu
diencerkan dengan larutan NaCl 0,9 hingga konsentrasi 10
8
CFUml CFU: Colony Forming Unit atau setara dengan 0,5 Mc Farland Standard.
Gambar 12. Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 yang telah dibiakkan secara murni pada
media MHAdalam suasana anaerob
Universitas Sumatera Utara
4.7.5 Penentuan KHM bahan coba
Konsentrasi ekstrak etanol pegagan yang diuji dalam penelitian ini adalah 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125. Dari masing-masing konsentrasi
tersebut diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung
bahan coba tersebut kemudian dicampur dengan vorteks, lalu diinkubasi pada suhu 37
C selama 24 jam pada inkubator CO
2
. Kemudian amati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan
nilai KHM. Nilai KHM didapatkan dengan melihat tabung mana dengan konsentrasi minimal yang berubah menjadi jernih setelah diinkubasi 24 jam yang mampu
menghambat pertumbuhan Porphyromonas gingivalis dalam media perbenihan dan tidak tumbuh koloni bakteri dalam media tersebut.
4.7.6 Penentuan KBM bahan coba
Dari hasil prosedur penentuan nilai KHM dilanjutkan dengan penghitungan jumlah koloni menggunakan metode Drop Plate Miles Misra pada ekstrak etanol
pegagan 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125. Setelah diinkubasi pada prosedur penentuan KHM, bahan coba dengan konsentrasi seperti di atas dicampur
dengan vorteks dan diambil 50 µ l untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat Mueller Hinton Agar, direplikasi 4 petri, diamkan selama 15-20 menit
sampai kering kemudian diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37 C selama
24 jam. Kemudian dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan nilai KBM dengan bantuan kaca pembesar. Jumlah koloni bakteri dihitung dengan
Universitas Sumatera Utara
prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri. Apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni,
bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Koloni Porphyromonas gingivalis pada media padat berbentuk bulat dan berwarna putih
keruh Gambar 13.
Gambar 13. Koloni bakteri Porphyromonas gingivalis pada media padat
Setelah dihitung jumlah koloni bakteri maka dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang
dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x1, selain itu karena pada penetesan
suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 µ l, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai
satuan standar CFUml. Contoh cara perhitungan koloni pada metode Drop Plate Miles Misra :
a Pada media padat ditetesi sebanyak 50 µl suspensi bahan coba dengan
menggunakan mikropipet.
Universitas Sumatera Utara
b Kemudian dihitung jumlah koloni yang ada dengan menggunakan kaca
pembesar dan didapatlah sebanyak 5 koloni. c
Jadi jumlah bakteri pada bahan coba tersebut adalah : 5x 1 faktor pengenceran x 20 faktor pengali = 100 CFU ml
4.8 Analisis Data
Data dari setiap pemeriksaan dianalisis dengan memakai uji statistik sebagai berikut:
1. Uji analisis varians satu arah ANOVA, untuk melihat efek antimikroba
ekstrak Centella asiatica terhadap pertumbuhan Porphyromonas gingivalis.
2. Uji Least Significant Difference LSD, untuk melihat perbedaan efek
antimikroba antar kelompok perlakuan.
Universitas Sumatera Utara
BAB 5 HASIL PENELITIAN
5.1 Ekstrak Etanol Pegagan Ekstrak kental pegagan diperoleh dari tanaman pegagan yang dikeringkan
dan dihaluskan 390 gram kemudian diuapkan dengan vaccum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental yang berwarna hijau kehitaman sebanyak 98 gram
Gambar 14 dan disimpan di dalam botol kaca tertutup yang diletakkan dalam lemari pendingin.
Gambar 14. Ekstrak etanol pegagan
5.2 Uji Efektifitas Antibakteri
Pada penentuan KHM, yang dilihat ialah tabung yang mulai berubah menjadi jernih dengan cara membandingkan tabung yang diberi perlakuan dengan kontrol.
Gambar 15a terlihat media MHB yang berwarna kuning transparan sebelum diberi perlakuan. Gambar 15b menunjukkan tabung yang telah disuspensikan bahan coba
Universitas Sumatera Utara
Kategori