Sedangkan nilai SDF dalam persen berat sampel kering dihitung dengan menggunakan rumus berikut :
SDF= D
2
– I
2
– B
2
x 100 W
Keterangan: W : Berat sampel gram
D : Berat setelah analisis dan dikeringkan gram I : Berat setelah diabukan gram
B : Berat blanko bebas serat gram
Kadar Ca, Fe, dan Zn Metode AAS Apriyantono et al. 1989
Sampel ditimbang sebesar 5-10 gram dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kemudian sampel ditambahkan 10 ml H
2
SO
4
dan 10 ml HNO
3
, dibiarkan 1 malam 16 jam. Larutan dipanaskan perlahan-lahan sampai menjadi
tidak berwarna gelap. Kemudian ditambahkan 10 ml aquades larutan akan menjadi tidak berwarna atau menjadi kuning muda jika mengandung Fe dan
dipanaskan sampai berasap. Larutan didinginkan dan diencerkan sampai volume tertentu 100 ml. Kemudian larutan disaring dengan kertas saring Whatman 42
dan dibaca dengan AAS pada panjang gelombang 213,9 nm. Perhitungan kadar Ca, Fe, dan Zn adalah sebagai berikut:
Bioavailabilitas Ca, P, Fe, dan Zn secara in vitro metode dialisis Roig et al. 1998
Persiapan sampel, alat, dan bahan
1. Bahan
Biskuit dihancurkan lalu ditimbang setara 2 gram protein. Selanjutnya ditambahkan air bebas ion hingga volumenya mencapi 75 ml kemudian blender
sampai halus. Sampel tersebut disiapkan duplo.
2. Peralatan gelas
Semua peralatan gelas vial, gelas piala, erlenmeyer, labu takar, tabung reaksi dicuci, direndam dalam larutan HNO
3
10 vv selama 24 jam, dan dibilas dengan air bebas ion sebelum digunakan.
3. Kantong dialisis
Kadar mg100g = ppm baca x ml aliquot 1000 ml x 1000 g sampel
Kantong dialisis MWCO 6000-8000, lebar flat 50 mm, diameter 32 mm, volume atau panjang 8 mlcm dipotong sepanjang 15 cm dan direndam dalam
air bebas ion, sekurang-kurangnya 1 jam.
4. Vial
Vial tabung dialisis Fisher 3-335-10D disiapkan lengkap dengan penutupnya. Lubang kecil dibuat pada tutup untuk mengeluarkan gas.
5. Suspensi pepsin
1,6 pepsin didispersikan ke dalam 0,1 M HCl dan ditepatkan volumenya menjadi 10 ml. Suspensi ini dibuat sewaktu akan digunakan.
6. Pankreatin bile
Sebanyak 1 g pankreatin Sigma p-170 dan 6,25 g ekstrak bile Sigma B- 8631 dilarutkan dalam 25 ml NaHCO3 0,1 N.
7. KOH standar misal larutan KOH 2 N
Sebanyak 112,2 g KOH ditimbang dan dilarutkan menjadi 1000 ml dengan aquades. Larutan disimpan di udara terbuka selama 2 hari lalu
dikalibrasi. Kalibrasi: Asam oksalat ditimbang ± 0,01 g lalu ditambah aquades dan 3
tetes indikator PP. Larutan diaduk sampai larut. Kemudian dititrasi dengan larutan KOH 0,2 N sampai berwarna merah jambu.
8. NaHCO
3
NaHCO
3
setara x gr KOH ditimbang dan diencerkan sampai 100 ml dengan aquades bebas ion.
Prinsip analisis
Fe, Zn, Ca, dan P pada sampel dihidrolisis dari ikatannya dengan protein menggunakan enzim-enzim pencernaan yang terdapat di lambung dan usus
halus. Mineral bebas yang terdapat dalam larutan sampel akan berdifusi melalui membran semipermeabel ke dalam kantung dialisis yang berisi buffer NaHCO
3
. Mineral dalam dialisat menunjukkan jumlah mineral yang diserap tubuh.
Prosedur
N KOH = mg asam oksalat ml titrasi x 63,037
Kebutuhan NaHCO
3
= N KOH x 56,1 x ml titrasi x T1 x 100 1000 T2 20
= x gr KOH
Sejumlah sampel dihaluskan dengan blender. Sampel setara 2 g protein ditimbang dalam gelas piala yang diketahui beratnya. Selanjutnya ditambah
aquades bebas ion sampai 100 g, apabila terlalu kental dapat ditambah air sampai didapat kekentalan yang bisa diaduk. pH diatur menjadi 2.0 dengan HCl
4 N. gelas piala bersama sampel ditimbang A: T1 ± 20 g untuk analisis bioavailability serta T2 ± 20 g untuk menghitung total asam tertitrasi. Sampel
pada T1 dan T2 ditambah suspensi pepsin 1 ml lalu diinkubasi 37ºC selama 2 jam. Setelah itu sampel dimasukkan ke freezer.
Sampel T2 total asam tertitrasi di-thawing dalam shaker water bath dengan suhu 37º C. Sampel ditambah 5 ml pankreatin bile lalu ditambah
indikator PP. Setelah itu dititrasi dengan KOH standar sampai berwarna merah jambu. Kantung dialisis sepanjang ± 15 cm dipotong lalu direndam dalam air
bebas ion kemudian diikat salah satu ujungnya. Setelah itu diisi dengan 20 ml larutan NaHCO
3
hasil perhitungan. Salah satu ujung kantung dialisis kemudian diikat, usahakan tidak ada gelembung. Kemudian direndam dengan sisa larutan
NaHCO
3
dalam gelas piala 200 ml. Sampel T1 sampel bio di-thawing dalam shaker water bath dengan suhu
37º C. Kantung dialisis dimasukkan dalam T1 lalu diinkubasi pada suhu 37º C selama 30 menit. Setelah itu ditambah ± 5 ml pankreatin bile dan diinkubasi
kembali pada suhu 37º C selama 2 jam. Kantung dialisis diangkat. Ikatan kantung dialisis dibuka, isinya dituangkan dalam gelas piala atau erlenmeyer 100
ml bebas ion yang sudah diketahui beratnya. Bagian dalam kantung dicuci dengan air bebas ion. Kemudian dialisat ditimbang dan dicatat. Dialisat ditambah
10 ml H
2
SO
4
pekat dan 10 ml HNO
3
pekat. Dialisat didiamkan selama semalam. Setelah itu ditambah H
2
O bebas ion dan dipanaskan sampai jernih. Kemudian dialisat diencerkan dalam labu 50 ml.
Perhitungan
Total mineral dalam dialisat = ppm sampel – blanko x aliquot x fp x total dialisat 1000 gr dial analisis
ana Total mineral dalam sampel bio mg100 g = gr sampel bio x total Ca, Fe, Zn x 100
gr sampel setara 2 g protein + air A bioavailability = total mineral dalam dialisat mg x 100
total mineral dalam sampel bio mg
Uji Antioksidan dengan DPPH a. Ekstraksi dengan pelarut Aseton Awika et al. 2003
Sampel sebanyak 10 gram ditempatkan dalam botol sentrifuse, selanjutnya ditambahkan 100 ml aseton 70 . Sampel di shaker dengan
kecepatan 350 rpm selama 2 jam pada suhu kamar, kemudian disimpan pada suhu -20
o
C ditempat gelap selama 24 jam. Setelah 24 jam larutan di equilibrium selama 1 jam pada suhu ruang. Larutan selanjutnya di sentrifuse selama 30
menit pada kecepatan 3000 rpm. Residu sampel selanjutnya dicuci sebanyak 4 kali dengan menambahkan aseton 70 , selanjutnya di shaker selama 1 jam dan
disentrifuse kembali selama 30 menit pada 3000 rpm. Lima supernatan yang diperoleh ditampung pada Erlenmeyer, disaring dengan kertas saring whatman
no. 41 dengan bantuan pompa vakum
,
kemudian dikeringkan dengan rotary evaporator pada suhu 40
o
C untuk menguapkan aseton. Larutan sisa pengeringan dengan rotary evaporator selanjutnya dikeringkan kembali dengan
menggunakan freeze dryer pada suhu -75
o
C. Ekstrak kering hasil freeze dryer yang didapat selanjutnya dibuat sebagai larutan stok uji konsentrasi 200 mgml
pelarut.
b. Uji Anti Radikal Bebas DPPH Kubo et al. 2002
