dan protein standar siap diinjeksikan ke dalam sumur-sumur elektroforesis. Pengisian larutan sampel dan protein standar ke dalam sumur pada gel akrilamida masing- masing
sebanyak 5 μl dengan menggunakan syringe.
c. Elektroforesis
Gel yang telah ditempatkan pada modul elektroforesis diatur sehingga permukaan gel terendam dalam bufer elektroda. Elektroforesis dilakukan dengan
mengalirkan arus listrik mula-mula 15 mA untuk tiap gel. Voltase maksimum 120 volt dan daya maksimum 30 Watt. Setelah pergerakan sampel mencapai separating gel,
aliran arus listrik ditingkatkan 20 mA tiap gel, sedangkan voltase dan daya konstan. Proses pemisahan dihentikan setelah 1 jam, atau setelah marker warna biru berada
sekitar 0.5 cm dari batas separating gel. Gel hasil elektroforesis dilepas dari cetakan dengan menggunakan spatula, dan gel siap untuk pewarnaan protein atau analis
zimografi β-glukosidase.
d. Pewarnaan Protein
Sebelum dilakukan pewarnaan, gel terlebih dahulu direndam dalam larutan TCA 12.5 selama 24 jam dalam lemari pendingin atau direndam dalam larutan
fixative 50 vv methanol dalam air selama 1 jam. Gel kemudian dikeluarkan dari larutan fixative dan dicuci dengan air, selanjutnya direndam dalam larutan pewarna
Coomassie blue R-250 selama 4 jam. Larutan pewarna dibuat dengan melarutkan Coomassie nlue R-250 dalam metanol : asam asetat : air = 4 : 1 : 4. Kelebihan warna
dihilangkan dengan larutan destaining 10 vv metanol, 7.5 vv asam asetat dalam air dengan 2 - 3 kali penggantian sampai diperoleh pita-pita protein berwarna biru
dengan latar belakang jernih, kemudian dibilas dengan air. Bobot molekul sampel ditentukan dengan menghitung nilai Rf dari pita-pita yang nampak, kemudian diplotkan
pada kurva standar log BM terhadap Rf protein standar. Jarak pergerakan pita dari tempat awal cm
Jarak pergerakan pewarna dari tempat awal cm
Rf =
e. Analisis Zimografi
Pita protein yang mempunyai aktivitas β-glukosidase diidentifikasi dengan
menggunakan metode Parry et al. 2001. Setelah elektroforesis selesai, gel dilepas dari cetakan dan jarak migrasi bromofenol biru diukur dari batas atas gel pemisah. Gel
untuk analisis zimografi terlebih dahulu dicuci dengan 50 mM bufer natrium asetat pH 4.0 yang mengandung 25 isopropanol selama 15 menit dan 2 kali dalam bufer yang
sama tetapi tanpa mengandung isopropanol, masing-masing selama 30 menit. Gel kemudian diinkubasi dalam 0.5 mM MUG yang dilarutkan dalam 50 mM bufer natrium
asetat pH 4.0 yang telah diencerkan 10 kali pada suhu 40 - 42 ºC selama 15 menit. Adanya aktivitas
β-glukosidase dapat diketahui dengan melihat metilumbelliferon yang akan berpendar di bawah sinar UV.
Identifikasi Isolat Kapang
Identifikasi isolat kapang dilakukan oleh IPB Culture Collection di Laboratorium Mikologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam IPB Bogor melalui pengamatan makroskopis dan mikroskopis Lampiran 10. Media yang digunakan untuk identifikasi adalah Malt Ekstrak Agar MEA
Lampiran 4.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penapisan Kapang Secara Semi Kuantitatif
Dari proses isolasi kapang yang ditumbuhkan pada medium agar Mandels Lampiran 4 yang mengandung 0.5 Sigmasel-20 didapat 22 jenis isolat kapang
Tabel 4. Ke 22 jenis isolat kapang tersebut kemudian diuji kemampuannya untuk membentuk daerah hitam dalam medium Dubos yang mengandung 0.1 eskulin dan
0.05 Fe-NH
4
Dari hasil pengamatan yang dilakukan pada hari ke 4, isolat-isolat kapang ini membentuk kisaran nisbah diameter daerah hitam terhadap diameter koloni antara 1.2
dan 2.9. Nisbah tertinggi dihasilkan oleh isolat TA 2A dan terendah oleh isolat RM 3D. Kemampuan isolat kapang membentuk daerah hitam disekitar koloni menunjukkan
bahwa kapang tersebut menghasilkan enzim β-glukosidase yang mampu memutuskan
ikatan β-1,4-glikosida pada struktur selulosa. Untuk diameter daerah hitam terbesar dihasilkan oleh isolat RM 3D, yaitu 3.15, dan terkecil oleh isolat TA 4A, yaitu 1.2.
Berdasarkan hasil pengujian nisbah diameter daerah hitam terhadap diameter koloni dan diameter daerah hitam yang diperoleh, dipilih dua isolat dengan nisbah diameter
daerah hitam terhadap diameter koloni yang tertinggi, yaitu TA 2A dan TA 3B, dan dua isolat dengan diameter daerah hitam yang terbesar; yaitu RM 2 dan RM 3D. Meskipun
nilai nisbah diameter daerah hitam terhadap diameter koloni tinggi, namun belum tentu aktivitas enzimnya tinggi, begitu juga sebaliknya Ardiningsih 2002. Ke 4 isolat hasil
seleksi ini kemudian diuji secara kuantitatif aktivitas enzim β-glukosidasenya. Selain ke
4 isolat hasil isolasi dari kayu yang menjadi sarang rayap tersebut, juga diamati 3 isolat kapang koleksi unggulan Balitnak, yaitu BS4, S11 dan SS240. Isolat BS4
Eupenicillium javanicum merupakan hasil isolasi Haryati 1997, S11 Penicillium nalgiovense Laxa merupakan hasil isolasi Nurbayti 2002 dari sarang rayap,
sedangkan SS240 merupakan isolat mutan Penicillium nalgiovense S11 yang dihasilkan Sanjaya 2003. Beberapa isolat hasil penapisan disajikan pada Gambar 6.
-sitrat pada suhu ruang dan kondisi aerob. Isolat-isolat kapang yang mempunyai aktivitas enzim
β-glukosidase akan memotong eskulin menjadi eskuletin yang bila bereaksi dengan ion feri akan membentuk kompleks besi fenolat, yang
ditandai dengan terbentuknya daerah hitam disekitar koloni.
Tabel 4. Hasil penapisan isolat kapang Isolat
Warna koloni Diameter cm
Rasio Daerah hitam
Koloni TA 2A
TA 3B TA 5C
LG 3C RM 6C
RM 5B LG 3A
TA 4B RM 1C
RM 1A LG 3B
TA 4A RM 5C
TA 3A HJ A
LG 1C TA 2B
TA 1B TA 2A”
RM 2 RM 2A
RM 3D Hijau
Hijau Putih
Coklat kekuningan Abu-abu
Putih Hijau keabuan
Hijau keabuan Putih
Hijau Coklat tua
Putih kekuningan Putih
Hijau keabuan Putih
Merah jambu Putih
Hijau keabuan Putih kekuningan
Coklat Coklat kekuningan
Hitam 2.00
2.03 1.84
2.30 1.83
2.33 1.80
1.33 2.20
2.00 1.80
1.20 1.30
2.10 1.90
2.60 2.50
2.07 2.70
3.14 2.93
3.15 0.70
