spora disuspensikan dalam 5 ml larutan NaCl 0.85. Sebanyak 2 ml inokulum diinokulasikan pada 50 ml media Mandels yang mengandung 3 polard NaOH sebagai
sumber karbon, 0.3 ekstrak khamir, dan 0.075 bacto pepton. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 °C dalam inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm selama 6 hari.
Masa inkubasi dihentikan dengan menambahkan 0.2 NaN
3
. Filtrat enzim dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 7000 rpm dengan suhu 4 °C selama 20 menit.
Untuk mengetahui aktivitas enzim, dilakukan pengujian pada hari ke 5, 6 dan 7.
Penentuan Aktivitas Enzim a. Penentuan Aktivitas Total Selulase Filter Paper-ase
Aktivitas Filter Paper-ase FPase ditentukan berdasarkan metode Mandels et al. 1976. Sebanyak 0.4 ml filtrat enzim ditambah larutan bufer asetat pH 5.5 sampai
volumenya 1.5 ml. Selanjutnya ditambahkan kertas saring Whatman No.1 1 x 6 cm
2
Aktivitas FPase Uml = x fp 2 x ml enzim yang dipipet
fp = faktor pengenceran
b. Penentuan Aktivit as β-glukosidase
, divorteks dan diinkubasi pada suhu 50 °C selama 60 menit. Reaksi dihentikan dengan
penambahan 3 ml pereaksi DNS Lampiran 4 Miller 1959, campuran kemudian divorteks dan dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit, setelah pemanasan
selesai campuran ditambah 5 ml akuades. Filtrat enzim dengan perlakuan yang sama tanpa inkubasi digunakan sebagai kontrol. Absorbansi diukur pada panjang gelombang
540 nm. Blanko terdiri dari 1.5 larutan buffer asetat, 3 ml larutan DNS dan 5 ml akuades.
Kadar glukosa yang dihasilkan dihitung berdasarkan kurva standar dengan konsentrasi glukosa 0.0 - 0.6 mg dari larutan induk 3 mgml. Produksi 2 mgml glukosa
pada kondisi percobaan setara dengan 0.185 unit FPaseml Mandels et al. 1976. 0.185 x mg glukosa sampel - mg glukosa kontrol
Aktivitas β-glukosidase ditentukan dengan mengukur pelepasan p-nitrofenol dari p-NPG Lin et al. 1999. Filtrat enzim, larutan bufer asetat pH 5.0 dan substrat
p-NPG 0.3 bv diprainkubasi selama 10 menit pada suhu 50 °C. Sampel terdiri dari 0.5 ml filtrat enzim, 0.5 ml larutan bufer asetat pH 5.0, dan 0.5 ml p-NPG 0.3
dimasukkan dalam tabung reaksi. Kontrol terdiri dari 0.5 ml larutan buffer dan 0.5 ml p-NPG. Sampel dan kontrol divorteks dan diinkubasi pada suhu 50 °C selama 60 menit.
Selanjutnya ditambah 1 ml Na
2
CO
3
1 M. Untuk kontrol penambahan 0.5 ml filtrat enzim dilakukan setelah penambahan Na
2
CO
3
. Sebagai blanko digunakan 1 ml akuades, 0.5 ml larutan buffer asetat pH 5.0 dan 1 ml Na
2
CO
3
. Absorban diukur pada panjang gelombang 400 nm. Kadar p-nitrofenol yang dihasilkan ditentukan berdasarkan
kurva standar dengan konsentrasi nitrofenol 0 - 24 µgml dari larutan induk 30 µgml.
Bila filtrat enzim terlalu pekat, dilakukan pengenceran hingga mencapai kadar nitrofenol standar. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
dibutuhkan untuk mengkatalisis pembentukan satu mikromol 10
-6
Aktivitas Uml = x fp ß-glukosidase Waktu inkubasi menit x BM nitrofenol 139
µgµmol
c. Penentuan Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik
