p-NPG 0.3 bv diprainkubasi selama 10 menit pada suhu 50 °C. Sampel terdiri dari 0.5 ml filtrat enzim, 0.5 ml larutan bufer asetat pH 5.0, dan 0.5 ml p-NPG 0.3
dimasukkan dalam tabung reaksi. Kontrol terdiri dari 0.5 ml larutan buffer dan 0.5 ml p-NPG. Sampel dan kontrol divorteks dan diinkubasi pada suhu 50 °C selama 60 menit.
Selanjutnya ditambah 1 ml Na
2
CO
3
1 M. Untuk kontrol penambahan 0.5 ml filtrat enzim dilakukan setelah penambahan Na
2
CO
3
. Sebagai blanko digunakan 1 ml akuades, 0.5 ml larutan buffer asetat pH 5.0 dan 1 ml Na
2
CO
3
. Absorban diukur pada panjang gelombang 400 nm. Kadar p-nitrofenol yang dihasilkan ditentukan berdasarkan
kurva standar dengan konsentrasi nitrofenol 0 - 24 µgml dari larutan induk 30 µgml.
Bila filtrat enzim terlalu pekat, dilakukan pengenceran hingga mencapai kadar nitrofenol standar. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
dibutuhkan untuk mengkatalisis pembentukan satu mikromol 10
-6
Aktivitas Uml = x fp ß-glukosidase Waktu inkubasi menit x BM nitrofenol 139
µgµmol
c. Penentuan Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik
Penentuan kadar protein dilakukan berdasarkan metode Bradford 1976. Sebanyak 0.2 ml filtrat enzim ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford analisis
semimakro kemudian divortek. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 595 nm setelah 2 menit dan sebelum 1 jam. Blanko menggunakan 0.2 ml akuades yang
direaksikan dengan 5 ml pereaksi Bradford. Kadar protein ditentukan dari kurva standar larutan BSA pada kisaran 0.1 sampai 1.0 mg proteinml. Perhitungan aktivitas spesifik
enzim
β-glukosidase dapat ditentukan dengan:
1000 µgmg
mol p-nitrofenol per-menit pada kondisi yang ditentukan.
[nitrofenol]sampel µgml - [nitrofenol]kontrol µgml
Aktivitas Spesifik Umg = x Aktivitas enzim Uml
ß-glukosidase Konsentrasi protein µgml
Kara kterisasi Enzim β-glukosidase
a. Penentuan pH dan Suhu Optimum Enzim
Penentuan pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim pada kisaran pH 4.2, 4.6, 5.0, 5.4, 5.8 dan 6.2. Sedangkan penentuan suhu optimum dilakukan
dengan menguji aktivitas enzim pada variasi suhu 40, 50, 55, 60, 65, dan 70 ºC. b. Penentuan pH dan Suhu Stabilitas enzim
Penentuan pH stabilitas dilakukan dengan menginkubasi enzim dalam bufer asetat pH 4.2, 4.6, 5.0, 5.4, 5.8, dan 6.2 pada suhu optimum selama 30 menit. Setelah
inkubasi berakhir, aktivitas enzim ditentukan pada kondisi pH optimum dan suhu
optimum.
Penentuan suhu stabilitas dilakukan dengan menginkubasi enzim dalam bufer optimum pada variasi suhu 28, 40 dan 80 ºC. Pengambilan filtrat enzim untuk setiap
suhu masing-masing dilakukan setiap hari selama 4 hari, setiap 30 menit selama 180 menit dan setiap 30 detik selama 270 detik. Aktivitas enzim ditentukan pada kondisi pH
optimum dan suhu optimum. c. Pengendapan Protein dengan Aseton
Pengendapan protein dengan aseton dilakukan pada kisaran 60 sampai 90. Aseton dingin ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan stirer dan suhu
campuran dijaga stabil antara -5 dan 0 ºC, lalu campuran dibiarkan selama 30 menit. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifus pada kecepatan 7000 rpm suhu
4 ºC, 15 menit. Larutan didekantasi dan endapannya dilarutkan kembali ke volume semula dengan bufer asetat pH optimum. Kemudian ditentukan perolehan kembali
kadar protein dan aktivitas β-glukosidase.
d. Pengaruh EDTA dan Ion logam terhadap Aktivitas Enzim
