Kara kterisasi Enzim β-glukosidase
a. Penentuan pH dan Suhu Optimum Enzim
Penentuan pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim pada kisaran pH 4.2, 4.6, 5.0, 5.4, 5.8 dan 6.2. Sedangkan penentuan suhu optimum dilakukan
dengan menguji aktivitas enzim pada variasi suhu 40, 50, 55, 60, 65, dan 70 ºC. b. Penentuan pH dan Suhu Stabilitas enzim
Penentuan pH stabilitas dilakukan dengan menginkubasi enzim dalam bufer asetat pH 4.2, 4.6, 5.0, 5.4, 5.8, dan 6.2 pada suhu optimum selama 30 menit. Setelah
inkubasi berakhir, aktivitas enzim ditentukan pada kondisi pH optimum dan suhu
optimum.
Penentuan suhu stabilitas dilakukan dengan menginkubasi enzim dalam bufer optimum pada variasi suhu 28, 40 dan 80 ºC. Pengambilan filtrat enzim untuk setiap
suhu masing-masing dilakukan setiap hari selama 4 hari, setiap 30 menit selama 180 menit dan setiap 30 detik selama 270 detik. Aktivitas enzim ditentukan pada kondisi pH
optimum dan suhu optimum. c. Pengendapan Protein dengan Aseton
Pengendapan protein dengan aseton dilakukan pada kisaran 60 sampai 90. Aseton dingin ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan stirer dan suhu
campuran dijaga stabil antara -5 dan 0 ºC, lalu campuran dibiarkan selama 30 menit. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifus pada kecepatan 7000 rpm suhu
4 ºC, 15 menit. Larutan didekantasi dan endapannya dilarutkan kembali ke volume semula dengan bufer asetat pH optimum. Kemudian ditentukan perolehan kembali
kadar protein dan aktivitas β-glukosidase.
d. Pengaruh EDTA dan Ion logam terhadap Aktivitas Enzim
Pengaruh EDTA dan ion logam ditentukan dengan menambahkan masing- masing EDTA, MgCl
2
, ZnCl
2
, CuCl
2
, MnCl
2
, FeCl
3
, CoCl
2
, CaCl
2
, dan BaCl
2
dengan konsentrasi akhir 1 dan 5 mM dalam campuran reaksi. Komposisi campuran reaksi
terdiri dari enzim, substrat p-NPG 0.3, dan bufer asetat, selanjutnya diinkubasi selama 1 jam pada kondisi suhu dan pH optimum.
Penentuan Bobot Molekul Enzim dengan Teknik Zimogram
Bobot molekul enzim ditentukan dengan menggunakan SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrilamida Gel Electrophoresis Laemmi 1970. Protein standar
HMW yang digunakan terdiri dari Myosin BM = 212.000, α-2-makroglobulin BM = 170.000, β-galaktosidase BM = 116.000, Transferrin BM = 76.000, Glutamat
dehidrogenase BM = 53.000.
a. Pembuatan Gel Poliakrilamida SDS-PAGE
K omposisi untuk separating gel 8 dibuat dengan cara mencampurkan 5.3 ml
larutan akrilamida 30 T, 9.39 ml akuades, 5 ml bufer Tris-HCl 1 M pH 8.8, 0.2 ml SDS 10 bv, 10
μl TEMED, dan 200 μl amonium persulfat 10 bv. Larutan diaduk hingga homogen dan siap diisikan pada plate gel, gel akan terbentuk setelah
30 - 60 menit. Stacking gel 5 dibuat dengan komposisi yang terdiri dari 2.5 ml larutan
akrilamida 30 T, 8.5 ml akuades, 3.75 ml bufer Tris-HCl 1 M pH 6.8, 0.12 ml SDS 10 bv, 8
μl TEMED, dan 75 μl amonium persulfat 10 bv. Larutan diaduk hingga homogen dan siap diisikan pada plate gel.
b. Preparasi Sampel Protein
Sebanyak 720 μl sampel dimasukkan dalam vial 2 ml dan ditambahkan 30 μl
bromfenolblue 0.05 bv, dan 250 μl bufer sampel [larutan sampel + BPB : bufer sampel = 3:1 ]. Bufer sampel merupakan campuran 10 ml β-merkaptoetanol, 20 ml
bufer stacking gel, 20 ml gliserol, dan 4 g SDS. Preparasi protein standar dilakukan dengan melarutkan 175 ml
μg HMW marker dalam 1000 μl akuades, dan ditambahkan Bufer sampel. Untuk mengetahui batas
pergerakan protein ditambahkan pewarna bromfenolblue dengan perbandingan sama dengan larutan sampel. Larutan selanjutnya dipanaskan dalam penangas 100 ºC selama
4 - 5 menit, kecuali untuk analisis zimogram sampel tidak dipanaskan. Larutan sampel
dan protein standar siap diinjeksikan ke dalam sumur-sumur elektroforesis. Pengisian larutan sampel dan protein standar ke dalam sumur pada gel akrilamida masing- masing
sebanyak 5 μl dengan menggunakan syringe.
c. Elektroforesis
Kategori