Isolasi Dan Penapisan Kapang Penghasil Β-Glukosidase Dan Karakterisasi Enzim Yang Dihasilkan

ISOLASI DAN PENAPISAN KAPANG PENGHASIL

β

-GLUKOSIDASE DAN KARAKTERISASI

ENZIM YANG DIHASILKAN

OLEH :

TRIRAKHMA SOFIHIDAYATI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

RINGKASAN

TRIRAKHMA SOFIHIDAYATI. Isolasi dan Penapisan Kapang Penghasil

β-Glukosidase dan Karakterisasi Enzim yang Dihasilkan. Dibimbing oleh: I MADE ARTIKA dan TRESNAWATI S. PURWADARIA.

Tumbuh-tumbuhan menghasilkan karbohidrat dalam bentuk pati dan lignoselulosa. Selulosa tidak bisa dimanfaatkan sebagai sumber energi oleh ternak unggas karena hewan tersebut tidak memiliki mikroorganisme rumen yang mampu mencerna selulosa. Beberapa cara pengolahan limbah dilakukan dengan menggunakan bantuan mikrob yang dapat menghasilkan enzim selulolitik. Selain kapang, enzim selulase juga dihasilkan oleh siput dan rayap. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi kapang yang dapat menghasilkan enzim β-glukosidase, memproduksi dan

mengkarakterisasi enzim. Sebanyak 22 isolat yang menunjukkan aktivitas β-glukosidase dengan menghasilkan daerah hitam pada medium yang mengandung

eskulin, berhasil diisolasi. Kapang yang menghasilkan aktivitas β-glukosidase tertinggi (RM 3D) diidentifikasi sebagai Aspergillus foetidus (Naka.) Thom dan Raper.

Produksi enzim β-glukosidase dari Aspergillus foetidus (Naka.) (RM 3D) pada medium yang mengandung 3% polard pada suhu ruang, dan waktu inkubasi 6 hari menghasilkan aktivitas sebesar 3.56 U/ml. Aktivitas optimum enzim β-glukosidase berada pada pH 5.0 dan suhu 60 ºC. Enzim β-glukosidase relatif stabil pada pH 4.2 - 5.0. Enzim β-glukosidase juga stabil pada penyimpanan suhu 28 dan 40 ºC, tetapi tidak stabil pada suhu 80 ºC. Aktivitas β-glukosidase meningkat dengan adanya penambahan kation-kation Mg2+, Ba2+, Ca2+, Mn2+, dan Co2+ dengan konsentrasi akhir 1mM. Aktivitas β-glukosidase meningkat setelah penambahan EDTA dan ion Fe2+ dengan konsentrasi akhir 5 mM. Aktivitas β-glukosidase menurun setelah penambahan kation Cu2+ dan Zn2+, baik dengan konsentrasi akhir 1 mM maupun 5 mM. Aktivitas spesifik β-glukosidase meningkat 2 kali lipat setelah pemekatan dengan menggunakan pelarut organik aseton pada tingkat kejenuhan 80%, tetapi kadar proteinnya menurun 64%. Hasil analisis SDS-PAGE memperlihatkan adanya 4 pita protein yang terbentuk, masing-masing dengan berat molekul 134.9, 104.7, 87.1, dan 41.7 kDa. Hasil analisis zimografi menunjukkan bahwa enzim β-glukosidase Aspergillus foetidus (Naka.) (RM 3D) mempunyai berat molekul 134.9 kDa.

ABSTRACT

TRIRAKHMA SOFIHIDAYATI. Isolation and Screening β-glucosidase-producing fungi and Characterization the enzyme. Under the direction of: I MADE ARTIKA and TRESNAWATI S. PURWADARIA.

Plants are producing carbohydrate in the form of polysacharide and lignocellulose. Cellulose can not be used as a energy sources by poultry, because they do not have rumen microorganism having capability to digest cellulose. Several methods employed in waste management are using cellulolytic-producing microbacteria. Cellulolytic enzyme is produced by fungi, snails and termites. The purpose of this research is to isolate β-glucosidase- producing fungi and characterize the enzyme. Beta-glucosidase activity is indicated by the presence of black zone on medium containing esculin. The fungi having high level β-glucosidase (RM 3D) activity identified as Aspergillus foetidus (Naka.) Thom and Raper.

Beta-glucosidase enzyme production from Aspergillus foetidus (Naka.) (RM 3D) on the medium containing 3% wheat pollard, at room temperature and with incubation periode of 6 days showed activity at 3.56 U/ml. The optimum activity level of β-glucosidase was reached at pH 5.0 and temperature 60 ºC. The stable condition for

the β-glucosidaseis was observed in pH 4.2 – 5.0. The enzyme was relatively stable at 28 and 40 ºC, but very unstable at 80 ºC. The activity of β-glucosidase increased by addition of cations Mg2+, Ba2+, Ca2+, Mn2+, Co2+ and EDTA at concentration of 1 mM, and by EDTA and Fe3+ at concentration of 5 mM. On the other hand, the activity

decreased when 1 mM and 5 mM cations of Cu2+ and Zn2+ were added. The activity of

β-glucosidase increased two fold after precipitated by organic solvent acetone at 80%, but the protein level decreased 64%. Analysis on SDS-PAGE of the enzyme generated 4 protein band appeared at molecular weight of 134.9, 104.7, 87.1 and 41.7 kDa respectively. Zymografi analysis confirmed that the β-glucosidase Aspergillus foetidus

SURAT PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul:

ISOLASI DAN PENAPISAN KAPANG PENGHASIL β-GLUKOSIDASE DAN KARAKTERISASI ENZIM YANG DIHASILKAN

Adalah benar merupakan hasil penelitian saya sendiri dan belum pernah dipublikasikan. Semua sumber data dan informasi yang digunakan jelas dan dapat diperiksa kebenarannya

Bogor, Maret 2007

TRIRAKHMA SOFIHIDAYATI NRP. G451030031

ISOLASI DAN PENAPISAN KAPANG PENGHASIL

β

-GLUKOSIDASE DAN KARAKTERISASI

ENZIM YANG DIHASILKAN

TRIRAKHMA SOFIHIDAYATI

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Judul Tesis : Isolasi dan Penapisan Kapang Penghasil β-Glukosidase dan Karakterisasi Enzim yang dihasilkan

Nama : Trirakhma Sofihidayati

NRP : G451030031

Program Studi : Biokimia

Menyetujui,

1. Komisi Pembimbing

Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc Dr. Ir. Tresnawati S. Purwadaria

Ketua Anggota

Mengetahui,

2. Ketua Program Studi Biokimia Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Semarang pada tanggal 4 September 1963 sebagai anak ketiga dari empat bersaudara dari Bapak H. Sundjoto Ariyosuhendro dan Ibu almarhumah Hj. Siti Arifah. Tahun 1990 penulis menikah dengan Erwanto dan mempunyai seorang anak, Anisa Fatiha Qodriyani (1999)

Penulis menyelesaikan pendidikan sarjana di Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pakuan Bogor pada tahun 1991, dan pada tahun 2003 penulis diterima di Program Studi Biokimia pada Sekolah Pascasarjana IPB. Penulis bekerja sebagai pengajar Luar Biasa pada jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pakuan Bogor.

PRAKATA

Segala puji dan syukur penulis panjatkan bagi Allah yang Maha Pengasih dan Penyayang atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga tesis ini dapat terselesaikan.

Tesis yang berjudul “Isolasi dan Penapisan Kapang Penghasil β-Glukosidase dan Karakterisasi Enzim yang Dihasilkan” disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan dari bulan Juli 2005 sampai dengan Agustus 2006 di Laboratorium Pakan, Balai Penelitian Ternak, Ciawi, Bogor.

Penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga dan penghargaan yang

setinggi-tingginya kepada Bapak Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc. dan Ibu Dr. Ir. Tresnawati S. Purwadaria selaku pembimbing atas arahan, bimbingan,

perhatian dan kesabarannya yang telah diberikan dalam penelitian dan penulisan tesis. Terima kasih penulis sampaikan kepada Bapak Kepala Balai Penelitian Ternak Ciawi Bogor atas izin dan segala fasilitas yang diberikan kepada penulis selama melakukan penelitian. Tak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada Pak Helmi, Ibu Emi, Pak Tyas, Ibu Ema, Ibu Tuti, Ibu Susan, Nila, Eka, dan semua pegawai Laboratorium Pakan dan Analitik Balitnak Ciawi Bogor atas bantuan dan pengorbanan waktunya. Demikian pula kepada Pak Arya di Biokimia, Ibu Emmi di Mikologi dan Anggia di Bioteknologi yang rela dan siap membantu untuk menyelesaikan penelitian.

Rasa terima kasih dan sayang penulis sampaikan kepada Papa tercinta yang telah mendidik, mendoakan, memberi dorongan semangat dan kasih sayangnya. Kepada Suamiku tercinta atas pengertian dan perhatiannya selama penulis melakukan studi dan penelitian. Juga kepada kakak-kakak dan adikku yang telah memberi bantuan dan dorongan semangatnya. Rekan-rekanku Pak Rikson, Bustan, Tati, Ade dan semua pihak yang turut membantu yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu atas dukungan moril dan persahabatannya. Serta kenangan yang mendalam kepada Almarhumah Mama atas doa, motivasi dan kasih sayangnya yang tulus semasa hidup.

Semoga Allah SWT yang Maha Pemurah membalas semua kebaikan yang diberikan dengan balasan yang lebih sempurna.

Penulis menyadari bahwa penulisan ini masih banyak kekurangannya, namun demikian semoga hasil penelitian ini bermanfaat bagi penelitian selanjutnya.

Bogor, Maret 2007

Halaman

DAFTAR TABEL ... .... xi

DAFTAR GAMBAR ... xii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiii

PENDAHULUAN Latar Belakang ... 1

Tujuan ... 3

Manfaat Penelitian... 4

Hipotesis ... 4

TINJAUAN PUSTAKA Selulosa dan Enzim Selulase ... 5

Mekanisme Penguraian Selulosa ... 9

Enzim β-glukosidase ... 10

Pemekatan dan Pemisahan Enzim... 12

Pemanfaatan Kapang ... 16

BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian... 18

Bahan dan Alat ... 18

Metode Penelitian ... 18

Isolasi Kapang Selulolitik ... 18

Penapisan Kapang Penghasil β-glukosidase... 19

Pembuatan Polard NaOH ... 19

Produksi Enzim ... 19

Penentuan Aktivitas Enzim ... 20

Penentuan Aktivitas Total Selulase ... 20

Penentuan Aktivitas β-glukosidase ... 20

Penentuan Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik.... 21

Karakterisasi Enzim β-glukosidase ... 22

Penentuan pH dan Suhu Optimum Enzim ... 22

Penentuan pH dan Suhu Stabilitas enzim ... 22

Pengendapan Protein dengan Aseton ... 22

Pengaruh EDTA dan Ion logam terhadap Aktivitas Enzim... ... 22

Penentuan Berat Molekul Enzim dengan Teknik Zimografi... 23

Pembuatan Gel Poliakrilamida SDS-PAGE ….…. 23 Preparasi Sampel Protein ….……….……. 23

x

Pewarnaan Protein ……… 24

Analisis Zimografi SDS-PAGE ... 25

Identifikasi Isolat Kapang ……….………… 25

HASIL DAN PEMBAHASAN Penapisan Kapang Secara Semi Kuantitatif ... 26

Identifikasi Isolat Kapang RM 3D... 30

Karakterisasi Enzim β-glukosidase ... 31

Pengaruh pH Dan Suhu Terhadap Aktivitas ... 31

Pengaruh pH Dan Suhu Terhadap Stabilitas …………... 34

Pengaruh Penambahan Aseton Terhadap Perolehan Kembali Protein dan Aktivitas Spesifik... 37

Pengaruh EDTA dan Kation... 38

Penentuan Bobot Molekul ... 40

SIMPULAN DAN SARAN ... 42

DAFTAR PUSTAKA ... 44

xi

Halaman

1 Hidrolisis berbagai substrat oleh enzim selulolitik……… 8

2 Metode pemurnian untuk mengisolasi β-glukosidase dari komponen

selulase... 14

3 Produk metabolit yang dihasilkan kapang... 17

xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Struktur selulosa. ... 5

2 Struktur molekul selulosa ... 6

3 Mekanisme hidrolisis selulosa oleh kompleks selulase... 9

4 Model regulasi biosintesis selulase ... 11

5 Pemotongan eskulin oleh adanya aktivitas enzim β-glukosidase... 15

6 Beberapa isolat hasil isolasi. ... 28

7 Kurva produksi enzim Fpase isolat kapang... 29

8 Kurva produksi enzim β-glukosidase isolat kapang... 30

9 Isolat kapang Aspergillus foetidus (Naka.) (RM 3D)... 31

10 Aktivitas β-glukosidase terhadap variasi pH... 32

11 Aktivitas β-glukosidase terhadap variasi suhu... 33

12 Stabilitas β-glukosidase terhadap variasi pH... 35

13 Stabilitas β-glukosidase pada suhu 28 ºC ... 36

14 Stabilitas β-glukosidase pada suhu 40 ºC ……….. 36

15 Stabilitas β-glukosidase pada suhu 80 ºC ... 37

16 Pengaruh Aseton Terhadap β-glukosidase... 38

17 Pengaruh EDTA dan Kation terhadap aktivitas β-glukosidase... 39

xiii

Halaman

1 Diagram alir Penelitian……….. 51

2 Pembentukan daerah hitam Aspergillus foetidus (Naka.) (RM 3D) pada media agar Dubos... 52

3 Komposisi penambahan pelarut organik………... 53

4 Komposisi media dan pereaksi dalam 1 L larutan ……… 54

5 Standar Bobot molekul. ……….. 56

6 Kurva standar nitrofenol dalam bufer asetat pada T 50º C ……... 57

7 Kurva standar nitrofenol dalam bufer asetat pada pH 5.0………. 58

8 Kurva standard glukosa untuk penentuan aktivitas FPase pada T 50º C……… 59

9 Kurva standar protein ………... 60

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Karbohidrat merupakan sumber energi utama bagi mahluk hidup. Karbohidrat terdiri dari kelompok monosakarida, disakarida dan polisakarida. Tumbuh-tumbuhan adalah penghasil karbohidrat terbesar, yaitu polisakarida dalam bentuk pati dan lignoselulosa (selulosa, hemiselulosa dan lignin). Komponen-komponen tersebut dihasilkan dari proses fotosintesis (Lea dan Leegood 1994). Selulosa belum banyak dimanfaatkan sebagai sumber energi untuk ternak unggas karena sulit dicerna. Untuk ternak ruminansia seperti sapi, kerbau, domba dan yang lainnya, selulosa dapat dicerna karena kelompok hewan tersebut memiliki mikroorganisme rumen yang mampu mencerna selulosa.

Hewan nonruminansia seperti unggas merupakan komoditi yang paling banyak diproduksi dan dimanfaatkan oleh masyarakat. Karena itu ketersediaan pakan untuk unggas harus dapat dipenuhi dengan baik (Butarbutar 2001). Pakan unggas yang umum digunakan adalah jagung yang bertindak sebagai sumber energi, sedangkan bungkil kedelai dan tepung ikan sebagai sumber protein (Anonimus 1995).

Perkembangan peternakan di Indonesia menuntut adanya pakan yang murah, berkualitas, tersedia dalam jumlah yang cukup serta tidak bersaing dengan manusia. Murtidjo (1992) melaporkan bahwa biaya ransum dalam usaha peternakan ayam mencapai 60-70% dari total biaya produksi. Berbagai limbah pertanian dan industri seperti polard (dedak gandum) dan dedak padi, berpotensi sebagai pakan ternak alternatif untuk menggantikan pakan yang masih diimport. Limbah pertanian ini meskipun tersedia dalam jumlah yang cukup memadai dengan harga yang lebih murah, tetapi masih sangat terbatas dimanfaatkan sebagai pakan ternak. Selain mengandung protein, limbah tersebut mengandung kadar serat yang cukup tinggi sehingga sulit dicerna. Polard mengandung kadar serat sekitar 30-35%, dedak padi 62% (Juliono 1996) dan serat sabut sawit 40% (Aritonang 1986). Tingginya kadar serat ini disebabkan oleh tingginya kadar selulosa, yang merupakan komponen utama penyusun dinding sel tanaman (Lea dan Leegood 1994). Atas dasar itu perlu adanya upaya untuk

mendegradasi selulosa dengan cara atau teknologi yang dapat meningkatkan nilai nutrisi dan kecernaan limbah tersebut.

Beberapa cara pengolahan limbah yang sudah dikenal antara lain pengolahan

fisik, kimia, dan biologi (Judoamidjojo et al. 1989). Cara-cara pengolahan ini

diharapkan dapat memecah ikatan selulosa menjadi gula sederhana yang akhirnya dapat dengan mudah dimanfaatkan oleh ternak sebagai sumber energi. Pengolahan secara biologi (biofermentasi) dapat dilakukan dengan menggunakan bantuan mikrob yang

dapat menghasilkan enzim selulolitik, misalnya kapang. Kapang Aspergillus niger dan

Rhizopus oligosporus misalnya, diketahui mampu menghasilkan beberapa jenis enzim,

antara lain enzim selulase, amilase, laktase dan protease (Landecker 1996). Bahkan

R. oligosporus juga dapat menghasilkan vitamin B12 dan mineral yang diperlukan oleh

ternak. Dalam lingkungan yang banyak mengandung selulosa, kapang mampu

menghasilkan enzim selulase yang dapat memecah ikatan β-1,4 glikosida pada selulosa

menjadi monomer-monomer yang lebih sederhana, seperti glukosa. Enzim selulase juga dihasilkan oleh mikroorganisme lain seperti siput dan rayap. Ekstrak rayap

mengandung selulase (endoglukanase dan β-glukosidase) (Purwadaria et al. 2003c) dari

epitel usus dan kelenjar ludahnya (Brune 1998). Aktivitas endoglukanase endogen pada

Reticulitermes spp. diketahui banyak terdapat di kelenjar ludahnya, sedangkan aktivitas

eksoglukanase dan β-glukosidase pada Coptotermes formosanus, masing-masing

ditemukan 75% di usus tengah dan 24% di usus belakangnya (Itakura et al. 1997;

Asada et al. 1998). Aktivitas enzim selulase juga ditemukan pada sarang rayap yang

dihasilkan oleh aktivitas jamur termasuk kapang (Sand 1970). Nurbayti (2002) telah

berhasil memproduksi enzim selulase dari kapang Penicillium nalgiovense Laxa yang

diisolasi dari sarang rayap.

Sebagai negara tropis, Indonesia mempunyai keragaman hayati berupa mikroorganisme yang tersebar dalam berbagai media, baik tanah, air, ataupun dalam bahan pangan. Berbagai jenis kapang dapat diperoleh melalui cara isolasi. Teknik isolasi dilakukan untuk mendapatkan biakan murni yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme. Jenis kapang yang dapat digunakan sebagai mikrob penghasil enzim selulolitik pada dasarnya harus sama dengan mikrob yang terdapat dalam bahan pangan manusia, sehingga tidak membahayakan jika dikonsumsi oleh ternak. Jenis enzim yang akan digunakan juga tergantung pada jenis bahannya (Stanbury dan Whitaker 1994).

3

Hidayat (2002) memanfaatkan enzim selulase untuk mendegradasi selulosa yang terdapat pada jerami padi. Bungkil kelapa yang mengandung manan merupakan substrat yang baik untuk memproduksi enzim mananase (Yunaeni 1998; Purwadaria

et al. 2003b). Kemampuan dan kecepatan mikrob tersebut dalam menghidrolisis

senyawa polimer menjadi senyawa monomer dipengaruhi beberapa faktor, diantaranya kadar substrat, pH, suhu dan waktu inkubasi.

Beberapa enzim yang terlibat dalam proses degradasi selulosa adalah

endoglukanase, eksoglukanase, dan β-glukosidase. Dalam mendegradasi selulosa,

enzim endoglukanase dan eksoglukanase menghasilkan selobiosa yang akhirnya dapat menghambat aktivitas kerja enzim itu sendiri. Beta-glukosidase berperan sebagai penghidrolisis selobiosa menjadi senyawa yang lebih sederhana, yaitu glukosa, yang dapat segera dimanfaatkan oleh makhluk hidup, dalam hal ini ternak unggas.

Proses biofermentasi mempunyai banyak keuntungan dibandingkan pengolahan cara fisik dan kimia. Selain aman dan sederhana, biofermentasi juga memungkinkan terjadinya peningkatan nilai nutrisi pada limbah pertanian dan industri. Namun penggunaan enzim komersial untuk proses enzimatik pada limbah pertanian dan industri tidak ekonomis, karena harganya yang mahal. Karena itu, perlu adanya teknologi yang dapat meningkatkan daya cerna limbah pertanian tersebut dengan biaya yang lebih murah. Produksi suatu enzim dapat ditingkatkan dengan penemuan strain baru yang lebih berpotensi atau dapat juga melalui induksi strain mutan agar dapat menghasilkan enzim yang diharapkan dengan jumlah yang lebih besar. Besarnya manfaat kapang dan pentingnya peran enzim dalam mengkatalisis suatu reaksi,

memberi pemikiran bagi penulis untuk melakukan penelitian tentang enzim

β-glukosidase yang dihasilkan oleh kapang dari lingkungan rayap.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk:

1. Mengisolasi kapang dari lingkungan rayap yang mampu menghasilkan

enzim β-glukosidase

2. Memproduksi enzim β-glukosidase

Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi tentang karakter enzim

β-glukosidase agar mampu menghasilkan aktivitas yang optimal apabila digunakan

dalam campuran pakan.

Hipotesis

Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah bahwa dalam lingkungan

sarang rayap terdapat kapang yang mampu menghasilkan enzim β-glukosidase dengan

TINJAUAN PUSTAKA

Selulosa dan Enzim Selulase

Selulosa merupakan komponen terbesar lignoselulosa tanaman. Selulosa berupa

polimer glukosa yang berikatan melalui ikatan β,1-4-glikosida (Gambar 1) (Landecker

1996; Alberts et al. 2000). Pada tumbuhan tingkat tinggi, selulosa merupakan

makromolekul organik dan merupakan materi penyusun dinding sel yang terdiri dari fibril-fibril yang terikat secara kuat satu dengan lainnya secara pararel. Di dalam serat, selulosa membentuk bagian kristal dengan susunan fibril yang sangat teratur, yang disebut dengan mikrofibril, dan bagian yang kurang teratur yang disebut dengan bagian amorf (Lea dan Leegood 1994).

A

Daerah kristal Daerah amorf

B

Gambar 1. Struktur selulosa. (A) Ikatan β-1,4-glikosida (B) Struktur fibril yang

membentuk selulosa kristal dan amorf (Enari 1983; Beguin dan Aubert 1994).

Bagian selulosa kristal sulit untuk dirombak karena tersusun atas mikrofibril yang saling terikat erat satu sama lain. Antara mikrofibril dihubungkan oleh ikatan hidrogen intermolekul sehingga selulosa sukar larut dalam air. Bagian amorf selulosa relatif lebih mudah ditembus air. Sebagian besar selulosa mengandung 15% bagian amorf dan 85% bagian kristal. Selulosa dapat dihidrolisis menjadi monosakarida atau oligosakarida dengan menggunakan cara kimiawi maupun cara biologi. Hidrolisis dengan cara kimiawi, dilakukan dengan menggunakan asam atau basa, sedangkan

O O O

O

O O

O

O O

OH OH

OH OH

OH

OH _OH

OH

HO HO

HO HO

Selobiosa Glukosa 1 4

1

1

1 4

hidrolisis secara biologi, disebut juga dengan cara enzimatik, dapat dilakukan dengan menggunakan enzim selulase murni atau dengan mikroorganisme penghasil enzim

selulase (Hardjo et al. 1989).

Selulosa merupakan polimer yang terdiri dari 100-14.000 unit glukosa yang

berikatan melalui ikatan β,1-4-glikosida. Ikatan β ini menimbulkan rantai lurus

panjang yang membentuk serat dengan daya rentang tinggi (Alberts etal. 2000; Stryer

2000). Serat-serat selulosa pada tanaman terikat pada matrik protein dan senyawa polisakarida lainnya. Matrik ini disusun oleh dua molekul polisakarida, yaitu hemiselulosa dan pektin, yang komposisi keduanya berbeda antara spesies satu dengan spesies lainnya. Serat dan molekul matriks tersebut dihubungkan oleh ikatan hidrogen yang membentuk ikatan intermolekul dan intramolekul. Ikatan intermolekul terjadi

antara gugus OH dari atom C nomor enam dengan atom O pada ikatan β,1-4-glikosida.

Ikatan intramolekul terjadi antara gugus OH pada atom C nomor tiga dengan atom O pada cincin piranosa (Lea dan Leegood 1994) (Gambar 2).

Gambar 2. Struktur molekul selulosa (Alberts et al. 2000)

Enzim selulase adalah kelompok enzim hidrolitik yang mempunyai kemampuan menghidrolisis selulosa menjadi glukosa. Glukosa yang dihasilkan selanjutnya dapat dimanfaatkan sebagai bahan makanan oleh manusia atau hewan, atau dapat juga digunakan untuk memproduksi bahan-bahan kimiawi. Simanjuntak (1998) telah

membuktikan bahwa penggunaan kapang A. niger untuk memfermentasi bungkil inti

CH2

CH2

CH2

CH2

O _O

O O

O O H-O H-O H-O O-H O-H H-O OH OH HO OH O

O H

O

O

H O

O

O O

O O

O O-H O-H HO HO O CH2 CH2 CH2 H H H O O H H Ikatan hidrogen intramolekul Ikatan hidrogen intermolekul

7

sawit dapat meningkatkan energi metabolisme. Suatu enzim bekerja secara spesifik, dan dapat mempercepat reaksi dengan menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia (Lehninger 2000; Stryer 2000).

Enzim selulase adalah enzim yang dapat memutuskan ikatan glikosida β-1,4 di

dalam selulosa, selodekstrin, selobiosa dan turunan selulosa lainnya, dan menguraikannya menjadi glukosa (Fogarty dan Kelly 1982; Landecker 1996). Enzim selulase merupakan enzim induksi yang dihasilkan sebagai tanggapan terhadap selulosa yang ada di lingkungan pertumbuhan organisme penghasilnya. Aktivitas enzim selulase merupakan hasil kerja tiga tipe enzim yang saling berkaitan dari kompleks enzim

selulase, yaitu (i) endoglukanase, (ii) eksoglukanase, (iii) dan β-glukosidase (Whitaker

1994).

Endoglukanase [1,4 (1,3;1,4)-β-D-glukan 4-glukanohidrolase; EC 3.2.1.4]

menghidrolisis ikatan β-glikosida pada selulosa secara acak menghasilkan glukosa,

selobiosa, selodekstrin dan oligomer lainnya (Hoshino et al. 1994). Pada umumnya

enzim ini bekerja pada selulosa amorf dan selulosa tersubstitusi yang mudah larut

seperti carboxy methyl cellulose (CMC) (Tabel 1) dan hidroksietil selulosa, dan tidak

aktif pada selulosa kristal seperti katun dan avisel (suatu selulosa mikrokristalin) (Whitaker 1994). Karena endoglukanase memiliki aktivitas yang sangat tinggi pada

substrat CMC (Hoshino et al. 1994) enzim ini disebut sebagai CMCase (Gong dan Tsao

1979). Tetapi Cai et al. (1999) menemukan aktivitas endoglukanase pada Volvariella

volvacea yang tinggi justru pada avisel, bukan pada CMC.

Eksoglukanase (sellobiohidrolase atau 1,4-β-D-glukan sellobiohidrolase; EC

3.2.1.91) merupakan komponen selulase yang memecah selulosa kristal dengan menghilangkan gugus selobiosa pada ujung akhir nonreduksi rantai selulosa (Hoshino

et al. 1994). Endoglukanase dan selobiohidrolase dapat bekerja secara sinergis

menghidrolisis selulosa dengan optimum (Purwadaria 1997). Selobiohidrolase menunjukkan aktivitas yang tinggi pada avisel, yang dapat mencapai 40%, tetapi menunjukkan aktivitas yang rendah pada selulosa amorf seperti CMC. Karena aktivitasnya yang tinggi pada avisel, eksoglukanase dikenal juga sebagai aviselase

Tabel 1. Hidrolisis berbagai substrat oleh enzim selulolitik (Enari 1983)

Enzim

Substrat

Selulosa CMC Selulosa Selo- Selobiosa Kristal amorf tetraosa

Endoglukanase Selobiohidrolase

β-Glukosidase

- + + + - + - + + - - - - + +

Beta-glukosidase (sellobiase atau β-D-glukosida glukohidrolase, EC 3.2.1.21)

merupakan enzim yang menghidrolisis selobiosa dan selooligomer menjadi glukosa, dan menghilangkan glukosa dari ujung akhir nonreduksi rantai selodekstrin yang

pendek (Whitaker 1994). Eksoglukohidrolase dan β-glukosidase umumnya terdapat

pada substrat yang mengandung selobiosa (dua unit glukosa), hingga seloheksaosa (enam unit glukosa). Kedua enzim tersebut dapat dibedakan berdasarkan aktivitasnya

terhadap selobiosa dan seloheksaosa. β-glukosidase lebih cepat menghidrolisis

selobiosa daripada seloheksaosa, sementara eksoglukohidrolase bertindak sebaliknya.

Enzim β-glukosidase sangat berperan sebagai penghidrolisis selobiosa, yang menjadi

penghambat aktivitas eksoglukanase dan endoglukanase (Takano 1992; Whitaker 1994).

Enzim selulase dan hemiselulase merupakan dua jenis enzim yang dihasilkan oleh sebagian besar kapang. Enzim selulase yang dihasilkan oleh kapang genus

Trichoderma sebagian besar merupakan enzim selobiohidrolase (Kim et al. 1994;

Jorgensen et al. 2003), sedangkan enzim selulase yang berasal dari genus Aspergillus,

komponen terbesarnya adalah enzim β-glukosidase (Kader dan Omar 1998; Juhăsz

et al. 2003; Purwadaria et al. 2003a). Aktivitas sinergis dari beberapa spesies dapat

menghasilkan degradasi selulosa dan hemiselulosa secara optimum. Campuran 20%

volume enzim yang berasal dari Eupinicillium javanicum (tinggi aktivitas CMCase,

β-D-mannanase dan α-D-galaktosidase) dan 80% volume enzim A. niger (tinggi

aktivitas β-glukosidase, β-D-mannosidase) dapat meningkatkan gula pereduksi pada

POME (Palm Oil Mill Effluent) sampai 55% (Purwadaria et al. 2003a). Limbah kertas

9

menghasilkan aktivitas β-glukosidase tertinggi (3.07 IU/ml) setelah 7 hari inkubasi

(Juhăsz et al. 2003).

Mekanisme Penguraian Selulosa

Dalam hidrolisis selulosa terdapat tiga komponen enzim yang terlibat, yaitu

endoglukanase, selobiohidrolase, dan β-glukosidase (Gambar 3). Penguraian selulosa

dimulai pada daerah amorf oleh endoglukanase secara acak sehingga membentuk rantai yang terbuka bagi aktivitas selobiohidrolase. Aktivitas selibiohidrolase membebaskan unit selobiosa dan selodektrin dari ujung rantai selulosa. Endoglukanase selanjutnya menyerang pada lapisan kedua dari serat selulosa dan diikuti oleh aktivitas selobiohidrolase. Akhirnya selobiosa dan selooligosakarida yang terbentuk dihidrolisis

oleh enzim β-glukosidase membentuk glukosa.

•

•

n

Selobiosa dan glukosa

selooligosakarida

Gambar 3. Mekanisme hidrolisis selulosa oleh kompleks selulase (Enari 1983)

EG atau CBH

Selobiohidrolase (CBH) Endoglukanase (EG)

β-Glukosidase

Regulasi biosintesis selulase terjadi karena selobiosa dalam jumlah kecil pada substrat selulosa dan merupakan hasil hidrolisis dari selulase masuk ke dalam sel melalui sistem transport aktif (Gambar 4). Sebagian selobiosa yang masuk ini akan

dihidrolisis menjadi glukosa oleh enzim β-glukosidase konstitutif. Selobiosa

intraseluler kemudian menjadi induser aktif yang bereaksi dengan protein represor, sehingga mengakibatkan protein represor menjadi tidak aktif. Akibatnya terjadi induksi, yang kemudian diikuti dengan proses transkripsi dan translasi enzim selulase. Selulase yang disintesis didalam sel kemudian dikeluarkan melintasi membran melalui mekanisme pelepasan yang spesifik. Selulase ekstraseluler ini menghidrolisis selulosa menjadi selobiosa dan glukosa ekstraseluler. Selobiosa dan glukosa masuk kedalam sel dan terlibat dalam proses induksi dan represi. Selobiosa yang tinggi memicu aktivitas

dan sintesis enzim β-glukosidase, tetapi kadar glukosa intraseluler yang tinggi dapat

mempengaruhi sintesis selulase melalui mekanisme represi katabolit dan juga

menghambat aktivitas β-glukosidase intraseluler. Akumulasi glukosa di dalam sel

memicu aktivitas enzim glukosa oksidase, yang akan mengoksidasi glukosa menjadi

asam glukonat dan glukonolakton. Glukonolakton dapat menghambat aktivitas

β-glukosidase (Gong dan Tsao 1979; Landecker 1996).

Enzim β-glukosidase

Enzim β-glukosidase menghidrolisis dengan cepat substrat dengan bobot

molekul (BM) yang kecil. Berdasarkan substrat yang dihidrolisis, enzim β-glukosidase

dikelompokkan menjadi tiga jenis, yaitu selobiase, aril-β-glukosidase, dan ekso-β−1,4

-glukan glukohidrolase. Selobiase menghidrolisis selobiosa. Aril-β-glukosidase

menghidrolisis p-nitrophenilglukosida (pNPG), dan ekso-β−1,4-glukan glukohidrolase

menghidrolisis selooligomer (Gong dan Tsao 1979). Selain aktif pada substrat yang

mengandung berbagai p-nitrofenilglukosida, enzim β-glukosidase diketahui juga

menghidrolisis ikatan β-D-galaktosida, β-D-fukosida dan α-L-arabinosida pada

Rhodoturulaminuta(Onishi dan Tanaka 1996; Li et al. 2001).

Enzim β-glukosidase pada Aspergillus merupakan enzim konstitutif intraseluler.

Enzim konstitutif yaitu enzim yang dapat diproduksi tanpa adanya suatu induser. Induser berfungsi untuk menginaktifkan sistem represor pada pembentukan enzim

11

Transkripsi dan Translasi

(Gong dan Tsao 1979; Stryer 2000). Aktivitas enzim β-glukosidase dapat diinduksi

secara optimum oleh substrat yang mengandung campuran filter paper dan pati

(Landecker 1996), tetapi dihambat oleh glukosa, secara kuat oleh D-δ-glukonolakton

(Chen et al. 1998; Svasti et al, 1999; Stryer 2000, Parry et al. 2001) dan oleh adanya

penambahan 0.2% (b/v) maltosa (Pandey dan Mishra 1995).

Di luar sel Membran Sitoplasma

Glukosa

Transport aktif

Selobiosa Selobiosa β-glukosidase Glukosa glukosa Glukono

Intraseluler Intraseluler oksidase lakton +

Inhibisi

Selulolisis

Induser aktif

Induser-protein repressor

Selulosa Induksi

Represi

+

Selulase Pelepasan

Ekstraseluler Selulase yang terikat pada sel

Gambar 4. Model regulasi biosintesis selulase (Gong & Tsao 1979) +

Sebaliknya aktivitas enzim β-glukosidase pada daun cassava ternyata tidak nampak dihambat oleh gula ataupun monosakarida lain seperti galaktosa dan fruktosa (Yeoh

dan Woo 1992). Bahkan Kumalasari (2003) mendapatkan aktivitas enzim

β-glukosidase yang meningkat 2 kali lipat dengan adanya penambahan glukosa 250

ppm. Sementara aktivitas β-glukosidase yang meningkat pada buah tomat diperkirakan

sebagai respon adanya infeksi jamur patogen (Georgieva et al. 2004).

Seperti halnya enzim yang lain, aktivitas enzim β-glukosidase diantaranya

dipengaruhi oleh pH, suhu, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim dan waktu inkubasi. Suhu dapat meningkatkan aktivitas enzim hingga dua kali lipat setiap kenaikan suhu 10 ºC sampai mencapai suhu optimum, setelah itu pada suhu ekstrim protein enzim akan mengalami denaturasi hingga enzim menjadi tidak aktif lagi. Begitu pula halnya dengan pH, pada pH optimum aktivitas enzim mencapai maksimum, tetapi di luar pH optimum aktivitasnya akan menurun. Suhu optimum suatu enzim berbeda antara spesies satu dengan spesies lainnya. Sebagian besar enzim mempunyai pH optimum 4 - 8. Untuk kapang pH optimum pada umumnya berada dibawah 7 (Landecker 1996). Konsentrasi substrat dan banyaknya enzim serta waktu inkubasi yang semakin bertambah akan meningkatkan aktivitas enzim sampai tingkat tertentu, kemudian

setelah itu aktivitasnya akan tetap (Murray et al. 2000). Enzim β-glukosidase

mempunyai suhu optimum 50 ºC (Asada 1999; Purwadaria et al. 2003a) dan pH

optimum 5.0 (Asada 1999), sedangkan suhu optimum untuk mikroorganisme termofilik

antara 45 – 65 ºC (Lin et al.1999). Desrochers et al.(1981) menyatakan bahwa pH

optimum untuk β-glukosidase dari S. commune adalah 5.3 dan suhu optimum pada

30 ºC. Enzim β-glukosidase yang diekstraksi dari rayap (Glyptotermes montanus)

mempunyai pH optimum 5.8, dan suhu optimum 42 – 45 ºC (Purwadaria et al. 2003c).

Pada daun cassava β-glukosidase mempunyai pH optimum 4.7 - 4.9 (Yeoh dan Woo

1992). Aktivitas enzim β-glukosidase dari A. niger dan R. minuta IFO879

masing-masing stabil selama 230 hari pada suhu 4 ºC (Yan dan Liau 1998).

Pemekatan dan Pemisahan Enzim

Pemekatan protein merupakan tahap awal dari prosedur pemurnian enzim. Pemekatan dapat dilakukan dengan menggunakan garam amonium sulfat ataupun

13

pelarut organik seperti alkohol atau aseton. Pengendapan protein dengan menggunakan pelarut organik berdasarkan pada pengurangan kelarutan protein dan konstanta dielektrika pelarut. Semakin banyak pelarut organik yang ditambahkan, semakin berkurang daya solvasi air dan muatan pada permukaan molekul protein yang hidrofilik dan molekul-molekul pelarut organik akan mendekati daerah hidrofobik disekitar permukaan protein. Hal ini akan menurunkan kelarutan dan menyebabkan molekul-molekul protein berinteraksi satu dengan lainnya, dan akhirnya akan terjadi pengendapan. Prosedur pengendapan dengan menggunakan pelarut organik dilakukan pada suhu rendah. Pada suhu diatas 10 ºC, konformasi protein akan mengalami perubahan sehingga molekul-molekul pelarut organik dapat masuk ke bagian dalam struktur protein dan merusak interaksi hidrofobik, akibatnya protein akan mengalami denaturasi (Scopes 1987, Harris 1989).

Teknik pemisahan β-glukosidase dari kompleks selulase dilakukan sama seperti

pemurnian protein yang lainnya. Beberapa contoh metode pemurnian yang digunakan

untuk mengisolasi β-glukosidase terdapat pada Tabel 2. Berat molekul (BM) enzim

β-glukosidase dapat ditentukan dengan menggunakan metode pemisahan elektroforesis.

Elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid ditambah dengan adanya deterjen anionik, SDS, digunakan untuk memisahkan protein menjadi subunit-subunit protein dan menentukan masing-masing berat molekulnya. SDS-PAGE dengan sistim diskontinu dari Laemmli (1970) digunakan untuk menentukan homogenitas dan BM

selulase. Larutan contoh yang mempunyai aktivitas enzim β-glukosidase selanjutnya

dapat dideteksi dengan menggunakan analisis zimografi. Analisis zimografi yang digunakan untuk mengidentifikasi pita-pita protein pada gel poliakrilamid dapat dilakukan melalui tiga cara (Purwadaria 1988), yaitu :

1. Analisis Zimografi dengan metode elusi

Metode ini digunakan bila substrat tidak larut. Pita-pita protein dipisahkan dengan memotong gel menjadi strip-strip. Penentuan aktivitas enzim dilakukan dengan mengelusi enzim dari pita.

2. Analisis Zimografi dengan aktivitas pewarnaan

Metode aktivitas pewarnaan menunjukkan lokasi pita protein yang mempunyai

Tabel 2. Metode pemurnian untuk mengisolasi β-glukosidase dari komponen selulase

Organisme Metode pemurnian Komponen Enzim

Schizophyllum commune Bio-Gel P200 β-glukosidase

(Desrochers et al. 1981) SDS-PAGE (BM 97 kDa)

Ruminococcus albus DEAE Bio-Gel A β-glukosidase hasil kloning

(Takano et al. 1992)

Sephacryl S-200 HR

gel ( BM 120 kDa)

Mono Q Mono P SDS-PAGE

Pichia etchellsii PAGE β-glukosidase hasil kloning

(Pandey dan Mishra 1995) Analisis Zimogram (BM 200 kDa)

Rhodotorulaminuta IFO879 DEAE-Toyopearl β-glukosidase

(Onishi & Tanaka 1996) Butyl-Toyopearl (BM 144 kDa, dimer)

p-aminobenzyl 1-thio-

β-D-glukopiranosida

Agarose

Agarose Con A

Coptotermes formosanus

(Shiraki)

Superdex 200 DEAE-Toyopearl

β-glukosidase

(BM 68 kDa)

(Asada et al. 1998) _{600M (TOSOH)}

SDS PAGE

Thermomyces lanuginosus

-SSBP (Lin et al. 1999)

(NH4)2SO β-glukosidase

(BM 105 kDa, BM protein

4

S-Sepharose Q-Sepharose QAE-Sephadex

native 200 kDa) SDS-PAGE

Dalbergia cochinchinensis Pierre

Sephadex G-150

(NH4)2SO

β-glukosidase

(BM 66 kDa, BM protein

4

(Svasti et al, 1999) SDS PAGE native 330 kDa)

Thermoascus aurantiacus (NH4)2SO4 β-glukosidase

(Parry et al. 2001) Sephacryl 300 (BM 120 kDa, BM protein

SDS-PAGE Analisis Zimogram

15

poliakrilamid direaksikan dengan 4-metilumbelliferil β-D-glukosida (MUG)

setelah gel dicuci dengan bufer asetat pH 4 (Parry et al. 2001).

Metilumbelliferon yang dilepaskan akan berpendar oleh adanya sinar UV.

3. Analisis Zimografi dengan mencampurkan substrat dalam gel

Substrat p-NPG yang dicampurkan pada gel elektroforesis akan menghasilkan

pita berwarna kuning.

Identifikasi aktivitas enzim β-glukosidase secara semi kuantitatif dapat

dilakukan dengan menggunakan eskulin (6,7-dihidrocoumaric 6-glikosida) yang

ditambahkan pada medium pertumbuhan. Enzim β-glukosidase akan memotong eskulin

menjadi eskuletin (6,7-dihidroksi coumarin) yang akan membentuk senyawa kompleks

besi fenolat yang berwarna coklat atau hitam bila bereaksi dengan ion feri (Fe3+)

((James et al. 1997; Gratner 2006) (Gambar 5). Selain itu, komponen enzim

β-glukosidase dapat ditentukan aktivitasnya dengan mengukur pelepasan p-nitrofenol

(p-NP) dari hasil hidrolisis p-nitrofenil glukosida (p-NPG) (Lin et al. 1999). Satu unit

aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk

mengkatalisis pembentukan satu mikromol (10-6 mol) p-nitrofenol per menit pada

kondisi assay.

Gambar 5. Pemotongan eskulin oleh adanya aktivitas enzim β-glukosidase

(James et al. 1997; Gratner 2006)

Sumber Karbon

Eskuletin β-D-Glukosa

yg dikeluarkan

Kompleks Besi Fenolat

Pemanfaatan Kapang

Sel-sel mikrob merupakan pusat penghasil berbagai enzim. Produksi enzim dari mikroorganisme mempunyai beberapa keuntungan, diantaranya: lebih mudah ditumbuhkan pada lingkungan yang terkontrol, cepat beregenerasi, mudah dilakukan rekayasa genetika, dan siklus produksi yang singkat, bila dibandingkan dengan enzim yang berasal dari tumbuhan maupun hewan (Landecker 1996). Beberapa jenis mikrob dapat tumbuh pada substrat yang banyak mengandung selulosa dikarenakan kemampuannya menghasilkan enzim yang dapat mendegradasi derivat selulosa dan selulosa amorf. Organisme lain penghasil enzim selulase adalah rayap, yang mampu hidup di lingkungan yang mengandung lignoselulosa seperti kayu lapuk, rumput ataupun sampah tumbuhan pada berbagai kondisi. Kapang bersimbiosis dengan rayap dalam mendegradasi selulosa yang terdapat pada kayu. Karena kemampuannya menguraikan selulosa menjadi molekul glukosa yang relatif mudah memasuki dan dimanfaatkan oleh sel, rayap berpotensi digunakan sebagai makanan tambahan untuk

ternak (Purwadaria et al. 2003c).

Kapang mempunyai aplikasi yang sangat luas sebagai media penelitian dalam genetika, biokimia, dan penelitian nutrisi. Beberapa spesies kapang menghasilkan produk metabolit yang bermanfaat secara komersial, dan menjadi pedoman untuk mikologi industri, seperti kapang yang digunakan untuk menghasilkan enzim, antibiotik, dan bermacam-macam asam organik (Tabel 3). Dalam upaya memperbaiki mutu pakan, bantuan mikrob diperlukan dalam suatu proses fermentasi. Selain proses fermentasi, keberhasilan teknik ini ditentukan oleh jenis mikrob yang digunakan. Umumnya jenis mikrob yang digunakan adalah yang mempunyai aktivitas selulolitik yang tinggi dalam mendegradasi selulosa dan derivatnya, dan mampu meningkatkan kadar protein bahan (Landecker 1996).

17

Tabel 3. Produk metabolit yang dihasilkan oleh kapang (Landecker, 1996)

Produk metabolit Jenis kapang

Asam organik

Asam sitrat Asam glukonat Asam Itakonat

Enzim

Amilase, amiloglukosidase

Invertase Laktase

Enzim-enzim pektat Protease

Rennet

Antibiotik dan Obat-obatan

Agen antihiperkolesterol Cephalosporin

Ergot alkaloid Griseofulvin Penisilin

A. niger A. niger A. terreus

A. oryzae, A. niger, Rhizopus spp.

Aspergillus spp.

A. niger dan A. oryzae

A. niger, Botrytis cinerea, Penicillium notatum

Aspergillus spp. Mucor pusillus

Cryphonectria parasitica, Mucor spp.

Cephalosporium caerulens, P. citrinum, Monascus ruber

Acremonium chrisogenum Claviceps paspali

P. griseofulum P. chrysogenum

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Teknologi Pakan, Balai Penelitian Ternak, Departemen Pertanian, Ciawi, Bogor. Waktu yang dibutuhkan 13 bulan, dimulai pada bulan Juli 2005 sampai Agustus 2006.

Bahan dan Alat

Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah polard dari

PT. Indofeed-Bogor, Sigmasel-20, kertas saring Whatman No.1, esculin

(6,7-dihydro-coumeric 6-glycoside), 4-metilumbelliferil β-D-glukosida (MUG), p-nitrofenil-β

-D-glukosida (p-NPG), aseton, coomassie brilliant blue (CBB), dinitrosalicylic acid

(DNS), potato dextrose agar (PDA), ekstrak khamir, bacto pepton, streptomisin,

NaN3

Alat

, D-glukosa, serum bovin albumin, HMW Marker Kit (Amersham Pharmacia Biotech). Sumber isolat diperoleh dari kayu lapuk yang menjadi sarang rayap.

Alat-alat yang digunakan adalah pipetmikro, sentrifus berpendingin Beckman

GS-15R, sentrifus Clements Model B-Universal, autoklaf (TOMY SEIKO, Jepang),

Spektrofotometer U 2000 (Double wavelength Double Beam, Hitachi 557), pH meter

Horiba, Hoefer Macro Vue UV-20 transiluminator (Hoefer Scientific Inst, USA), piranti elektroforesis Mini VE Hoefer (Amersham Pharmacia Biotech), kuvet, neraca analitik Mettler P163 (ketelitian 1.0 mg) dan H 80 (ketelitian 0.1 mg), vorteks, ose,

rotaryshaker, blender, peralatan gelas, dan alat-alat lainnya.

Metode Penelitian Isolasi Kapang Selulolitik

Kapang diisolasi dari kayu lapuk yang menjadi sarang rayap. Mula-mula kapang yang terdapat pada kayu dilarutkan dengan larutan 0.85% NaCl steril, kemudian digoreskan pada medium Mandels (Lampiran 1) yang mengandung 1% bacto agar, 0.35% ekstrak khamir dan 0.075% pepton. Selain itu dapat juga dilakukan dengan cara

19

langsung yaitu menggoreskan kapang pada medium Mandels. Medium terdiri dari dua lapisan, dimana lapisan atas mengandung Sigmasel-20 0.5% sebagai sumber karbon dan streptomisin 100 ppm yang digunakan untuk mencegah pertumbuhan bakteri.

Kultur diinkubasi pada suhu ruangan dengan kondisi aerob. Isolat yang menghasilkan selulase akan membentuk zona bening di sekitar koloni isolat. Isolat kemudian dipindahkan pada medium PDA (Lampiran 4) untuk mendapatkan satu jenis koloni yang murni. Tiap-tiap koloni dipisahkan dan disimpan pada medium agar miring PDA. Tiga isolat pembanding koleksi Balitnak diremajakan pada medium agar miring dan diinkubasi pada kondisi sama.

Penapisan Kapang Penghasil β-glukosidaseSecara Semi Kuantitatif

Penapisan dilakukan berdasarkan rasio (perbandingan) diameter daerah hitam terhadap koloni pada medium Dubos (Lampiran 4) yang ditambah 0.02% ekstrak

khamir, 0.1% eskulin, dan 0.05% Fe-NH4

Isolat yang dipilih untuk memproduksi enzim β-glukosidase ditanam pada

media agar miring PDA dan diinkubasi selama 5 hari (Haryati etal. 1997). Kemudian

-sitrat. Kapang yang mempunyai aktivitas

enzim β-glukosidase akan memotong eskulin membentuk eskuletin yang bila bereaksi

dengan ion feri membentuk endapan yang berwarna hitam (Gratner 2006). Setelah diinkubasi selama 4 hari, ratio antara diameter koloni dengan diameter zona hitam diukur. Dari hasil pengamatan ini, dipilih beberapa isolat yang mempunyai aktivitas

β-glukosidase terbaik untuk digunakan sebagai penghasil enzim.

Pembuatan Polard NaOH

Kedalam 1 liter larutan NaOH 0.5% (b/v) ditambahkan sebanyak 50 gram polard kering. Campuran dididihkan selama 60 menit dalam penangas air. Selama pemanasan dilakukan pengadukan. Setelah didinginkan sampai suhu kamar, campuran disaring dengan kain tipis dan dicuci dengan air sampai air perasan mempunyai pH netral. Polard yang telah netral kemudian diletakkan merata dalam wadah dan dikeringkan dengan blower pada suhu 40 °C selama 2 hari. Polard yang telah kering

digiling dengan blender.

spora disuspensikan dalam 5 ml larutan NaCl 0.85%. Sebanyak 2 ml inokulum diinokulasikan pada 50 ml media Mandels yang mengandung 3% polard NaOH sebagai

sumber karbon, 0.3% ekstrak khamir, dan 0.075% bactopepton. Selanjutnya diinkubasi

pada suhu 30 °C dalam inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm selama 6 hari.

Masa inkubasi dihentikan dengan menambahkan 0.2% NaN3. Filtrat enzim dipisahkan

dengan sentrifugasi pada kecepatan 7000 rpm dengan suhu 4 °C selama 20 menit. Untuk mengetahui aktivitas enzim, dilakukan pengujian pada hari ke 5, 6 dan 7.

Penentuan Aktivitas Enzim

a. Penentuan Aktivitas Total Selulase (Filter Paper-ase)

Aktivitas Filter Paper-ase (FPase) ditentukan berdasarkan metode Mandels etal.

(1976). Sebanyak 0.4 ml filtrat enzim ditambah larutan bufer asetat pH 5.5 sampai

volumenya 1.5 ml. Selanjutnya ditambahkan kertas saring Whatman No.1 (1 x 6 cm2

Aktivitas FPase (U/ml) = x fp 2 x ml enzim yang dipipet

fp = faktor pengenceran

b. Penentuan Aktivitas β-glukosidase

), divorteks dan diinkubasi pada suhu 50 °C selama 60 menit. Reaksi dihentikan dengan penambahan 3 ml pereaksi DNS (Lampiran 4) (Miller 1959), campuran kemudian divorteks dan dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit, setelah pemanasan selesai campuran ditambah 5 ml akuades. Filtrat enzim dengan perlakuan yang sama tanpa inkubasi digunakan sebagai kontrol. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 540 nm. Blanko terdiri dari 1.5 larutan buffer asetat, 3 ml larutan DNS dan 5 ml akuades.

Kadar glukosa yang dihasilkan dihitung berdasarkan kurva standar dengan konsentrasi glukosa 0.0 - 0.6 mg dari larutan induk 3 mg/ml. Produksi 2 mg/ml glukosa

pada kondisi percobaan setara dengan 0.185 unit FPase/ml (Mandels etal. 1976).

0.185 x (mg glukosa sampel - mg glukosa kontrol)

Aktivitas β-glukosidase ditentukan dengan mengukur pelepasan p-nitrofenol

21

p-NPG 0.3% (b/v) diprainkubasi selama 10 menit pada suhu 50 °C. Sampel terdiri

dari 0.5 ml filtrat enzim, 0.5 ml larutan bufer asetat pH 5.0, dan 0.5 ml p-NPG 0.3%

dimasukkan dalam tabung reaksi. Kontrol terdiri dari 0.5 ml larutan buffer dan 0.5 ml

p-NPG. Sampel dan kontrol divorteks dan diinkubasi pada suhu 50 °C selama 60 menit.

Selanjutnya ditambah 1 ml Na2CO3 1 M. Untuk kontrol penambahan 0.5 ml filtrat

enzim dilakukan setelah penambahan Na2CO3. Sebagai blanko digunakan 1 ml

akuades, 0.5 ml larutan buffer asetat pH 5.0 dan 1 ml Na2CO3. Absorban diukur pada

panjang gelombang 400 nm. Kadar p-nitrofenol yang dihasilkan ditentukan berdasarkan

kurva standar dengan konsentrasi nitrofenol 0 - 24 µg/ml dari larutan induk 30 µg/ml.

Bila filtrat enzim terlalu pekat, dilakukan pengenceran hingga mencapai kadar nitrofenol standar. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang

dibutuhkan untuk mengkatalisis pembentukan satu mikromol (10-6

Aktivitas (U/ml) = x fp

ß-glukosidase Waktu inkubasi (menit) x BM nitrofenol (139 µg/µmol)

c. Penentuan Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik

Penentuan kadar protein dilakukan berdasarkan metode Bradford (1976). Sebanyak 0.2 ml filtrat enzim ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford (analisis semimakro) kemudian divortek. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 595 nm setelah 2 menit dan sebelum 1 jam. Blanko menggunakan 0.2 ml akuades yang direaksikan dengan 5 ml pereaksi Bradford. Kadar protein ditentukan dari kurva standar larutan BSA pada kisaran 0.1 sampai 1.0 mg protein/ml. Perhitungan aktivitas spesifik

enzim β-glukosidase dapat ditentukan dengan:

1000 (µg/mg)

mol) p-nitrofenol

per-menit pada kondisi yang ditentukan.

[nitrofenol]sampel (µg/ml) - [nitrofenol]kontrol (µg/ml)

Aktivitas Spesifik (U/mg) = x Aktivitas enzim (U/ml)

Karakterisasi Enzim β-glukosidase a. Penentuan pH dan Suhu Optimum Enzim

Penentuan pH optimum dilakukan dengan menguji aktivitas enzim pada kisaran pH 4.2, 4.6, 5.0, 5.4, 5.8 dan 6.2. Sedangkan penentuan suhu optimum dilakukan

dengan menguji aktivitas enzim pada variasi suhu 40, 50, 55, 60, 65, dan 70 ºC.

b. Penentuan pH dan Suhu Stabilitas enzim

Penentuan pH stabilitas dilakukan dengan menginkubasi enzim dalam bufer asetat (pH 4.2, 4.6, 5.0, 5.4, 5.8, dan 6.2) pada suhu optimum selama 30 menit. Setelah inkubasi berakhir, aktivitas enzim ditentukan pada kondisi pH optimum dan suhu optimum.

Penentuan suhu stabilitas dilakukan dengan menginkubasi enzim dalam bufer optimum pada variasi suhu 28, 40 dan 80 ºC. Pengambilan filtrat enzim untuk setiap suhu masing-masing dilakukan setiap hari selama 4 hari, setiap 30 menit selama 180 menit dan setiap 30 detik selama 270 detik. Aktivitas enzim ditentukan pada kondisi pH optimum dan suhu optimum.

c. Pengendapan Protein dengan Aseton

Pengendapan protein dengan aseton dilakukan pada kisaran 60 sampai 90%. Aseton dingin ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan stirer dan suhu campuran dijaga stabil antara -5 dan 0 ºC, lalu campuran dibiarkan selama 30 menit. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifus pada kecepatan 7000 rpm (suhu 4 ºC, 15 menit). Larutan didekantasi dan endapannya dilarutkan kembali ke volume semula dengan bufer asetat pH optimum. Kemudian ditentukan perolehan kembali

kadar protein dan aktivitas β-glukosidase.

d. Pengaruh EDTA dan Ion logam terhadap Aktivitas Enzim

Pengaruh EDTA dan ion logam ditentukan dengan menambahkan

masing-masing EDTA, MgCl2, ZnCl2, CuCl2, MnCl2, FeCl3, CoCl2, CaCl2, dan BaCl2 dengan

23

terdiri dari enzim, substrat p-NPG 0.3%, dan bufer asetat, selanjutnya diinkubasi

selama 1 jam pada kondisi suhu dan pH optimum.

Penentuan Bobot Molekul Enzim dengan Teknik Zimogram

Bobot molekul enzim ditentukan dengan menggunakan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrilamida Gel Electrophoresis) (Laemmi 1970). Protein standar

HMW yang digunakan terdiri dari Myosin (BM = 212.000), α-2-makroglobulin (BM =

170.000), β-galaktosidase (BM = 116.000), Transferrin (BM = 76.000), Glutamat dehidrogenase (BM = 53.000).

a. Pembuatan Gel Poliakrilamida SDS-PAGE

Komposisi untuk separating gel (8%) dibuat dengan cara mencampurkan 5.3 ml

larutan akrilamida (30% T), 9.39 ml akuades, 5 ml bufer Tris-HCl 1 M pH 8.8, 0.2 ml

SDS 10% (b/v), 10 μl TEMED, dan 200 μl amonium persulfat 10% (b/v). Larutan

diaduk hingga homogen dan siap diisikan pada plate gel, gel akan terbentuk setelah 30 - 60 menit.

Stacking gel (5%) dibuat dengan komposisi yang terdiri dari 2.5 ml larutan akrilamida (30% T), 8.5 ml akuades, 3.75 ml bufer Tris-HCl 1 M pH 6.8, 0.12 ml SDS

10% (b/v), 8 μl TEMED, dan 75 μl amonium persulfat 10% (b/v). Larutan diaduk

hingga homogen dan siap diisikan pada plate gel.

b. Preparasi Sampel Protein

Sebanyak 720 μl sampel dimasukkan dalam vial 2 ml dan ditambahkan 30 μl

bromfenolblue 0.05% (b/v), dan 250 μl bufer sampel [(larutan sampel + BPB) : bufer sampel = 3:1 ]. Bufer sampel merupakan campuran 10 ml β-merkaptoetanol, 20 ml bufer stacking gel, 20 ml gliserol, dan 4 g SDS.

Preparasi protein standar dilakukan dengan melarutkan 175 ml μg HMW marker

dalam 1000 μl akuades, dan ditambahkan Bufer sampel. Untuk mengetahui batas

pergerakan protein ditambahkan pewarna bromfenolblue dengan perbandingan sama dengan larutan sampel. Larutan selanjutnya dipanaskan dalam penangas 100 ºC selama 4 - 5 menit, kecuali untuk analisis zimogram sampel tidak dipanaskan. Larutan sampel

dan protein standar siap diinjeksikan ke dalam sumur-sumur elektroforesis. Pengisian larutan sampel dan protein standar ke dalam sumur pada gel akrilamida masing- masing

sebanyak 5 μl dengan menggunakan syringe.

c. Elektroforesis

Gel yang telah ditempatkan pada modul elektroforesis diatur sehingga permukaan gel terendam dalam bufer elektroda. Elektroforesis dilakukan dengan mengalirkan arus listrik mula-mula 15 mA untuk tiap gel. Voltase maksimum 120 volt dan daya maksimum 30 Watt. Setelah pergerakan sampel mencapai separating gel, aliran arus listrik ditingkatkan 20 mA tiap gel, sedangkan voltase dan daya konstan. Proses pemisahan dihentikan setelah 1 jam, atau setelah marker warna biru berada sekitar 0.5 cm dari batas separating gel. Gel hasil elektroforesis dilepas dari cetakan dengan menggunakan spatula, dan gel siap untuk pewarnaan protein atau analis

zimografi β-glukosidase.

d. Pewarnaan Protein

Sebelum dilakukan pewarnaan, gel terlebih dahulu direndam dalam larutan TCA 12.5% selama 24 jam dalam lemari pendingin atau direndam dalam larutan fixative (50% v/v methanol dalam air) selama 1 jam. Gel kemudian dikeluarkan dari larutan fixative dan dicuci dengan air, selanjutnya direndam dalam larutan pewarna Coomassie blue R-250 selama 4 jam. Larutan pewarna dibuat dengan melarutkan Coomassie nlue R-250 dalam metanol : asam asetat : air = 4 : 1 : 4. Kelebihan warna dihilangkan dengan larutan destaining (10% v/v metanol, 7.5% v/v asam asetat dalam air) dengan 2 - 3 kali penggantian sampai diperoleh pita-pita protein berwarna biru dengan latar belakang jernih, kemudian dibilas dengan air. Bobot molekul sampel ditentukan dengan menghitung nilai Rf dari pita-pita yang nampak, kemudian diplotkan pada kurva standar log BM terhadap Rf protein standar.

Jarak pergerakan pita dari tempat awal (cm) Jarak pergerakan pewarna dari tempat awal (cm) Rf =

25

e. Analisis Zimografi

Pita protein yang mempunyai aktivitas β-glukosidase diidentifikasi dengan

menggunakan metode Parry et al. (2001). Setelah elektroforesis selesai, gel dilepas dari

cetakan dan jarak migrasi bromofenol biru diukur dari batas atas gel pemisah. Gel untuk analisis zimografi terlebih dahulu dicuci dengan 50 mM bufer natrium asetat pH 4.0 yang mengandung 25% isopropanol selama 15 menit dan 2 kali dalam bufer yang sama tetapi tanpa mengandung isopropanol, masing-masing selama 30 menit. Gel kemudian diinkubasi dalam 0.5 mM MUG yang dilarutkan dalam 50 mM bufer natrium asetat pH 4.0 yang telah diencerkan 10 kali pada suhu 40 - 42 ºC selama 15 menit.

Adanya aktivitas β-glukosidase dapat diketahui dengan melihat metilumbelliferon yang

akan berpendar di bawah sinar UV.

Identifikasi Isolat Kapang

Identifikasi isolat kapang dilakukan oleh IPB Culture Collection di Laboratorium Mikologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB Bogor melalui pengamatan makroskopis dan mikroskopis (Lampiran 10). Media yang digunakan untuk identifikasi adalah Malt Ekstrak Agar (MEA) (Lampiran 4).

Penapisan Kapang Secara Semi Kuantitatif

Dari proses isolasi kapang yang ditumbuhkan pada medium agar Mandels (Lampiran 4) yang mengandung 0.5% Sigmasel-20 didapat 22 jenis isolat kapang (Tabel 4). Ke 22 jenis isolat kapang tersebut kemudian diuji kemampuannya untuk membentuk daerah hitam dalam medium Dubos yang mengandung 0.1% eskulin dan

0.05% Fe-NH4

Dari hasil pengamatan yang dilakukan pada hari ke 4, isolat-isolat kapang ini membentuk kisaran nisbah diameter daerah hitam terhadap diameter koloni antara 1.2 dan 2.9. Nisbah tertinggi dihasilkan oleh isolat TA 2A dan terendah oleh isolat RM 3D. Kemampuan isolat kapang membentuk daerah hitam disekitar koloni menunjukkan

bahwa kapang tersebut menghasilkan enzim β-glukosidase yang mampu memutuskan

ikatan β-1,4-glikosida pada struktur selulosa. Untuk diameter daerah hitam terbesar dihasilkan oleh isolat RM 3D, yaitu 3.15, dan terkecil oleh isolat TA 4A, yaitu 1.2. Berdasarkan hasil pengujian nisbah diameter daerah hitam terhadap diameter koloni dan diameter daerah hitam yang diperoleh, dipilih dua isolat dengan nisbah diameter daerah hitam terhadap diameter koloni yang tertinggi, yaitu TA 2A dan TA 3B, dan dua isolat dengan diameter daerah hitam yang terbesar; yaitu RM 2 dan RM 3D. Meskipun nilai nisbah diameter daerah hitam terhadap diameter koloni tinggi, namun belum tentu aktivitas enzimnya tinggi, begitu juga sebaliknya (Ardiningsih 2002). Ke 4 isolat hasil

seleksi ini kemudian diuji secara kuantitatif aktivitas enzim β-glukosidasenya. Selain ke

4 isolat hasil isolasi dari kayu yang menjadi sarang rayap tersebut, juga diamati 3 isolat kapang koleksi unggulan Balitnak, yaitu BS4, S11 dan SS240. Isolat BS4

(Eupenicillium javanicum) merupakan hasil isolasi Haryati (1997), S11 (Penicillium

nalgiovense Laxa) merupakan hasil isolasi Nurbayti (2002) dari sarang rayap,

sedangkan SS240 merupakan isolat mutan Penicillium nalgiovense S11 yang dihasilkan

Sanjaya (2003). Beberapa isolat hasil penapisan disajikan pada Gambar 6.

-sitrat pada suhu ruang dan kondisi aerob. Isolat-isolat kapang yang

mempunyai aktivitas enzim β-glukosidase akan memotong eskulin menjadi eskuletin

yang bila bereaksi dengan ion feri akan membentuk kompleks besi fenolat, yang ditandai dengan terbentuknya daerah hitam disekitar koloni.

27

Tabel 4. Hasil penapisan isolat kapang

Isolat Warna koloni Diameter (cm) Rasio

Daerah hitam Koloni

TA 2A TA 3B TA 5C LG 3C RM 6C RM 5B LG 3A TA 4B RM 1C RM 1A LG 3B TA 4A RM 5C TA 3A HJ A LG 1C TA 2B TA 1B TA 2A” RM 2 RM 2A RM 3D Hijau Hijau Putih Coklat kekuningan Abu-abu Putih Hijau keabuan Hijau keabuan Putih Hijau Coklat tua Putih kekuningan Putih Hijau keabuan Putih Merah jambu Putih Hijau keabuan Putih kekuningan Coklat Coklat kekuningan Hitam 2.00 2.03 1.84 2.30 1.83 2.33 1.80 1.33 2.20 2.00 1.80 1.20 1.30 2.10 1.90 2.60 2.50 2.07 2.70 3.14 2.93 3.15 0.70 0.80 0.73 1.00 0.80 1.03 0.80 0.60 1.00 0.95 0.90 0.60 0.68 1.10 1.00 1.40 1.40 1.20 1.80 2.41 2.30 2.55 2.9 2.5 2.5 2.3 2.3 2.3 2.2 2.2 2.2 2.1 2.0 2.0 1.9 1.9 1.9 1.9 1.8 1.7 1.5 1.3 1.3 1.2

Sebelum penyeleksian secara kuantitatif, terlebih dahulu dilakukan produksi enzim. Produksi enzim dilakukan dalam media Mandels yang disuplementasi dengan 3% polard NaOH sebagai sumber karbonnya. Selain harganya yang murah, polard mengandung serat kasar (selulosa) yang cukup tinggi (30-35%) (Hauser 1995) dan kaya akan vitamin, mineral, lemak dan protein yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikrob, khususnya dalam hal ini kapang. Dalam penelitian yang dilakukan Ginoga (2004),

enzim β-glukosidase pada kapang Penicillium nalgiovense Laxa baru terekspresikan

setelah hari ke 4 waktu inkubasi, maka untuk mengetahui waktu inkubasi optimum yang menghasilkan enzim dengan aktivitas maksimum dari ke 7 isolat kapang

tersebut, dilakukan pengamatan aktivitas FPase dan β-glukosidase pada hari ke 5, 6 dan

7. Pada Gambar 7 disajikan aktivitas FPase yang dihasilkan oleh ke 7 isolat yang diamati. Aktivitas FPase keempat isolat hasil seleksi rata-rata mengalami peningkatan

Gambar 6 . Beberapa isolat hasil isolasi.

sampai dengan hari ke 6 waktu inkubasi, namun setelah melewati waktu optimum mengalami penurunan yang tajam hingga mencapai 77.8% (TA 3B). Aktivitas FPase tertinggi dicapai oleh isolat TA 3B (23.6 U/ml), kemudian diikuti oleh isolat RM 3D (18.1 U/ml). Sedangkan aktivitas FPase ke 3 isolat koleksi Balitnak rata-rata mengalami penurunan setelah hari ke 5 waktu inkubasi. Penurunan yang tajam dialami oleh isolat S11(35.6%) pada hari ke 7 inkubasi. Isolat SS240 hanya mengalami penurunan sebesar 18.7%, sedangkan isolat BS4 mengalami penurunan aktivitas pada hari ke 6 waktu inkubasi tetapi kembali mengalami peningkatan pada hari ke 7

inkubasi. Dari pengamatan aktivitas β-glukosidase ke 7 isolat kapang (Gambar 8),

diperoleh 3 isolat yang memperlihatkan aktivitas yang menonjol yaitu BS4 (0.57 U/ml) dan RM 3D (2.76 U/ml) pada hari ke 6 waktu inkubasi, dan S11 (0.79 U/ml) pada hari

ke 7 waktu inkubasi, sedangkan 4 isolat yang lainnya menunjukkan aktivitas

β-glukosidase yang rendah, yaitu antara 0.02 dan 0.18 U/ml.

Kapang merupakan mikrob penghasil enzim selulase terbesar dibandingkan mikrob lainnya. Beragamnya nilai aktivitas enzim yang dihasilkan oleh ke 7 isolat

kapang disebabkan oleh jenis kapang yang berbeda-beda. Menurut Kim et al. (1994)

29

dan Jorgensen et al. (2003) kapang genus Trichoderma sebagian besar komponen

enzim selulasenya mengandung enzim selobiohidrolase, sedangkan enzim selulase yang

berasal dari genus Aspergillus, komponen terbesarnya adalah enzim β-glukosidase

(Kader dan Omar 1998; Juhasz etal. 2003; Purwadaria etal. 2003a).

0 5 10 15 20 25

A

k

tiv

it

a

s (

U

/m

l)

BS-4 SS-240 S-11 TA-2A RM -3D RM 2 TA-3B

Je nis Isolat

Hari 5 Hari 6 Hari 7

Gambar 7 . Kurva produksi enzim FPase isolat kapang

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

A

k

tiv

it

a

s (

U

/m

l)

BS-4 SS-240 S-11 TA-2A RM -3D RM 2 TA-3B

Je nis Isolat

Hari 5 Hari 6 Hari 7

Analisis FPase merupakan analisa enzim pada selulosa kristalin. Kristalinitas selulosa merupakan penghambat utama hidrolisis selulosa secara maksimum dan menjadi faktor yang menentukan biodegradibilitas selulosa oleh enzim selulolitik. Jadi mikroorganisme yang menghasilkan FPase yang tinggi lebih berpotensi menghidrolisis bahan pakan alami seperti dedak dan polard, yang sebagian besar mengandung selulosa

kristalin (Beldman et al. 1987; Judoamidjojo 1989). Karena mekanisme kerja FPase

dapat dihambat oleh adanya selobiosa, maka untuk mendegradasi selulosa secara menyeluruh diperlukan peranan enzim yang dapat menyempurnakan hidrolisis selobiosa sehingga menghasilkan monomer-monomer glukosa yang mudah diserap dan

dimanfaatkan oleh sel. Hasil pengukuran aktivitas FPase dan β-glukosidase pada filtrat

enzim isolat-isolat kapang menunjukkan bahwa isolat RM 3D merupakan isolat terbaik dibandingkan dengan isolat yang lainnya. Selain memiliki aktivitas FPase yang cukup tinggi pada hari ke 6 waktu inkubasi (18.1 U/ml), isolat RM 3D ternyata menunjukkan

aktivitas β-glukosidase tertinggi sejak awal pengamatan. Aktivitas β-glukosidase

RM 3D pada hari ke 5, 6 dan 7 waktu inkubasi berturut-turut 1.98 U/ml, 2.76 U/ml, dan

2.07 U/ml. Enzim β-glukosidase berperan penting dalam pengaturan seluruh proses

selulolitik dengan menghilangkan penghambat aktivitas FPase maupun CMCase yang bekerja pada selulosa amorf. Jadi selain mampu menghidrolisis bahan pakan alami, RM 3D juga mampu menyempurnakan proses hidrolisis selulosa menjadi glukosa.

Identifikasi Isolat Kapang RM 3D

Hasil identifikasi isolat kapang RM 3D yang dilakukan di IPB Culture Collection di laboratorium Mikologi IPB Bogor secara makroskopis dan mikroskopis, disimpulkan bahwa isolat yang diisolasi dari kayu yang menjadi sarang rayap tersebut

adalah Aspergillus foetidus (Naka.) Thom dan Raper (Raper dan Fennell 1963)

(Lampiran 10). Hal ini sesuai dengan hasil analisis terhadap aktivitas β-glukosidase

pada RM 3D. Pada penelitian sebelumnya, adanya aktivitas β-glukosidase yang tinggi

pada kapang genus Aspergillus juga ditemukan oleh Kader dan Omar (1998) pada

kapang-kapang hasil isolasinya. Enzim-enzim selulolitik juga berhasil diisolasi dari

kapang Penicillium nalgiovense Laxa (Nurbayti 2002), T. viride, T. reesei, T. koningi,

31

Gambar 9. Isolat kapang Aspergillus foetidus (Naka.) RM3D Thom dan Raper

Karakterisasi Enzim

Pengaruh pH Dan Suhu Terhadap Aktivitas β-glukosidase

Enzim mempunyai aktivitas maksimum pada daerah pH yang terbatas.

Pengujian aktivitas enzim β-glukosidase pada berbagai kondisi pH disajikan pada

Gambar 10. Pada Gambar 10 terlihat bahwa β-glukosidase mempunyai pH optimum

5.0, dengan aktivitas sebesar 2.13 U/ml. Diatas pH optimum, yaitu 5.2, aktivitasnya turun sebesar 61% menjadi 0.81 U/ml, sedangkan pada pH dibawah pH optimum, yaitu

4.8, β-glukosidase mempunyai aktivitas sebesar 54% atau 1.15 U/ml, dan pada pH 4.2

aktivitasnya masih 41% atau 0.886 U/ml. Nilai pH optimum ini sesuai dengan yang diajukan Landecker 1996), bahwa enzim yang berasal dari kapang umumnya mempunyai pH optimum dibawah 7, dan sebagian besar enzim umumnya mempunyai pH optimum antara 4 dan 8. Pada penelitian sebelumnya, Purwadaria menyatakan pH

optimum β-glukosidase pada Aspergillus niger NRRL 337 adalah 5.4 (2003a) dan pada

Bastawde (1992) menemukan aktivitas β-glukosidase yang maksimum pada Aspergillus

terreus adalah pH 4.8. Nurbayti (2002) menemukan Penicilliun nalgiovense Laxa

mempunyai pH optimum 5.2. Okada (1999) pada T.viride, Asada (1999) pada

Coptotermes formosanus, dan Svasti (1999) pada Dalbergia cochinchinensis Pierre

menemukan pH 5.0 sebagai pH optimum untuk aktivitas β-glukosidase.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

4.2 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.8 6.2

pH

A

k

tiv

it

a

s (

U

/m

l)

Gambar 10. Aktivitas β-glukosidase terhadap variasi pH

Peningkatan aktivitas enzim yang tajam, yaitu 46%, pada pH optimum berkaitan dengan perubahan yang terjadi pada struktur atau muatan gugus ionik enzim yang terdapat pada sisi aktif enzim. Hal ini mengakibatkan konformasi sisi aktif enzim menjadi lebih efektif dalam mengikat substrat, yang selanjutnya akan diubah menjadi produk (Whitaker 1994). Pada pH yang rendah enzim akan mengalami protonisasi sehingga kehilangan muatan negatifnya, sedangkan pada pH yang tinggi substrat akan mengalami ionisasi dan kehilangan muatan positifnya. Dengan berubahnya muatan,

maka struktur tersier atau kuarterner akan berubah, akibatnya protein β-glukosidase

akan terbuka dan kehilangan aktivitasnya (Murray et al 2003). Perubahan pH juga

dapat mempengaruhi stabilitas dan kelarutan enzim (Chaplin & Bucke 1990; Whitaker 1994).

33

Selain pH, suhu medium juga mempengaruhi aktivitas enzim. Gambar 11

menyajikan pengaruh berbagai suhu terhadap aktivitas enzim β-glukosidase, yang

ditetapkan pada pH optimum enzim. Pada Gambar 11, terlihat bahwa β-glukosidase

mempunyai suhu optimum 60 ºC, dengan aktivitas sebesar 3.56 U/ml. Pada suhu diatas

suhu optimum, aktivitas β-glukosidase menurun tajam sebesar 68%, menjadi 1.12

U/ml, bahkan pada suhu 70 ºC, aktivitasnya tinggal 13% atau 0.45 U/ml. Namun pada

suhu dibawah suhu optimum β-glukosidase relatif stabil. Pada suhu 50 ºC aktivitasnya

turun 51%, menjadi 1.74 U/ml, bahkan pada suhu 40 ºC aktivitasnya masih 27% atau 0.95 U/ml. Nilai suhu optimum pada penelitian ini sesuai dengan hasil penelitian Bastawde (1992) yang menemukan suhu 60 ºC sebagai suhu maksimum aktivitas

β-glukosidase Aspergillus terreus, sedangkan Nurbayti (2002) menemukan suhu 55 ºC

sebagai suhu optimum Penicilliun nalgiovense Laxa.

0.0 0.8 1.6 2.4 3.2 4.0

40 50 55 60 65 70

Suhu (oC)

A

k

tiv

it

a

s (

U

/m

l)

Gambar 11. Aktivitas β-glukosidase terhadap variasi suhu

Peningkatan aktivitas enzim sejalan dengan peningkatan suhu sesuai dengan yang dikemukan Landecker (1996), bahwa suhu dapat meningkatkan aktivitas enzim hingga dua kali lipat setiap kenaikan suhu 10 ºC sampai mencapai suhu optimum. Selain itu menurut Whitaker (1994), enzim umumnya lebih stabil pada suhu yang rendah. Kenaikan aktivitas enzim dibawah suhu optimum disebabkan oleh kenaikan

jumlah molekul yang bereaksi, baik dengan kenaikan energi kinetiknya, penurunan rintangan energi, maupun dengan peningkatan frekuensi benturan antar molekul. Apabila suhu dinaikkan terus, maka akhirnya akan tercapai suatu suhu dimana molekul yang bereaksi menjadi tidak stabil, bahkan kehilangan aktivitas katalitiknya. Hal ini disebabkan oleh energi kinetik enzim menjadi besar sehingga melampaui rintangan energi untuk memutuskan ikatan hidrogen dan hidrofobik pada struktur enzim. Dengan

terputusnya ikatan pada struktur sekunder dan tersier protein β-glukosidase,

mengakibatkan enzim mengalami denaturasi dengan disertai kehilangan aktivitas

katalitiknya (Whitaker 1994 ; Murray et al 2003).

Penetapan pH maupun suhu optimum mutlak dilakukan karena sangat penting sebagai prasyarat penetapan aktivitas enzim. Hal ini disebabkan karena perubahan suhu dan ataupun pH, diantaranya dapat mempengaruhi stabilitas enzim, pH buffer, ataupun afinitas enzim sebagai aktivator dan inhibitor (Whitaker 1994). Selain itu, dengan diketahuinya pH dan suhu optimum enzim akan bermanfaat dalam aplikasi mikrob selulolitik untuk mendegradasi selulosa secara maksimal dan aplikasi bioteknologi enzim.

Pengaruh pH Dan Suhu Terhadap Stabilitas β-glukosidase

Hasil pengujian pengaruh variasi pH terhadap stabilitas enzim (Gambar 12)

pada penyimpanan suhu 60 ºC selama 30 menit, menunjukkan bahwa β-glukosidase

cenderung stabil dan aktif pada pH asam. Enzim relatif stabil pada selang pH 4.2 dan 5.0, dan kenaikan nilai pH menyebabkan menurunnya aktivitas enzim. Aktivitas enzim pada pH 4.2 adalah 85% dari aktivitas maksimum, sedangkan pada nilai pH mendekati netral (6.2), aktivitas enzim tinggal 12%. Sebagai perbandingan, Nurbayti (2002)

mendapatkan bahwa β-glukosidase P. nalgiovense Laxa stabil pada pH 4.8 - 5.2.

Kestabilan enzim terhadap perubahan pH dapat dimanfaatkan dalam ransum ternak, karena pH kestabilan enzim berada pada kisaran pH organ pencernaan ayam dan itik (pH 4.5–6.9), sedangkan organ ampela dan proventrikulus mempunyai pH 2.3 – 3.4 (Sturkie 1976).

Stabilitas termal β-glukosidase yang diinkubasi pada suhu 28, 40 dan 80 ºC pada pH optimum disajikan pada Gambar 13, 14, dan 15. Pada suhu ruang (28 ºC),

35

β-glukosidase menunjukkan aktivitas yang relatif stabil selama 1 hari penyimpanan.

Pada kondisi ini terjadi peningkatan aktivitas sebesar 210%, bahkan pada hari ke 4 penyimpanan, aktivitas enzim masih lebih dari 50%. Pada penelitian sebelumnya,

Desrochers et al. (1981) menemukan waktu paruh β-glukosidase pada suhu 30 ºC dan

pH 7 adalah 72 jam (3 hari). Mengingat waktu paruh β-glukosidase yang lebih dari 4 hari, hal ini memungkinkan enzim tersebut dapat digunakan sebagai campuran pakan pada suhu ruang dengan jangka tertentu.

0 30 60 90 120 150

4.2 4.6 5 5.4 5.8 6 6.2

pH

A

k

ti

v

ita

s R

e

la

ti

f (%)

Gambar 12. Stabilitas β-glukosidase terhadap variasi pH

Hasil pengamatan pada suhu 40 ºC menunjukkan bahwa aktivitas enzim

β-glukosidase relatif stabil. Aktivitas meningkat 2 kali lipat pada inkubasi 90 menit

(202%) (Gambar 14), dan masih lebih besar dari aktivitas semula (120%) pada

inkubasi 180 menit. Pengujian aktivitas β-glukosidase terdahulu pada suhu ini

dilakukan Desrochers et al. (1981). Pada kondisi tersebut dan pH 7 β-glukosidase

mempunyai waktu paruh 24 jam, tetapi kurang dari 1 jam pada suhu 50 ºC. Kestabilan

enzim β-glukosidase pada suhu 40 ºC, menyebabkan enzim tersebut dapat

dimanfaatkan sebagai campuran dalam pakan unggas, karena unggas memiliki suhu tubuh berkisar 40 sampai 42 ºC.

0 50 100 150 200 250

0 1 2 3 4

Hari

A

k

ti

vi

tas

R

el

at

if (%)

Gambar 13. Stabilitas β-glukosidase pada suhu 28 ºC

-50 100 150 200 250

0 30 60 90 120 150 180

Waktu (me nit)

A

k

ti

v

ita

s R

e

la

ti

f (%)

Gambar 14. Stabilitas β-glukosidase pada suhu 40 ºC

. Pengukuran aktivitas β-glukosidase pada suhu 80 ºC menunjukkan bahwa enzim tersebut relatif stabil pada penyimpanan selama 30 detik (Gambar 15) dengan aktivitas sebesar 84%, namun kehilangan aktivitas lebih dari 77% setelah 60 detik, dan tidak

37

anaerob mempunyai waktu paruh selama 1.4 menit pada suhu 85 ºC dan pH 6.2

(Patchett et al. 1987). Penyimpanan pada suhu tinggi dilakukan apabila suatu enzim

akan digunakan sebagai pakan berbentuk pelet, dimana dibutuhkan waktu selama

1 - 2 menit untuk pemanasan. Tidak stabilnya enzim β-glukosidase pada suhu tinggi,

menyebabkan enzim ini tidak dapat digunakan dalam bentuk pelet, dan sebagai gantinya harus dicari alternatif lain untuk pemanfaatannya. Salah satu cara, antara lain dengan mencampurkan enzim ini ke dalam ransum pakan secara langsung, mengingat

enzim β-glukosidase masih relatif stabil pada suhu ruang selama 4 hari penyimpanan.

0 20 40 60 80 100 120

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270

Waktu (de tik)

A

k

ti

v

ita

s R

e

la

ti

f (%)

Gambar 15. Stabilitas β-glukosidase pada suhu 80 ºC

Pengaruh Penambahan Aseton Terhadap perolehan Kembali Protein Dan Aktivitas Spesifik Enzim

Penambahan ekstrak kasar enzim dengan menggunakan pelarut organik seperti aseton pada beberapa tingkat kejenuhan dilakukan untuk memekatkan enzim. Pemekatan dapat digunakan untuk proses pemurnian enzim ataupun untuk keperluan analisis anzim. Selain harganya murah, aseton tidak bereaksi dengan protein dan tidak terlalu berbahaya.

Pengendapan dengan aseton menunjukkan bahwa aktivitas spesifik tertinggi (1.08 U/g protein) terjadi setelah pengendapan pada tingkat kejenuhan 80%, dengan

Namun pengendapan dengan aseton pada tingkat kejenuhan 60 - 90% menyebabkan turunnya kadar protein bila dibandingkan dengan protein sebelum diendapkan. Meskipun perolehan kembali protein pada tingkat kejenuhan 70% memberikan hasil tertinggi, tetapi perolehan kembali aktivitas spesifiknya justru sebaliknya. Hal ini menunjukkan bahwa protein yang terendapkan tersebut sebagian besar bukan enzim

β-glukosidase, melainkan protein lain atau kontaminan yang ikut terendapkan dengan

adanya pelarut organik aseton. Penggunaan aseton dengan tingkat kejenuhan 80% juga

dilakukan oleh Ardiningsih (2002). Pengendapan ekstrak enzim kasar Bacillus pumilus

dengan aseton meningkatkan 2 kali lipat aktivitas spesifik enzim xilanase.

0 50 100 150 200 250

60% 70% 80% 90%

Konsentrasi Aseton P erol eh an K em b al i P rot ei n d an A k tivi tas S p es if ik ( %)

Protein Aktv Spes

Gambar 16. Pengaruh Aseton Terhadap β- glukosidase

Pengaruh EDTA dan Kation terhadap aktivitas β-glukosidase

Aktivitas β-glukosidase dari RM 3D dikarakterisasi lebih lanjut dengan

menggunakan senyawa-senyawa divalen : MgCl2, BaCl2, MnCl2, CaCl2, ZnCl2, FeCl3,

CoCl2, CuCl2, dan senyawa pengkhelat EDTA (Gambar 17). Penambahan 1 mM dan

5 mM masing-masing senyawa EDTA dan MnCl2 dapat meningkatkan aktivitas

β-glukosidase, sedangkan penambahan 1 mM dan 5 mM senyawa ZnCl2 dan CuCl2

menurunkan aktivitas β-glukosidase. Adanya ion Cu2+ bahkan hampir menghilangkan

39

aktivitasnya dihambat oleh adanya ion-ion Zn2+ dan Cu2+ adalah β-glukosidase yang

berasal dari Ruminococcus albus (Takano 1992). Tetapi adanya ion Zn2+ justru

meningkatkan aktivitas β-glukosidase pada Dalbergia cochinchinensis Pierre (Svasti

1999). Pengaruh penambahan 1 mM masing-masing senyawa MgCl2, BaCl2, CaCl2,

dan CoCl2 meningkatkan aktivitas β-glukosidase, sedangkan penambahan 5 mM

senyawa-senyawa tersebut menurunkan aktivitas β-glukosidase. Penambahan 1 mM

senyawa FeCl3 hampir tidak mempengaruhi aktivitas β-glukosidase (turun hanya 2%),

tetapi penambahan 5 mM senyawa tersebut meningkatkan aktivitas β-glukosidase

hingga 60 %. Sedangkan penambahan 1 mM FeCl3 pada Dalbergia cochinchinensis

Pierre justru dapat meningkatkan aktivitas β-glukosidase (4%) (Svasti 1999).

Penambahan kation-kation MgCl2, BaCl2, CaCl2, dan CoCl2

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

A

k

ti

v

ita

s R

e

la

ti

f (%)

Kont EDT A Mg Ba Mn Ca Zn Fe Co Cu

Je nis kation

1 mM 5 mM

pada Rhodotorula minuta

tidak mempengaruhi aktivitas β-glukosidase (Onishi dan Tanaka 1996).

Gambar 17. Pengaruh EDTA dan Kation terhadap aktivitas β-glukosidase.

Sebagian enzim mengandung ion logam yang terikat erat atau memerlukan ion logam untuk aktivitasnya. Ion logam dapat meningkatkan pengikatan substrat dan proses katalisis dengan membentuk beberapa jenis komplek jembatan dari enzim, logam dan substrat. Tetapi kelebihan ion logam dapat menghambat aktivitas enzim karena senyawa nukleotida di- dan trifosfat dapat membentuk kompleks yang stabil dengan kation dwivalensi, dan konsentrasi intrasel nukleotida dapat mempengaruhi

Lampiran 5. Standar Bobot molekul.

y = -0,8975x + 4,8029 R2 = 0,9639

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80

4,6 4,7 4,8 4,9 5,0 5,1 5,2 5,3 5,4

Log BM

Rf

205.000

116.000

97.000

55.000

Lampiran 6. Kurva standar nitrofenol dalam bufer asetat pada T 50º C

y = 0.053x

R2 = 0.997 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ppm )

A b s o rb a n s i ( n m )

y = 0.053x

R2 = 0.998 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ppm )

A b s o rb a n s i ( n m )

a. Bufer Asetat pH 4.2 b. Bufer Asetat pH 4.6

y = 0.051x

R2 = 0.991

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ppm )

A b s o rb a n s i ( n m )

y = 0.053x

R2 = 0.996 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ppm )

A b s o rb a n s i ( n m )

c. Bufer Asetat pH 5.0 d. Bufer Asetat pH 5.4

y = 0.045x

R2 = 0.968 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ppm )

A b s o rb a n s i ( n m )

y = 0.048x

R2 = 1.000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ppm )

A b s o rb a n s i ( n m ) e. Bufer Asetat pH 5.8 f. Bufer Asetat pH 6.2

Lampiran 7. Kurva standar nitrofenol dalam bufer asetat pada pH 5.0

y = 0.038x

R2 = 0.990 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ppm) A b sor b an si (n m)

y = 0.043x

R2 = 0.990 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ppm) A b sor b an si (n m)

a. Standar suhu 40ºC b. Standar suhu 50ºC

y = 0.039x

R2 = 0.988 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ppm) A b sor b an si (n m)

y = 0.040x

R2 = 0.992 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ppm) A b sor b an si (n m)

c. Standar suhu 55ºC d. Standar suhu 60ºC

y = 0.041x R2 = 0.996 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0 5 10 15 20 25 30

Konsentrasi (ppm) A b sor b an si (n m)

y = 0.059x

R2 = 0.992

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

0 5 10 15 20 25

Konsentrasi (ppm) A b sor b an si (n m) e. Standar suhu 65ºC f. Standar suhu 70ºC

Lampiran 8. Kurva standar glukosa untuk penentuan aktivitas FPase pada T 50º C

y = 0,0022x - 0,0193 R2

= 0,9875

0,02 0,22 0,42 0,62 0,82

0 100 200 300 400 500

Konsentrasi (ppm)

A

b

s

o

rb

a

n

s

i (

n

m

Lampiran 9. Kurva standar protein

y = 0,0009x R2

= 0,99

0,02 0,12 0,22 0,32 0,42 0,52

0 100 200 300 400 500 600 700

Konsentrasi BSA (ug/ml)

A

b

s

o

rb

a

n

s

i (

n

m

)

a. Semi makro

Lampiran10.Identifikasi isolat kapang RM 3D a. Pengamatan koloni secara makroskopik

Koloni tumbuh subur pada media agar malt, tampak merata/datar diatas permukaan, seperti beludru, dan mempunyai banyak spora. Koloni berwarna putih pada waktu muda dan berwarna coklat kehitaman atau hitam setelah tua. Koloni tidak memperlihatkan zonasi, misellium vegetatifnya berada dibawah permukaan media, berwarna agak kekuningan. Tidak berbau dan bila cawan tempat pertumbuhannya dibalik, koloni berwarna kuning terang.

b. Pengamatan koloni secara mikroskopik

Kepala konidia (conidial heads) tampak terbagi menjadi beberapa bagian yang berbeda, dengan batang-batang tampak rapat dan teratur. Saat muda konidia berbentuk ellips dan menjadi globus saat matang (tua). Misellium basalnya berwarna kuning terang.

Kesimpulan :

Dari hasil pengamatan secara makroskopik maupun mikroskopik disimpulkan bahwa isolat kapang RM 3D adalah Aspergillusfoetidus (Naka.) Thom dan Raper.

Nama sinonim dari Aspergillus foetidus (Naka.) adalah Aspergillus aureus var. brevius,

A. awamori var. ferrugineus, A. luteo-niger, A. perniciosus Inui.