BAB V PENINGKATAN KLOROFIL PLANTLET TEBU HASIL TRANSFORMASI DENGAN MENGGUNAKAN PUTRESINA
ABSTRAK
Pertumbuhan tebu hasil transformasi menunjukkan variasi kandungan klorofil berupa warna daun albino, kuning, hijau muda, hijau belang putih, dan
hijau. Pembentukkan daun yang abnormal mengindikasikan kandungan klorofil yang rendah. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk meningkatkan klorofil
tanaman tebu hasil transformasi dengan menggunakan putresina. Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap RAL secara
faktorial dengan 5 ulangan. Tiga kultivar tebu hasil transformasi yang digunakan adalah cv. Triton V1T, cv. PSJT 94-41 V2T, dan cv. PA 175 V3T sebagai
faktor pertama, yang kemudian diperlakukan dengan pemberian putresina [0 x 10
–4
M P
1
; 2,5 x 10
–4
M P
2
; 5 x 10
–4
M P
3
; 7,5 x 10
–4
M P
4
; dan 10,0 x 10
–4
M putresina M P
5
] sebagai faktor kedua. Data dianalisa dengan Duncan’s Multiple Range Test DMRT pada taraf 5 . Hasil penelitian menunjukan
pemberian putresina 3.645 x 10
–4
M dapat meningkatkan kadar klorofil 3 kultivar tebu yang diuji. Peningkatan total klorofil berkisar 28 bila dibandingkan
dengan tebu kontrol. Kata kunci: putresina, tebu, kadar klorofil.
INCREASING OF CHLOROPHYLL CONTENT OF TRANSGENIC LINES USING OF
PUTRESCINE
ABSTRACT
The growth of sugarcane transformed lines showing variation of chlorophyll content with the variaton of leaves colour such as albino, discloration, lack of
chlorophyll in the particular spot of leaves. The abnormality leaves indicate that chloprophyll content is low. The objective of this research stage was: to increase
of chlorophyll content of sugarcane transgenic line using putrescine. The study was conducted using factorial design with Randomized Completely Design, with
5 replicates. Three lines i.e: transformed line of cv. Triton V1T, transformed line of cv. PSJT 94-41 V2T as a first factor, and transformed line of cv. PA 175
V3T were treated with five levels of putrescine 0 x 10
–4
M P
1
; 2,5 x 10
–4
M P
2
; 5 x 10
–4
M P
3
; 7,5 x 10
–4
M P
4
; dan 10,0 x 10
–4
M putrescine M P
5
as a second factor. Data were analyzed by Duncan’s Multiple Range Test DMRT 5
. The result showed that 3.64 x 10
–4
M putrescine yielded a highest chlorophyll content of three lines tested, where the total chlorophyll content increased above
28 compare controll lines. Key words: putrescine, sugarcane, chlorophyll content.
PENDAHULUAN
Regeneran tebu yang ditransformasi gen fitase selama ini menghasilkan plantlet yang albino putih, kuning atau hijau muda. Demikian pula dengan
regeneran tebu yang dilakukan oleh Pesik 2005 pada tebu cv. PSJT 9443 dengan menggunakan media R4 yang menggunakan IAA 1 mgl dan Dalapon 61 mgl
dapat menginduksi pertumbuhan tunas dan daun transforman namun pertumbuhan albino masih terjadi. Ada dugaan para ahli bahwa pada daun tebu terdapat
inhibitor dalam pembentukan klorofil Alexander 1973. Inhibitor yang paling aktif adalah asam klorogenik dan asam kafeik yang merupakan zat penghambat
tumbuh endogen ZPTE. Wattimena 1988 menyatakan bahwa pembentukan ZPTE yang paling aktif terdapat pada jaringan yang berklorofil. Berdasarkan
paparan di atas, maka perlu dilakukan tindakan untuk meningkatkan kualitas dan kuantitas klorofil plantlet tebu hasil kultur jaringan. Pigmen klorofil sangat
penting bagi tanaman guna menangkap cahaya untuk fotosintesis. Klorofil merupakan molekul asimetris yang berifat hidrofilik yang tersusun dari 4 cincin
yang disebut dengan tetrapyral, dan antara cincin satu dengan lainnya terikat membentuk porpirin dengan ataom Mg sebagai inti.
Berdasarkan hasil penelitian Dewi 2003, poliamina yang diberikan ke dalam media kultur dapat meningkatkan regenerasi kalus menjadi tanaman hijau
pada antera tanaman padi. Poliamina merupakan zat pengatur tumbuh yang berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Peran poliamina pada
kultur jaringan wortel dan antera jagung adalah menginduksi embrio somatik. Metabolisme poliamina melalui lintasan arginin dekarboksilase ADC yang
dapat mempengaruhi pertumbuhan dan potensi embriogenik kalus pada kultur jaringan padi.
Poliamina yang biasanya terdapat dalam tumbuhan adalah diamin- putresina, triamin-spermidina dan tetramin-spermina. Selanjutnya Dewi 2003
menyatakan bahwa jenis poliamina seperti putresina, spermina dan spermidina mampu meningkatkan kalus dan regenerasi kultur anther, namun putresina lebih
efisien dibanding spermidina dan spermina. Pemberian 10
-3
M putresina pada media induksi kalus dan regenersi akan meningkatkan androgenesis pada antera
padi sub spesies indica. Purwoko et al. 2000 melaporkan bahwa penambahan putresina 10
-3
M pada media induksi kalus dan regenerasi yang digunakan dalam kultur antera padi memberikan hasil induksi kalus dan regenerasi yang lebih baik.
Hal sejalan juga dilakukan oleh Hanarida et al. 2002 yang menginduksi pembentukan kalus dan melakukan regenerasi kultur antera pada silangan padi
tipe baru. Santos et al. 1996 menyatakan poliamina berperan dalam morfogenesis polen jagung secara in vitro, yang akan meningkatkan pertumbuhan
dan perkembangan mikrospora serta regenerasi tanaman. Menurut Setijorini et al. 2001, poliamina mampu mencegah degradasi klorofil dan sebagai senyawa
kompetitor dalam biosintesis etilen. Sintesis poliamina akan mampu menekan sintesis etilen karena adanya persaingan dalam pemakain substrat yang sama
yaitu: S-adenosilmetionin SAM. Poliamina juga menghambat aktivitas enzim 1- aminosiklopropana-1-asam karboksilat ACC sintase yang mengkatalisis
perubahan SAM ke ACC dan enzim ACC oksidase yang mengkatalisis konversi ACC ke etilen.
Berdasarkan latar belakang yang dikemukakan tersebut, maka sangatlah penting untuk dapat meningkatkan kadar klorofil plantlet tanaman tebu dengan
pemberian putresina. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk meningkatkan klorofil tanaman tebu hasil transformasi dengan menggunakan putresina.
BAHAN DAN METODE
Tebu transgenik yang digunakan sebagai bahan penelitian merupakan hasil sub kultur dari T
1
yang sama klon no. 15 untuk cv. Triton V1T
15
; klon no. 11 cv. PSJT 9441 V2T
11
; dan klon no. 27 untuk cv. PA 175 V3T
27
. Masing- masing T
1
tersebut disubkulturkan dan menghasilkan 20-40 plantlet per botol. Plantlet tebu transgenik dipilih yang memiliki penampilan seragam untuk masing-
masing kultivar. Plantlet tersebut kemudian dipisahkan dan ditanam dalam media sesuai dengan perlakuan. Media yang digunakan adalah media pertunasan MS
cair + 1 mg l
-1
BAP + 0.1 mg l
-1
kinetin dengan variasi penambahan putresina. Ruang kultur diatur dengan cahaya 2000 lux dan suhu 20
o
C. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap
RAL secara faktorial. Faktor pertama adalah transgenik dari 3 kultivar tebu V
yaitu: cv. Triton V1T; cv. PSJT 9441 V2T; dan cv. PA 175 V3T. Faktor ke-2
adalah variasi penambahan putresina P1 yang terdiri dari 5 taraf: 0 x 10
–4
M putresina P
1
; 2,5 x 10
–4
M putresina P
2
; 5 x 10
–4
M putresina P
3
; 7,5 x 10
– 4
M putresina P
4
; dan 10,0 x 10
–4
M putresina P
5
. Perlakuan diulang 5 kali. Data dianalisis dengan sidik ragam dan
dilanjutkan dengan DMRT pada taraf 5 , sejauh yang dapat dilakukan analisis Statistika. Data lainnya dianalisis dengan melakukan banding sederhana serta
perhitungan secara persentase. Peubah yang diamati adalah: klorofil a, klorofil b,
dan total klorofil pada plantlet tebu transgenik usia 4 minggu. Analisis kandungan klorofil dilakukan berdasarkan metode Wintermans,
and De Mots 1965 yang dapat dilihat pada Lampiran 3. Hasil spektrofotometri pada
λ 665 dan 649 nm yang didapat dikonversikan dengan rumus: Klorofil a = 13,7 x
λ665 – 5,76 x λ649 = µg klorofil ml
-1
Klorofil b = 25,8 x λ649 – 7,60 x λ665 = µg klorofil ml
-1
Total klorofil = klorofil a + klorofil b.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Selama ini kalus yang ditransformasi dan kemudian diregenerasikan, cenderung untuk menghasilkan plantlet albino, kuning, atau hijau muda. Diduga
penyebabnya adalah karena penggunaan bahan kimia yang berlebihan dalam proses transformasi misal: betadine yang terlalu berlebihan dalam proses
mematikan Agrobacterium, sehingga kalusnya mengalami stress. Menurut Riva et al. 1999 transformasi secara langsung dapat menyebabkan trauma pada sel,
dan rendahnya kemampuan diferensiasi sel yang disebabkan oleh variasi jumlah kopi transgen yang masuk ke dalam genom.
Setelah dilakukan modifikasi, maka dapat diperoleh plantlet-plantlet hijau dari kalus hasil transformasi, walau dengan persentase yang tidak terlalu tinggi.
Plantlet-plantlet hijau yang didapat dari penelitian ini merupakan hasil seleksi dari variasi-variasi warna plantlet secara morfologi mulai dari albino, kuning, hijau
muda, hijau, hingga variegata. Karena keterbatasan materi, maka plantlet hijau normal sebagai bahan percobaan hanya digunakan untuk tebu cv. PSJT 94-41 dan
PA 175, sedangkan untuk tebu cv. Triton digunakan plantlet berwarna hijau muda.
Pengaruh pemberian putresina terhadap pembentukan klorofil plantlet tebu transgenik dapat dilihat pada Tabel 15-18 dan Gambar 26-32. Data
penelitian memperlihatkan tidak terdapat interaksi antara konsentrasi putresina dengan kultivar tebu yang telah ditransformasi. Data pada Tabel 15 menunjukkan
tidak ada pengaruh tebu transgenik dan interaksi antara pemberian beberapa konsentrasi putresina dengan tebu transgenik terhadap klorofil a, namun secara
tunggal konsentrasi putresina berpengaruh nyata terhadap peubah tersebut. Ada
hubungan kuadratik antara konsentrasi putresina dengan klorofil a. Gambar 26 menunjukkan pemberian putresina 3,64 x 10
–4
M merupakan konsentrasi yang terbaik untuk menghasilkan klorofil a. Semakin tinggi putresina yang diberikan,
maka semakin tinggi klorofil a yang ditemukan pada plantlet tebu sampai dengan batas tertentu, kemudian klorofil a akan semakin menurun kadarnya bila
pemberian putresina melebihi 3,64 x 10
–4
M.
Tabel 15 Rata-rata pengaruh putresina terhadap klorofil a plantlet tebu
. transgenik usia 4 minggu setelah tanam.
cv.
Triton V1T
15
cv.
PSJT 94-41 V2T
26
cv.
PA 175 V3T
27
Rataan putresina
Klorofil a
µg klorofil ml
-1
0.00 x 10
–4
M putresina
0.272 0.377
0.364 0.338 b
2.50 x 10
–4
M putresina
0.333 0.491
0.427 0.417 a
5.00 x 10
–4
M putresina
0.339 0.482
0.456 0.426 a
7.50 x 10
–4
M putresina 0.321
0.486 0.487 0.431
a 10.0x 10
–4
M putresina 0.307
0.469 0.460 0.412
a
Rataan kultivar
0.314 B 0.461 A
0.439 A Linear
tn tn
tn Kuadratik
tn tn
tn
Keterangan: Angka-angka pada kolom yang sama diikuti dengan huruf kecil yang sama, dan baris yang sama diikuti dengan huruf besar yang sama,
masing-masing tidak berbeda nyata menurut DMRT pada taraf nyata 5
Gambar 26 Grafik pengaruh putresina terhadap klorofil a plantlet .
tebu ..
transgenik usia 4 minggu setelah tanam.
y= 0.255 + 0.102x – 0.014 x
2
R
2
= 0.945 x max = 3.64; y max = 0.44
0 2.5 5 7.5 10 Konsentrasi putresina x 10
–4
M cv. Triton
cv. PSJT 94-41 cv. PA 175
0.7 0.6
0.5 0.4
0.3 0.2
0.1 Klorofil a
µ g ml
-1
Data pada Tabel 16 menunjukkan tidak ada pengaruh tebu transgenik dan interaksi antara pemberian beberapa konsentrasi putresina dengan tebu transgenik
terhadap klorofil b. Secara tunggal, pemberian putresina
7.50 x 10
–4
M menghasilkan kadar klorofil b tertinggi. Klorofil b terendah terdapat pada perlakuan
tanpa pemberian putresina.
Tabel 16 Rata-rata pengaruh putresina terhadap klorofil b plantlet tebu .
transgenik usia 4 minggu setelah tanam.
cv.
Triton V1T
15
cv.
PSJT 94-41 V2T
26
cv.
PA 175 V3T
27
Rataan putresina
Klorofil b
µg klorofil
-1
0.00 x 10
–4
M putresina 0.330 0.284 0.253
0.289 c
2.50 x 10
–4
M putresina 0.345 0.339 0.294
0.326 bc
5.00 x 10
–4
M putresina 0.397 0.367 0.313
0.359 ab
7.50 x 10
–4
M putresina 0.357
0.406 0.349
0.370 a 10.0x 10
–4
M putresina 0.355
0.397 0.341
0.365 ab
Rataan kultivar 0.357
0.359 0.310
Linear tn tn
tn tn
Kuadratik tn tn tn
tn
Keterangan: Angka-angka pada kolom yang sama diikuti dengan huruf kecil yang sama, dan baris yang sama diikuti dengan huruf besar yang sama,
masing-masing tidak berbeda nyata menurut DMRT pada taraf nyata 5
Klorofil a dan klorofil b berkorelasi positif terhadap peningkatan total klorofil tanaman tebu transgenik. Peningkatan klorofil tersebut secara kasat mata
tidak terlalu berbeda, tetapi setelah dilakukan analisis klorofil tampak perbedaannya. Penampilan plantlet tebu transgenik dalam media MS yang diberi
konsentrasi putresina berbeda dapat dilihat pada Gambar 27. Data pada Tabel 17 menunjukkan tidak ada pengaruh tebu transgenik dan
interaksi antara pemberian beberapa konsentrasi putresina dengan tebu transgenik terhadap total klorofil. Secara tunggal pemberian putresina
2.50 - 10 x 10
–4
M mampu meningkatkan total klorofil bila dibandingkan tanpa pemberian putresina.
Tabel 17 Rata-rata pengaruh putresina terhadap total klorofil plantlet tebu transgenik usia 4 minggu setelah tanam.
cv.
Triton V1T
15
cv.
PSJT 94-41 V2T
26
cv.
PA 175 V3T
27
Rataan putresina
Total klorofil
µg klorofilml
0.00 x 10
–4
M putresina 0.601 0.660 0.617
0.626 b
2.50 x 10
–4
M putresina 0.678 0.830 0.721
0.743 a
5.00 x 10
–4
M putresina 0.735 0.849 0.770
0.785 a
7.50 x 10
–4
M putresina 0.678 0.891 0.836
0.802 a
10.0x 10
–4
M putresina 0.662 0.866 0.735
0.754 a
Rataan kultivar 0.671 B
0.819 A 0.736 AB
Linear tn tn tn
tn Kuadratik
tn tn tn tn
Keterangan: angka-angka pada kolom yang sama diikuti dengan huruf kecil yang sama, dan baris yang sama diikuti dengan huruf besar yang sama,
masing-masing tidak berbeda nyata menurut DMRT pada taraf nyata 5
Secara tunggal, respon tebu transgenik cv. PSJT 94-41 terhadap pemberian putresina adalah yang terbaik untuk peubah total klorofil, tapi tidak berbeda nyata
dengan dan cv. PA 175.
Gambar 27 Penampilan plantlet tebu transgenik dalam media MS yang diberi
. konsentrasi putresina berbeda usia 4 minggu setelah tanam.
Keterangan: V1T = cv. tebu Triton transgenik V2T = cv. PSJT 9441 transgenik
V3T = cv. PA 175 transgenik P
1
= 0.0 x 10
–4
M putresina kontrol P
2
= 2.5 x 10
–4
M putresina P
3
= 5.0 x 10
–4
M putresina P
4
= 7.5 x 10
–4
M putresina P
5
= 10.0 x 10
–4
M putresina
P
1
V1T P
2
V1T P
3
V1T P
4
V1T P
5
V1T
P
1
V2T P
2
V2T P
3
V2T P
4
V2T P
5
V2T
P
1
V3T P
2
V3T P
3
V3T P
4
V3T P
5
V3T
Hubungan antara total klorofil dengan klorofil a serta klorofil b pada tebu transgenik yang ditanam pada media yang diberi putresina dapat dilihat pada
Gambar 28-29. Total klorofil didapat dengan menjumlahkan klorofil a dan klorofil b.
Gambar 28 Hubungan antara total klorofil dengan klorofil a pada
.
tebu transgenik yang ditanam pada media yang diberi putresina usia 4
minggu setelah tanam.
Berdasarkan persamaan pada Gambar 28, saat kadar klorofil a mencapai 0,66 µg klorofil ml
-1
, akan memberikan kontribusi yang optimum terhadap total klorofil mencapai 0,9 µg klorofil ml
-1
. Demikian juga pada Gambar 29, saat kadar klorofil b mencapai 0,59 µg klorofil ml
-1
, akan memberikan kontribusi yang optimum terhadap total klorofil mencapai 0,9 µg klorofil ml
-1
. Klorofil a µg ml
-1
Total k lo
rofi l
µ g
ml
-1
Gambar 29 Hubungan antara total klorofil dengan klorofil b pada
.
tebu transgenik yang ditanam pada media yang diberi putresina usia 4 minggu
setelah tanam.
Gambaran diatas menunjukkan bahwa putresin berpengaruh positif terhadap pembentukan klorofil pada masing-masing plantlet transgenik tebu. Tebu
transgenik cv. Triton memiliki total klorofil, klorofil a yang paling rendah, sedangkan klorofil b-nya paling tinggi. Kondisi sebaliknya terjadi pada tebu
transgenik cv. PA 175 dan cv. PSJT 94-41. Hasil penelitian menunjukan pemberian putresina dapat meningkatkan kadar klorofil 3 kultivar tebu yang diuji.
Peningkatan total klorofil berkisar 28 bila dibandingkan dengan tebu kontrol. Menurut Flores dan Protacio 1990, terdapat banyak peranan poliamina
dalam sel tanaman. Poliamina terlibat saat tanaman mengalami stress ionik hingga pembentukkan akar, embriogenesis dan pembungaan. Poliamina
ditemukan berkonjugasi untuk penyusunan dari senyawa fenol hingga asam nukleat. Pemberian putresina dalam penelitian ini telah berhasil meningkatkan
total klorofil pada tebu transgenik. Putresina mampu mencegah degradasi klorofil dan sebagai senyawa kompetitor dalam biosintesis etilen. Sintesis poliamina akan
menekan sintesis etilen karena persaingan dalam pemakain substrat yang sama Total
k lorofil
µ g
ml
-1
Klorofil b µg ml
-1
yaitu: S-adenosilmetionin SAM Setijorini et al. 2001; Purwoko et al. 2004. Hal ini sejalan dengan pendapat Wattimena 2002 bahwa putresina dapat
menghambat senesens pada jaringan tanaman tetapi tidak mempengaruhi respirasi. Selain itu, putresina berperan dalam pembelahan sel embriogenesis pada kultur in
vitro, inisiasi akar, pembentukan tunas, respon terhadap stres dan meningkatkan kompleks poliribosome dan sintesis protein pada beberapa organisme, mendorong
pembentukan klorofil dan bersinergi dengan auksin. Plantlet yang memiliki daun hijau normal memiliki penampilan lebih vigor bila dibandingkan dengan yang
albino, kuning, dan hijau muda. Hal ini dikarenakan gugus amino dari poliamina yang bermutan positif bergabung dengan gugus fosfat yang bermutan negatif di
DNA dan RNA dalam inti dan ribosom. Akibat penggabungan ini, poliamin meningkatkan transkripsi DNA dan translasi DNA.
SIMPULAN
1 Pemberian putresina berpengaruh terhadap total klorofil, klorofil a, klorofil b,
pada tebu transgenik. Pemberian putresina 7.50 x 10
–4
M putresina pada penelitian ini merupakan konsentrasi yang terbaik untuk menghasilkan total
klorofil tetapi tidak berbeda nyata dengan pemberian 2,5 dan 10 x 10
–4
M putresina. Pembentukan klorofil a yang optimum adalah 6,4 x 10
–4
M putresina, untuk pembentukan klorofil b yang terbaik adalah pemberian 7.00 x
10
–4
M putresina. 2
Konsentrasi putresina yang optimum untuk meningkatkan klorofil plantlet semua kultivar tebu hasil transformasi cv. Triton, cv.PSJT 9441; dan
cv. PA 175 adalah 3.64 x 10
–4
M.
BAB VI EKSPRESI GEN FITASE PADA BEBERAPA KULTIVAR TEBU HASIL TRANSFORMASI
Kategori